Name: Enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie calcique des neurones du noyau suprachiasmatique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Découvrez l'enregistrement électrophysiologique et l'imagerie calcique simultanés des neurones du noyau suprachiasmatique. Cette méthode permet d'étudier l'interaction entre l'activité électrique et la concentration intracellulaire en calcium.

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Les travaux ont été financés par une subvention de l’Institut national des sciences médicales générales (GM096972).

1. Préparation des tranches de cerveau hypothalamique
<ol>
	<li>Obtenir à l’avance l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) pour toute procédure impliquant des animaux. Les procédures sur les animaux décrites ici sont conformes aux directives de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux 2013 et ont été approuvées à l’avance par l’IACUC de l’Oregon Health & Science University.</li>
	<li>Préparez 500 ml de tampon de tranchage sans le MgCl2 et le CaCl2 (tableau 1). Faites buller la solution avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 à température ambiante puis ajoutez le MgCl2 et le CaCl2 tout en continuant d’aérer. Ajustez l’osmolarité à 300 mOsm avec du saccharose. L’osmolarité est mesurée à l’aide d’un osmomètre à pression de vapeur.</li>
	<li>Préparez 1 L du support d’enregistrement sans le MgCl2 et le CaCl2 (Tableau 2). Faites buller la solution avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 puis ajoutez le MgCl2 et le CaCl2 tout en continuant d’aérer. Ajustez le pH à 7,2-7,4 avec du NaOH (10 N) et l’osmolarité à 300 mOsm avec du saccharose. L’ajout d’un tampon HEPES est facultatif et a été utilisé pour stabiliser davantage le pH.</li>
	<li>Les solutions de tranchage et d’enregistrement peuvent être conservées au réfrigérateur pendant plusieurs jours avant d’être utilisées.</li>
	<li>Préparez de l’agarose à 3 % et versez-le dans une boîte de Pétri stérile (6 mm de profondeur) et réfrigérez.</li>
	<li>Coupez trois cubes d’agarose d’environ 6 mm x 6 mm x 6 mm.</li>
	<li>Anesthésie profondément un rat Sprague-Dawley âgé de quatre à huit semaines avec de l’isoflurane. Testez la profondeur de l’anesthésie. La profondeur de l’anesthésie est jugée appropriée lorsqu’il n’y a pas de réflexe de retrait du membre postérieur suite au pincement du coussinet plantaire. Une fois correctement anesthésié, le rat est euthanasié par décapitation rapide. </li>
	<li>Retirez rapidement le cerveau en prenant soin de couper d’abord les nerfs optiques, et placez-le dans une solution de tranchage glacée saturée de 5 % de CO2 et de 95 % d’O2 et laissez refroidir pendant 2-3 min.</li>
	<li>Coupez le cerveau. Placez le cerveau à l’aide d’une pince sur un papier filtre circulaire humidifié (avec une solution de tranchage) posé sur une boîte de Pétri en verre posée sur de la glace.</li>
	<li>Coupez le cerveau coronalement pour enlever le cervelet et le tronc cérébral restants, puis le cortex rostral et les côtés, pour laisser un bloc de cerveau contenant l’hypothalamus en préservant soigneusement le côté contenant le SCN, les nerfs optiques et le chiasma optique.</li>
	<li>Étalez une fine couche de colle cyanoacrylique suffisamment grande pour fixer les blocs de cerveau et d’agarose dans une chambre de tranchage de microtome glacée mais sèche.</li>
	<li>Transférez le bloc cérébral glacé côté caudal vers le bas sur la colle, le côté contenant le SCN étant positionné pour couper en premier, les nerfs optiques formant un « V » pointant vers le haut.</li>
	<li>Placez les blocs d’agarose sur les 3 autres côtés. Remplissez la chambre d’un tampon de tranchage glacé à bulles continues avec 5 % de CO2 et 95 % d’O2. La colle cyanoacrylique se solidifiera avec l’humidité qui maintiendra le cerveau et les blocs d’agarose en place.</li>
	<li>Coupez des tranches hypothalamiques coronales (de 220 à 250 μm d’épaisseur) contenant le NSC à l’aide du microtome à lame vibrante. Généralement, une tranche est choisie où le chiasma optique mesure environ 2 à 4 mm de diamètre, apparaissant comme une bande blanche avec SCN juste dorsal apparaissant comme deux petites « indentations » dans le chiasma optique de chaque côté du 3e ventricule (Figure 1A).</li>
