Enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie calcique des neurones du noyau suprachiasmatique

L’objectif général de l’expérience suivante est d’examiner l’interaction entre les changements de tension ou de courant, tels que les changements d’action, la fréquence de décharge potentielle et la concentration intracellulaire de calcium dans les neurones du noyau supra-matique. Ceci est réalisé en préparant la tranche de cerveau pour l’enregistrement des neurones du noyau SMA à l’aide d’une micro-électrode remplie de la sonde sensible au calcium. Dans un deuxième temps, la micro-électrode est scellée avec la membrane neuronale.

Ensuite, la membrane neuronale scellée avec la micro-électrode est rompue pour introduire la sonde fluorescente calcique dans les neurones individuels et pour enregistrer avec la membrane les résultats de l’activité électrique sont obtenus qui montrent des mesures de tension ou de courant et des images de la fluorescence de la sonde calcique à deux longueurs d’onde L’altération du rapport de fluorescence à ces longueurs d’onde reflète le changement de calcium intracellulaire dans le neurone. Une analyse ultérieure peut être effectuée pour déterminer la concentration en calcium de la cellule. Le principal avantage de cette technique est que les changements dans l’activité électrique membranaire et le calcium intracellulaire produit par l’activation synaptique peuvent être mesurés simultanément dans les neurones individuels du noyau supra-cosmétique.

La démonstration de cette technique sera faite par mon collègue, le Dr Robert Irwin. Commencez cette procédure en plaçant le cerveau du rat sur un papier filtre circulaire imbibé d’une solution de tranchage sur une boîte de Pétri en verre, reposant sur de la glace, coupez la couronne cérébrale uniquement pour enlever le cervelet et le tronc cérébral, et coupez des parties des côtés droit et gauche du cortex, laissant un bloc de cerveau contenant l’hypothalamus et préservant soigneusement la face ventrale du cerveau contenant les nerfs optiques SCN et le chiasma optique. Après cela, étalez une fine couche de colle acrylique Sano, assez grande pour fixer le cerveau et les blocs dans une chambre de tranchage de microtome glacée.

Transférez le bloc de cerveau glacé côté vers le bas sur la colle avec le côté contenant le SCN positionné pour la coupe en premier et les nerfs optiques formant un V pointant vers le haut, placez les blocs aros sur trois autres côtés. Remplissez ensuite la chambre avec un tampon de tranchage glacé et faites bouillir continuellement avec du carbogène. La colle acrylique Sano se solidifie avec l’humidité et maintient le cerveau et les blocs en place.

Coupez ensuite les tranches hypothalamiques coronales contenant le SCN à une épaisseur de 220 à 250 microns. A noter que le bloc aros gauche s’est détaché lors de la découpe. Cela peut se produire si l’application de colle est insuffisante.

Ensuite, identifiez la tranche contenant le SCN. En règle générale, une tranche est choisie où le chiasma optique mesure environ deux à quatre millimètres de diamètre, apparaissant comme une bande blanche, le NSC juste dorsal apparaissant comme deux petites indentations dans le chiasma optique de chaque côté du troisième ventricule. Transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement à 36 degrés Celsius montée sur la platine d’un microscope.

La chambre est remplie d’une solution d’enregistrement à écoulement continu à raison de deux millilitres par minute. Aéré à 95 % de carbogène et préchauffé avec un chauffage en ligne. Identifiez le NSC en observant les deux noyaux translucides du NSC de chaque côté du troisième ventricule, dorsaux au chiasma optique qui apparaît comme une bande noire lorsqu’il est éclairé par la lumière transmise.

Pour préparer la microélectrode à l’enregistrement, remplissez-la avec la solution interne contenant la sonde de calcium filtrée avec un filtre à seringue de quatre millimètres via un tube de microremplissage. Placez ensuite la microélectrode dans le porte-micro-électrode. Ensuite, appliquez une petite quantité de pression positive continue sur l’électrode.

Abaissez la microélectrode dans la chambre d’enregistrement en guidant l’éclairage par lumière rouge. Placez ensuite la micro-électrode sur le SCN à l’aide d’un objectif de faible puissance. Après cela, passez le microscope à un grossissement puissant pour sélectionner une sous-région du NSC et un neurone SCN individuel.

Continuez à appliquer une légère pression positive sur la microélectrode lorsqu’elle avance sur la surface de la cellule. Une fois qu’il est à la surface, appliquez une légère pression négative pour former un joint avec une résistance de trois à 10 giga ohms. Après cela, ajustez la tension de la membrane à moins 60 millivolts.

Ensuite, appliquez une pression négative supplémentaire sur l’électrode pour rompre la membrane cellulaire afin de former le serrage du patch de cellule entière. En entrant dans le mode cellulaire entier, le soma et les dendrites du neurone SCN seront remplis par la sonde fluorescente. Mesurez la tension de la membrane en mode pince de courant ou le courant en mode pince de tension.

Pendant que les données d’image de la sonde calcique sont surveillées et stockées, les images acquises peuvent être visualisées avec un graphique de données de fluorescence de 340 nanomètres et 380 nanomètres. Au cours de l’expérience, un monochronomètre est utilisé pour obtenir les mesures quantitatives du calcium en exposant rapidement le SCN à la lumière UV. À 340 nanomètres et 380 nanomètres, la lumière d’excitation passe à travers un filtre optique UG 11 pour restreindre les longueurs d’onde harmoniques supérieures à 400 nanomètres et un miroir dichroïque DCLP de 400 nanomètres réfléchit la lumière sur le tissu.

La lumière émise passe à travers un filtre d’émission de 510 nanomètres et est capturée par la caméra. Pour analyser le résultat, sélectionnez une région d’intérêt dans l’image initiale et une région d’arrière-plan à convertir en unités d’intensité de fluorescence relative. Les données de la région d’intérêt sont visualisées en temps réel pendant l’expérience.

L’arrière-plan est utilisé ultérieurement dans l’analyse ultérieure des données. Voici une image en champ clair d’une tranche coronale de l’hypothalamus contenant le NSC et le chiasma optique. Une micro-électrode de verre remplie d’une solution interne contenant BISRA two est scellée sur un seul neurone.

Voici les réponses calciques à une série de 50 pas de tension enregistrés à partir d’un neurone SCN à tension serrée. Les courants sodiques voltage-dépendants ont été inhibés par 0,5 micromolaire TTX, et il s’agit d’une image de capture d’écran des régions somatiques et dendritiques d’intérêt correspondant aux réponses calciques. Voici des exemples de réponses calciques à un nombre variable d’échelons de tension.

Cette figure montre l’enregistrement simultané de la tension membranaire et du calcium intracellulaire. Dans un neurone SCN, l’expérience de clamp de courant a été réalisée en présence de 50 micromolaires de ritoxine. Une petite dépolarisation du potentiel membranaire a déclenché plusieurs épisodes d’action, une décharge de potentiel avec une augmentation correspondante et une chute ultérieure du calcium intracellulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des tranches de cerveau de noyau supra-cosmétique sains et d’effectuer des expériences électrophysiologiques et d’imagerie simultanées. N’oubliez pas que travailler avec la lumière ultraviolette peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’une protection oculaire appropriée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.