Name: Eaux usées dérivées électroactifs microbiennes biofilms: croissance, lentretien et la caractérisation de base (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Apprenez à cultiver des biofilms microbiens électroactifs anodiques à partir d'eaux usées et à caractériser leurs propriétés bioélectrocatalytiques. Cette méthode permet d'étudier le transfert d'électrons extracellulaire.

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F.H. remercie le BMBF (Prix de recherche « Procédés biotechnologiques de nouvelle génération - Biotechnologie 2020+ ») et l’Association Helmholtz (Groupe des jeunes chercheurs).

Comme la procédure de sélection dans le réacteur bioélectrochimique alimenté en lots est très spécifique en raison du choix du substrat et des conditions anoxiques, il n’est pas nécessaire de travailler dans des conditions stériles pour l’exemple démontré.
1. Préparation du milieu de croissance
<ol>
	<li>Préparez une quantité appropriée de milieu de croissance à l’aide d’un tampon phosphate selon Kim et al.13 (voir tableau 1). Ici, l’acétate de sodium (10 mM) sert de substrat. Le milieu de culture utilisé dans cet article n’est qu’un exemple et, selon le but de l’expérience, ses composants peuvent varier.</li>
	<li>Ajouter 1 ml d’eaux usées primaires pour 20 ml de milieu de culture sous forme d’inoculum. L’échantillon d’eaux usées est prélevé dans une station d’épuration municipale après la filtration mécanique (voir par exemple figure 2) et peut être stocké jusqu’à trois mois jusqu’à ce qu’il soit utilisé dans un récipient fermé à 4 °C 
	(Remarque : selon l’objectif de l’expérience, le nombre initial exact de cellules peut être important et doit ensuite être déterminé. Dans l’exemple démontré, le nombre initial de cellules n’est pas important, car le biofilm atteint des conditions d’équilibre.)</li>
	<li>Rincez le milieu, y compris l’inoculum, avec de l’azote pendant au moins 30 minutes pour le désaérer, en insérant une aiguille dans le milieu et en allumant le flux d’azote. Le jet doit être suffisamment fort pour que vous puissiez observer un mélange complet du milieu. 
	(Remarque : en fonction du volume du fluide, il faut même envisager d’allonger le temps de désaération. Lors de la configuration de la désaération, le réacteur alimenté par lots (étapes 2.1-2.2))</li>
</ol>
2. Configuration du réacteur Fed-batch
<ol>
	<li>Prenez une cuve de réacteur appropriée - ici, une fiole à fond rond modifiée à 4 cols de 250 ml est utilisée. 
	(Remarque : En général, le bâtiment doit avoir au moins quatre entrées. Ceux-ci sont nécessaires pour les trois électrodes et pour l’échantillonnage/l’échange de fluides. Les volumes de gaz produits peuvent être négligés lors de l’ouverture régulière du réacteur en raison d’un échantillonnage ou d’un changement de fluide, ou bien un compteur de bulles doit être installé. Afin d’éviter une croissance phototropique indésirable, les réacteurs doivent être protégés de l’exposition directe à la lumière.)</li>
	<li>Pour la configuration à trois électrodes (voir la figure 3 et la section 3 pour plus de détails), placez l’électrode de référence (RE) (ici Ag/AgCl, sat. KCl, 0,197 V vs. SHE), l’électrode de travail (WE) et la contre-électrode (CE) dans le ballon à travers des entrées individuelles via des bouchons en silicone – étanchéité à l’air. 