	<li>Placez les tranches dans la chambre d’enregistrement (36 °C) montée sur la platine d’un microscope Leica DMLFS. La chambre est remplie d’une solution d’enregistrement à écoulement continu (2 ml/min) aérée avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 et préchauffée avec un réchauffeur en ligne.</li>
	<li>Effectuer des enregistrements de patch clamp et d’imagerie calcique dans les neurones du SCN 0,5 à 8 heures après la préparation de la tranche.</li>
</ol>
2. Enregistrement par patch clamp
<ol>
	<li>Préparez la solution de solution d’électrode (intracellulaire) dans la moitié du volume final total d’eau.</li>
	<li>Ajustez la solution à un pH de 7,3 avec du KOH (1 N).</li>
	<li>Ajouter le reste de l’eau. L’osmolarité finale de la solution doit être de l’ordre de 280-290 mOsm.</li>
	<li>Passez la solution d’électrode à travers un filtre de 0,2 μm, une aliquote (0,5 ml) dans des tubes à microfuge et conservez-la à -20 °C.</li>
	<li>Préparez la solution mère de sel hexapotassique de sonde de calcium (10 mM) en mélangeant 1 mg de sel hexapotassique de bis-fura-2 avec 99,29 μl d’eau filtrée de 0,2 μm.</li>
	<li>Aliquote dans des tubes séparés (2-5 μl chacun) et congélation (-20 °C).</li>
	<li>Décongelez une aliquote de solution interne et la sonde Ca2+ peu de temps avant utilisation. Ajouter 2 μl de la solution mère de bis-fura-2 à 400 μl de la solution interne pour une concentration finale de sonde calcique de 50 μM. Triturez brièvement pour mélanger les solutions. La concentration de la sonde calcique (10-250 μM) varie en fonction de la conception expérimentale et du système d’imagerie. Notez que le bis-fura-2 est composé de deux molécules de fura-2 liées.</li>
	<li>Tirez les électrodes patch de cellules entières, en deux étapes, jusqu’à ce qu’elles aient un diamètre de pointe extérieur d’environ 1 μm et des résistances de 7 à 10 MΩ lorsqu’elles sont remplies de la solution intracellulaire.</li>
	<li>Remplissez l’électrode avec quelques μl de la solution interne contenant la sonde calcique filtrée avec un filtre à seringue de 4 mm (0,2 μm) pour les échantillons de faible volume via un tube Microfil.</li>
	<li>Appliquez une petite quantité de pression positive sur l’électrode lorsqu’elle est guidée dans la chambre d’enregistrement sous un éclairage à lumière rouge tout en étant visionnée sur un moniteur vidéo. </li>
	<li>Placez la microélectrode sur le SCN à l’aide d’un objectif de faible puissance (4X). Le NSC est identifié comme les deux zones translucides de chaque côté du troisième ventricule et dorsale au chiasma optique (figure 1A).</li>
	<li>Basculez le microscope sur un grossissement puissant (40X ou 63X). Des sous-régions du NSC et des neurones individuels du NSC peuvent être ciblés pour l’enregistrement à un grossissement plus élevé.</li>
	<li>Appliquez une légère pression positive sur la microélectrode lorsqu’elle avance sur la surface d’un neurone.</li>
	<li>Appliquez une légère pression négative sur la microélectrode pour former un joint avec des résistances de 3 à 10 GΩ.</li>
	<li>Ajustez la tension de la membrane à -60 mV avec l’amplificateur contrôlé par un logiciel d’acquisition.</li>
	<li>Appliquez une pression négative supplémentaire sur l’électrode pour rompre la membrane cellulaire en mode cellule entière.</li>
	<li>Lors de l’entrée en mode cellule entière, le neurone, le soma et les dendrites du SCN se remplissent d’une sonde fluorescente.</li>
	<li>La tension de la membrane est mesurée en mode ampèremètre ou en mode tension-pince pendant que les données d’image de la sonde calcique sont surveillées et stockées (décrites ci-dessous). Visualisez les images acquises ainsi qu’un graphique des données de fluorescence au rapport 340 nm/380 nm pendant l’expérience.</li>
</ol>
3. Mesure du Ca2+ intracellulaire
<ol>
	<li>Les mesures quantitatives de Ca2+ sont obtenues en enregistrant une paire d’images en excitant rapidement le tissu avec de la lumière UV à 340 nm et 380 nm via un monochronomètre avec une bande passante de 10 nm et passé à travers un filtre optique UG11 pour restreindre les longueurs d’onde harmoniques supérieures à 400 nm, un DCLP dichroïque de 400 nm et la lumière émise à travers un filtre d’émission de 510±40 nm.</li>