	(Remarque : Comme les tiges de graphite WE et CE sont utilisées. Le fil des électrodes est tiré à travers la prise en silicone et fixé à l’extérieur. L’électrode de référence est insérée dans le bouchon de silicium par un trou percé. Pour éviter les courts-circuits, assurez-vous qu’il n’y a pas de contact physique entre les électrodes, même lors de l’agitation ou de la recirculation du fluide. Placez les électrodes de manière à ce qu’elles soient complètement recouvertes d’une solution moyenne. Pour l’étanchéité, enveloppez le bouchon en silicone de chaque entrée avec du Parafilm.)</li>
	<li>Versez le milieu de croissance, y compris l’inoculum (ici 250 ml) à travers l’orifice d’échantillonnage dans le réacteur tout en rinçant à l’azote.</li>
	<li>Fermez la dernière entrée à l’aide d’un bouchon en silicone et fermez-la hermétiquement. Remarque : Les traces d’oxygène n’endommageront pas les biofilms des espèces mélangées. Ils sont capables de résister et même de consommer de faibles niveaux d’oxygène, ce qui peut à son tour diminuer l’EC.</li>
</ol>
3. Croissance chronoampérométrique du biofilm
<ol>
	<li>Connectez les électrodes aux câbles respectifs du potentiostat. Placez le récipient dans une chambre à température contrôlée, ici 35 °C est utilisé31, afin d’assurer des conditions environnementales constantes.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel pour contrôler le potentiostat et choisissez la technique : Chronoampérométrie. Réglez les paramètres par exemple comme suit : Un potentiel constant EWE de 0,2 V (vs. Ag/AgCl) pour une durée t de 500 h (≈ 20 jours). Le courant est enregistré en pas de temps dti toutes les minutes. 
	Remarque : Le choix du potentiel appliqué dépend du système/micro-organisme étudié. Généralement, les processus d’anode sont étudiés à potentiel positif et les processus de cathode à potentiel négatif. On peut également déduire un potentiel approprié à partir des potentiels standard du donneur/accepteur d’électrons et du potentiel formel du site de transfert d’électrons microbien attendu, ici comme point de départ, veuillez vous référer à la littérature récente.</li>
	<li>Démarrez la chronoampérométrie. Un graphique du courant mesuré au fil du temps est tracé par le logiciel, le courant maximal observé (imax) est un paramètre en ligne important, comme discuté dans les sections 4 et 5. </li>
</ol>
4. Maintenance du biofilm
<ol>
	<li>En fonction des conditions environnementales, par exemple la température, un courant oxydatif commence à circuler et atteint un plateau (voir figure 4). Après avoir atteint à nouveau un courant nul, interrompez la mesure chronoampérométrique et remplissez la solution de fluide. Pour une croissance plus rapide du biofilm, remplacez le milieu juste après que le plateau du courant maximum est atteint. Ouvrez l’orifice d’échantillonnage et déchargez le milieu avec précaution, sans détruire le mince biofilm. Tout en remplissant le fluide, rincez à nouveau avec de l’azote. Fermez l’orifice d’échantillonnage et fermez-le hermétiquement.</li>
	<li>Répétez la procédure de l’étape 4.1 jusqu’à ce que le courant d’oxydation maximal atteigne un état d’équilibre (voir Figure 4). 
	(Remarque : On pense qu’une constante imax indique une formation de biofilm stable à l’état d’équilibre.)</li>
	<li>Prélever des échantillons de 1 ml des solutions fraîches et des solutions de milieu échangé pour l’analyse du substrat, par exemple par HPLC. La concentration initiale du substrat (acétate) (c0) ainsi que la concentration de la solution de substrat restante (c1) sont ensuite nécessaires pour les calculs d’efficacité (voir section Analyse des données). 
	Remarque : Pour obtenir des résultats inaltérés, par exemple en raison d’une consommation supplémentaire de substrat, analysez immédiatement les échantillons de substrat. Si cela n’est pas possible, conservez les échantillons dans un congélateur à une température minimale de -18 °C pendant au plus un mois.)</li>
</ol>
5. Application de la voltampérométrie cyclique à l’étude de l’EET
<ol>
	<li>Effectuer la voltampérométrie cyclique aux maxima et minima du flux de courant comme indiqué (Figure 4). En fonction de la question d’intérêt, la CV est généralement effectuée lorsque le système a atteint l’état d’équilibre pour obtenir des résultats comparables. (Remarque : la génération de courant est appelée conditions de renouvellement et liée à l’oxydation microbienne du substrat et au transfert d’électrons ultérieur : bioélectrocatalyse microbienne ; tandis que les CV sans renouvellement sont effectués à un flux de courant (presque) nul dans l’AC.)</li>
	<li>Choisissez dans le logiciel de contrôle du potentiostat la technique : Voltampérométrie cyclique, et réglez les paramètres appropriés, ici par exemple : Un potentiel initial de l’EWE à Ei de -0,5 V vs. RE avec une vitesse de balayage v=dE/dt de 1 mV/s à un potentiel de sommet E1 de 0,3 V vs. RE et de retour au potentiel de départ E2 = Ei de -0,5 V. 
Remarque : Lors de l’utilisation de la voltampérométrie cyclique, la tension appliquée au niveau de l’unité d’action est modifiée linéairement avec le temps par le potentiostat (voir figure 5) - L’encadré 2 fournit les règles de principe pour le choix des paramètres de l’expérience et le dépannage).</li>
	<li>Démarrez la voltammométrie cyclique et enregistrez autant de cycles que nécessaire pour effectuer un CV reproductible. Habituellement, au moins 3 cycles sont nécessaires. Le graphique résultant est appelé voltammographie cyclique (voir aussi la figure 7). Remarque : En fonction des conditions de mesure, différentes informations peuvent être obtenues, comme le montre la section suivante.</li>
</ol>
6. Traçage des données
Ici, seul le tracé des données est abordé. Un traité plus détaillé suit dans la section suivante. 
<ol>
	<li>Utilisez un logiciel d’analyse de données approprié, ici toutes les données sont exportées sous forme de texte et importées sous forme de fichier ASCII.</li>
	<li>Calculer et utiliser préférentiellement les densités de courant (j) et non les courants absolus (i). 
	(Remarque : Cependant, comme il existe différents protocoles pour calculer j, indiquez clairement lequel a été utilisé. Ici, la densité de courant par géomètre, c’est-à-dire projetée, la surface de l’électrode est utilisée.)</li>
	<li>Chronoampérométrie : Tracez la densité de courant mesurée en fonction du temps.</li>
	<li>Voltampérométrie cyclique : Tracer la densité de courant mesurée en fonction du potentiel du WE Ewe.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole présenté montre un moyen simple et direct de cultiver des biofilms microbiens électroactifs à partir d’inoculation d’eaux usées à l’aide d’une configuration à trois électrodes dans un réacteur alimenté par lots. La chronoampérométrie permet la croissance et la sélection de biofilms microbiens électroactifs à partir de divers inoculums, ainsi que la caractérisation fondamentale des biofilms en termes de densité de courant maximale et d’efficacité coulombienne. La voltampérométrie cyclique, étant une technique non invasive, permet de réaliser des études fondamentales sur la thermodynamique EET du biofilm microbien et ainsi d’identifier des sites de transfert EET possibles et réels. Ensemble, ces paramètres permettent i) de caractériser et de comparer différents biofilms microbiens dans des conditions identiques ainsi que d’étudier l’impact de différentes conditions de fonctionnement sur des biofilms microbiens électroactifs identiques. Cependant, ces expériences ne peuvent être qu’un point de départ. D’une part, le domaine multiforme de la bioélectrochimie microbienne nécessite une exploitation plus poussée et approfondie des méthodes et protocoles électrochimiques. Il s’agit, par exemple, de modèles permettant d’extraire des données cinétiques et mécanistes, ainsi que d’autres méthodes telles que la spectroscopie d’impédance électrochimique34,35. D’autre part, les méthodes électrochimiques ne peuvent fournir aucune information sur la nature moléculaire, la composition microbienne, l’organisation microbienne spatiale, etc. Dans ce cas, d’autres techniques, soit non invasives et couplées à l’électrochimie, soit invasives, sont nécessaires4. L’encadré 2 fournit une brève discussion sur les étapes critiques de la réalisation des expériences ainsi que sur le dépannage initial.