	<li>Les images sont acquises à l’aide d’une caméra CCD refroidie, le temps d’acquisition et le binning étant ajustés pour minimiser le photoblanchiment et maximiser la vitesse d’enregistrement.</li>
	<li>Un logiciel d’imagerie quantitative est utilisé pour acquérir et afficher les images.</li>
	<li>Sélectionnez les régions d’intérêt de l’image initiale à convertir en données d’unité d’intensité de fluorescence relative (c’est-à-dire soma, dendrite, etc.). Sélectionnez également une région pour la mesure de la fluorescence de fond (Figure 1B).</li>
	<li>Les images brutes et les données optiques quantifiées sont enregistrées en permanence pendant l’expérience. Après l’expérience, les images sauvegardées sont généralement réanalysées lorsque l’on peut prendre plus de temps pour sélectionner plus précisément les régions d’intérêt à quantifier.</li>
	<li>Les données peuvent être présentées sous la forme d’une estimation de la concentration intracellulaire de calcium (Est[Ca2+]i). Le rapport (R) de la lumière émise après excitation et soustraction du bruit de fond à 340 nm divisé par 380 nm ainsi que la fluorescence maximale et minimale à 340 nm et 380 nm est utilisé pour calculer la concentration de calcium4. La soustraction d’arrière-plan et d’autres calculs sont effectués à l’aide d’un logiciel d’analyse de données.</li>
	<li>Une détermination in vitro de la fluorescence maximale et minimale de bis-fura-2 peut être effectuée en utilisant 10 mM de CaCl2 pour les conditions liées à Ca2+ et 10 mM d’EGTA pour les conditions libres de Ca2+. La constante de dissociation Ca2+, Kd de la sonde, est considérée comme étant de 370 nM pour le bis-fura-2 (Invitrogen).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les méthodes décrites ci-dessus fournissent un outil puissant pour enregistrer simultanément le lien entre l’activité électrique de la membrane neuronale et la concentration intracellulaire de calcium. La méthode présente un certain nombre d’avantages en ce sens qu’elle combine deux méthodes très bien caractérisées : l’enregistrement par patch clamp de cellules entières et la mesure du calcium intracellulaire à l’aide de colorants fluorescents. Notre approche est similaire à celles décrites par d’autres chercheurs<s...

Des modifications de l’expression des gènes sont connues pour se produire dans les neurones à la suite de la signalisation synaptique. La signalisation par le glutamate, un neurotransmetteur excitateur, peut dépolariser le potentiel de la membrane neuronale, conduisant finalement à la transcription et à la traduction des gènes1,2. L’activation des récepteurs ionotropiques par le glutamate permet aux ions calcium extracellulaires de pénétrer dans la cellule, qui jouerait un rôle essentiel en tant que second messager dans l’activation de la transcription des gènes. L’évaluation de la relation entre l’activité électrique membranaire, telle que la fréquence de décharge du potentiel d’action, et les changements de la concentration intracellulaire de calcium nécessite la combinaison de deux méthodes - le clampage de patchs de cellules entières et l’imagerie quantitative de sondes de calcium fluorescentes3-5, permettant d’étudier la relation dans des neurones individuels. La technique d’enregistrement de cellule unique permet d’enregistrer l’activité de neurones individuels dans des parties identifiables du cerveau. La technique d’enregistrement de l’ensemble de la cellule permet de contrôler la tension ou le courant de la membrane, ce qui permet de manipuler expérimentalement des courants de canaux ioniques spécifiques. L’utilisation de micropipettes remplies de sondes calciques fluorescentes permet également de s’assurer que le neurone est bien rempli de sonde calcique. Cette technique présente un avantage évident lorsque l’on travaille avec des préparations de tranches de cerveau à partir de préparations de tranches adultes, car ces neurones sont particulièrement difficiles à charger à l’aide des sondes perméables cellulaires les plus courantes et réduisent les problèmes potentiels de fluorescence de fond6-8.