Du point de vue de l’ingénierie, il faut tenir compte du fait que l’anode du biofilm électroactif n’est qu’un composant des systèmes bioélectrochimiques microbiens actuels, et qu’une multitude d’autres facteurs doivent être analysés pour les systèmes complets36. Cependant, nous espérons que cet article vidéo aidera à comprendre et à adapter les éléments centraux de la BES, c’est-à-dire les électrodes microbiennes, à l’avenir.

L’élucidation des principes fondamentaux du transfert d’électrons extracellulaires microbiens (EET) et de son exploitation dans les systèmes d’ingénierie est un domaine de recherche et développement vital et en croissance rapide1-3. L’étude de ces micro-organismes électroactifs (ou bioélectrocatalytiques ou électrochimiquement actifs), y compris les souches pures ainsi que les co-cultures définies et les consortiums complexes, nécessite un arsenal complexe de techniques, de méthodes et de protocoles4. Ces méthodes découlent de diverses disciplines scientifiques, par exemple l’électrochimie, la science des matériaux, la microbiologie, et fournissent des informations à différents niveaux hiérarchiques, par ex. de l’ensemble du biofilm microbien aux molécules uniques. Ainsi, l’électrochimie et les méthodes électrochimiques représentent le fondement de toutes les activités.
Traditionnellement, les configurations de type pile à combustible étaient souvent utilisées pour la croissance et la maintenance de cultures microbiennes électroactives dans l’archétype de ces systèmes modifiés : les piles à combustible microbiennes (MFC)5. Malheureusement, ces types de MFC ne permettaient souvent pas de surveiller ou même de contrôler le potentiel d’une seule électrode et, par conséquent, seules des informations limitées sur les processus d’électrode étaient possibles - seule la tension de la cellule était signalée. Aujourd’hui, il est de plus en plus reconnu que la surveillance et le contrôle individuels des potentiels des électrodes simples dans les MFC représentent un avantage évident, non seulement pour la recherche fondamentale, mais aussi pour l’ingénierie. De plus, avec la diversification des applications des technologies électrochimiques microbiennes qui incluent aujourd’hui, par exemple, l’assainissement, le dessalement, les synthèses et même la bio-informatique, dans les systèmes bioélectrochimiques microbiens (BES)2,6,7, un contrôle externe des potentiels d’électrodes individuelles est souvent substantiel. Ce contrôle est généralement réalisé à l’aide de sources d’alimentation externes ou de potentiostats. Ainsi, l’utilisation de potentiostats permet, contrairement à d’autres types de configurations, un réglage précis du potentiel de chaque électrode. Ceci est d’une grande importance car l’électrode représente l’accepteur d’électrons microbien terminal (pour les anodes) ou le donneur d’électrons (pour les cathodes) du transfert d’électrons extracellulaire. La figure 1 illustre l’état actuel des connaissances sur l’EET microbien aux anodes - voir pour plus de détails, par exemple 2, 4, 6, 8, 9 L’EET à la cathode est encore principalement inexploitée10.
Ainsi, le contrôle du potentiel de l’électrode permet non seulement l’utilisation de conditions de culture microbienne reproductibles, mais aussi son adaptation en termes de thermodynamique EET11. Dans cet article, nous démontrons comment les paramètres caractéristiques des biofilms microbiens électroactifs peuvent être extraits d’expériences de réacteurs alimentés en batch à l’aide de la chronoampérométrie (CA) et de la voltampérométrie cyclique (CV). Cela inclut les paramètres de performance, la densité de courant maximale (jmax) et l’efficacité coulombienne (CE) ainsi que les caractéristiques EET. Ici, l’identification des potentiels formels (Ef) des sites de transfert d’électrons possibles et réels sera mise en évidence. L’extraction de ces paramètres est illustrée par l’exemple des biofilms de culture mixte dérivés des eaux usées qui sont dominés par la spécification Geobacter. 12 Ces biofilms dérivés des eaux usées sont obtenus par une simple procédure de sélection électrochimique, comme l’ont démontré de nombreux groupes de recherche dans le monde13-16.