La lumière est la principale façon dont les mammifères ajustent leur horloge circadienne, qui est située dans le noyau suprachiasmatique hypothalamique (SCN). L’information lumineuse transduite dans la rétine est transmise 9-11 via le tractus rétino-hypothalamique (RHT) où le glutamate est libéré dans le SCN12,13. Le glutamate ouvre les récepteurs ionotropiques NMDA et AMPA situés sur les neurones du NKS, produisant un afflux de calcium et de sodium, et initiant une cascade de signalisation intracellulaire qui conduit finalement à modifier l’expression d’une famille de gènes d’horloge14-17 et à des changements de phase de l’horloge circadienne18-20. Cependant, le calcium peut pénétrer dans les neurones soit directement par les récepteurs ionotropiques du glutamate, soit par la dépolarisation membranaire et l’activation des canaux calciques voltage-dépendants (VDCC)21. Nous avons donc développé un protocole expérimental pour étudier la relation entre la concentration de calcium intracellulaire et l’activité électrique membranaire dans les neurones du NKS, comme cela se produit lors de l’activation du potentiel d’action et de l’entrée synaptique22.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull ; H2O</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull ; 6H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull ; 2H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>D-gluconate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5&prime ;-triphosphate dipotassique sel dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&prime ;-triphosphate tris sel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (ultrapure)</td><td>Life Technologies</td><td>15510-027</td><td>Gel poré dans une boîte de Pétri stérile Couche de 6 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>Bis-fura-2, sel hexapotassique</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>Imperméabilisation de la cellule</td></tr><tr><td>Nom de l’équipement</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>Tranchage des tissus</td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylique (Roti-Coll1)</td><td>Carl Roth GmbH+Co</td><td>Art-Nr. 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de microélectrodes</td><td>Narshige International USA</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Tubes capillaires</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 g</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue</td><td>Corning</td><td>#431212</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DM LFS</td><td>Avec objectifs 4X, 40X UV et 63X UV, et caméra CCD à épifluorescence</td></tr><tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA ER</td><td>12 bit CCD</td></tr><tr><td>Fura-2 Filter</td><td>Cube Chroma</td><td>71500A</td><td>Set avec filtre UG11</td></tr><tr><td>Polychrome IV</td><td>Till Photonics GmBH</td><td></td><td>Monochronomètre</td></tr><tr><td>Lunettes de sécurité anti-ultraviolets</td> Produits <td></td><td></td><td>ultra-violets</td></tr><tr><td>EPC-9 amplificateur</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Logiciel d’imagerie</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td>Logiciel d’acquisition de données</td></tr><tr><td>Igor version 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Electrophysiologie & Ca2+ Analyse des données</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Osmomètre à pression de vapeur</td> <td>Westcor</td><td></td></tr></tbody></table>

enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie calcique des neurones du noyau suprachiasmatique

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Des méthodes d’enregistrement simultanées d’imagerie électrophysiologique et fluorescente ont été utilisées pour étudier le rôle des changements de potentiel ou de courant membranaire dans la régulation de la concentration intracellulaire de calcium. Les conditions environnementales changeantes, telles que le cycle lumière-obscurité, peuvent modifier l’activité des réseaux neuronaux et neuronaux et l’expression d’une famille de gènes de l’horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique (SCN), l’emplacement de l’horloge circadienne maîtresse dans le cerveau des mammifères. La transmission synaptique excitatrice entraîne une augmentation de la concentration postsynaptique de Ca2+ qui est censée activer les voies de signalisation qui modifient l’expression rythmique des gènes de l’horloge circadienne. Des tranches hypothalamiques contenant le NSC ont été clampées par patch à l’aide de microélectrodes remplies d’une solution interne contenant l’indicateur de calcium bis-fura-2. Après qu’un joint ait été formé entre la microélectrode et la membrane neuronale du NKS, la membrane a été rompue par une aspiration douce et la sonde de calcium s’est diffusée dans le neurone, remplissant à la fois le soma et les dendrites. Des mesures ratiométriques quantitatives de la concentration intracellulaire de calcium ont été enregistrées simultanément avec le potentiel ou le courant membranaire. En utilisant ces méthodes, il est possible d’étudier le rôle des changements de la concentration intracellulaire de calcium produite par l’activité synaptique et l’activation du potentiel d’action des neurones individuels. Dans cette présentation, nous démontrons les méthodes permettant d’enregistrer simultanément l’activité électrophysiologique avec le calcium intracellulaire à partir de neurones SCN individuels maintenus dans des coupes de cerveau.

À l'aide de tranches cérébrales hypothalamiques, nous avons simultanément enregistré les variations du calcium intracellulaire en mode tout-cellule, dans des conditions de blocage de tension et de blocage de courant. L'électrode microscopique illustrée dans la figure 1A est abaissée en position sous fort grossissement (objectifs UV 40X ou 63X) avec une faible pression positive appliquée. Après contact avec le neurone, un scellement gigaohm est formé par aspiration douce. En mode blocage de tension, après...

Les procédures sont décrites pour effectuer des enregistrements simultanés du potentiel ou du courant de la membrane et des changements de concentration intracellulaire de calcium. Les neurones du noyau suprachiasmatique sont remplis de l’indicateur de calcium bis-fura-2 à l’aide d’une électrode de patch clamp dans la configuration de patch clamp de cellule entière.

Enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie calcique des neurones du noyau suprachiasmatique

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’examiner l’interaction entre les changements de tension ou de courant, tels que les changements d’action, la fréquence de décharge potentielle et la concentration intracellulaire de calcium dans les neurones du noyau supra-matique. Ceci est réalisé en préparant la tranche de cerveau pour l’enregistrement des neurones du noyau SMA à l’aide d’une micro-électrode remplie de la sonde sensible au calcium. Dans un deuxième temps, la micro-électrode est scellée avec la membrane neuronale.Ensuite, la membrane neuronale scellée avec la micro-électrode est rompue pour introduire la sonde fluorescente calcique dans les neurones individuels et pour enregistrer avec la membrane les résultats de l’activité électrique sont obtenus qui montrent des mesures de tension ou de courant et des images de la fluorescence de la sonde calcique à deux longueurs d’onde L’altération du rapport de fluorescence à ces longueurs d’onde reflète le changement de calcium intracellulaire dans le neurone. Une analyse ultérieure peut être effectuée pour déterminer la concentration en calcium de la cellule. Le principal avantage de cette technique est que les changements dans l’activité électrique membranaire et le calcium intracellulaire produit par l’activation synaptique peuvent être mesurés simultanément dans les neurones individuels du noyau supra-cosmétique.La démonstration de cette technique sera faite par mon collègue, le Dr Robert Irwin. Commencez cette procédure en plaçant le cerveau du rat sur un papier filtre circulaire imbibé d’une solution de tranchage sur une boîte de Pétri en verre, reposant sur de la glace, coupez la couronne cérébrale uniquement pour enlever le cervelet et le tronc cérébral, et coupez des parties des côtés droit et gauche du cortex, laissant un bloc de cerveau contenant l’hypothalamus et préservant soigneusement la face ventrale du cerveau contenant les nerfs optiques SCN et le chiasma optique. Après cela, étalez une fine couche de colle acrylique Sano, assez grande pour fixer le cerveau et les blocs dans une chambre de tranchage de microtome glacée.Transférez le bloc de cerveau glacé côté vers le bas sur la colle avec le côté contenant le SCN positionné pour la coupe en premier et les nerfs optiques formant un V pointant vers le haut, placez les blocs aros sur trois autres côtés. Remplissez ensuite la chambre avec un tampon de tranchage glacé et faites bouillir continuellement avec du carbogène. La colle acrylique Sano se solidifie avec l’humidité et maintient le cerveau et les blocs en place.Coupez ensuite les tranches hypothalamiques coronales contenant le SCN à une épaisseur de 220 à 250 microns. A noter que le bloc aros gauche s’est détaché lors de la découpe. Cela peut se produire si l’application de colle est insuffisante.Ensuite, identifiez la tranche contenant le SCN. En règle générale, une tranche est choisie où le chiasma optique mesure environ deux à quatre millimètres de diamètre, apparaissant comme une bande blanche, le NSC juste dorsal apparaissant comme deux petites indentations dans le chiasma optique de chaque côté du troisième ventricule. Transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement à 36 degrés Celsius montée sur la platine d’un microscope.La chambre est remplie d’une solution d’enregistrement à écoulement continu à raison de deux millilitres par minute. Aéré à 95 % de carbogène et préchauffé avec un chauffage en ligne. Identifiez le NSC en observant les deux noyaux translucides du NSC de chaque côté du troisième ventricule, dorsaux au chiasma optique qui apparaît comme une bande noire lorsqu’il est éclairé par la lumière transmise.Pour préparer la microélectrode à l’enregistrement, remplissez-la avec la solution interne contenant la sonde de calcium filtrée avec un filtre à seringue de quatre millimètres via un tube de microremplissage. Placez ensuite la microélectrode dans le porte-micro-électrode. Ensuite, appliquez une petite quantité de pression positive continue sur l’électrode.Abaissez la microélectrode dans la chambre d’enregistrement en guidant l’éclairage par lumière rouge. Placez ensuite la micro-électrode sur le SCN à l’aide d’un objectif de faible puissance. Après cela, passez le microscope à un grossissement puissant pour sélectionner une sous-région du NSC et un neurone SCN individuel.Continuez à appliquer une légère pression positive sur la microélectrode lorsqu’elle avance sur la surface de la cellule. Une fois qu’il est à la surface, appliquez une légère pression négative pour former un joint avec une résistance de trois à 10 giga ohms. Après cela, ajustez la tension de la membrane à moins 60 millivolts.Ensuite, appliquez une pression négative supplémentaire sur l’électrode pour rompre la membrane cellulaire afin de former le serrage du patch de cellule entière. En entrant dans le mode cellulaire entier, le soma et les dendrites du neurone SCN seront remplis par la sonde fluorescente. Mesurez la tension de la membrane en mode pince de courant ou le courant en mode pince de tension.Pendant que les données d’image de la sonde calcique sont surveillées et stockées, les images acquises peuvent être visualisées avec un graphique de données de fluorescence de 340 nanomètres et 380 nanomètres. Au cours de l’expérience, un monochronomètre est utilisé pour obtenir les mesures quantitatives du calcium en exposant rapidement le SCN à la lumière UV. À 340 nanomètres et 380 nanomètres, la lumière d’excitation passe à travers un filtre optique UG 11 pour restreindre les longueurs d’onde harmoniques supérieures à 400 nanomètres et un miroir dichroïque DCLP de 400 nanomètres réfléchit la lumière sur le tissu.La lumière émise passe à travers un filtre d’émission de 510 nanomètres et est capturée par la caméra. Pour analyser le résultat, sélectionnez une région d’intérêt dans l’image initiale et une région d’arrière-plan à convertir en unités d’intensité de fluorescence relative. Les données de la région d’intérêt sont visualisées en temps réel pendant l’expérience.L’arrière-plan est utilisé ultérieurement dans l’analyse ultérieure des données. Voici une image en champ clair d’une tranche coronale de l’hypothalamus contenant le NSC et le chiasma optique. Une micro-électrode de verre remplie d’une solution interne contenant BISRA two est scellée sur un seul neurone.Voici les réponses calciques à une série de 50 pas de tension enregistrés à partir d’un neurone SCN à tension serrée. Les courants sodiques voltage-dépendants ont été inhibés par 0,5 micromolaire TTX, et il s’agit d’une image de capture d’écran des régions somatiques et dendritiques d’intérêt correspondant aux réponses calciques. Voici des exemples de réponses calciques à un nombre variable d’échelons de tension.Cette figure montre l’enregistrement simultané de la tension membranaire et du calcium intracellulaire. Dans un neurone SCN, l’expérience de clamp de courant a été réalisée en présence de 50 micromolaires de ritoxine. Une petite dépolarisation du potentiel membranaire a déclenché plusieurs épisodes d’action, une décharge de potentiel avec une augmentation correspondante et une chute ultérieure du calcium intracellulaire.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des tranches de cerveau de noyau supra-cosmétique sains et d’effectuer des expériences électrophysiologiques et d’imagerie simultanées. N’oubliez pas que travailler avec la lumière ultraviolette peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’une protection oculaire appropriée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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