Techniques électrochimiques dynamiques pour étudier le transfert d’électrons extracellulaires microbiens
Pour une caractérisation thermodynamique de l’EET des cultures microbiennes électroactives, des techniques électrochimiques dynamiques sont nécessaires. En général, ces techniques comprennent le contrôle du potentiel, c’est-à-dire voltammétrique, et le contrôle du courant, c’est-à-dire le contrôle du courant. Galvanodynamique, Techniques17. Ainsi, les techniques contrôlées potentielles sont plus répandues et comprennent par exemple la voltampérométrie à ondes carrées et la voltampérométrie à balayage linéaire18. La plus populaire, cependant, est la voltampérométrie cyclique (CV)19,20. CV est bien connu et répandu dans différents domaines de l’électrochimie, allant de la recherche sur les batteries à la bioélectrochimie enzymatique en passant par la science des matériaux21. Son application aux cellules microbiennes vivantes ne peut être datée que de plus d’une décennie22 et augmente considérablement au cours des dernières années23,24. En particulier, la combinaison des méthodes CV et spectroscopiques a fourni des informations sans précédent sur les mécanismes de l’EET et sa nature moléculaire, par exemple25,26 En parallèle, le cadre théorique pour l’extraction des caractéristiques thermodynamiques et théoriques de l’EET microbien a été élargi et approfondi27-30. En revanche, une mauvaise manipulation expérimentale ou une analyse inadéquate des données entravent souvent l’application appropriée de la CV dans le domaine de la bioélectrochimie microbienne. Par conséquent, en plus des ateliers (par exemple à l’EU-ISMET 2012) et des tutoriels19, cet article vidéo fournira un guide de base pour la réalisation d’expériences voltampérométriques cycliques sur des bactéries électroactives. Il se concentre donc sur les étapes expérimentales de base et l’analyse fondamentale des données et n’a pas pour but de fournir les derniers protocoles d’analyse cinétique. Les terminus les plus importants pour la discussion suivante sont résumés dans l’encadré 1 (adapté de Harnisch et Freguia19 et modifié).

<table><tbody><tr><td>Eaux usées primaires</td><td>Station d’épuration</td><td></td> des eaux usées <td>Prise après filtration mécanique</td></tr><tr><td>250 ml Fioles à fond rond avec trois entrées supplémentaires</td><td>Th.Geyer Berlin GmbH, Allemagne</td><td>9.011 845</td><td>Des entrées supplémentaires ont été fixées par notre propre souffleur de verre</td></tr><tr><td>Électrode de référence Ag/AgCl (sat. KCl, 0,195 V vs. SHE) avec membrane en céramique</td><td>Sensortechnik Meinsberg, Allemagne</td><td>SE 11</td><td></td></tr><tr><td>Tiges en graphite (&Oslash ;=1 cm, l=3 et 5 cm)</td><td>CP-Handels-GmbH, Wachtberg, Allemagne</td><td></td><td>Utilisé comme matériau d’électrode</td></tr><tr><td>Acier inoxydable, n° 1.4301, Fil Fe/Cr18/Ni10</td><td>Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Allemagne</td><td>155-923-05</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons en silicone</td><td>Th.Geyer Berlin GmbH, Allemagne</td><td>9.230 512 et</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>neoLab, Heidelberg, Allemagne</td><td>3-1011</td><td>Pour l’étanchéité afin de maintenir des conditions anaérobies</td></tr><tr><td>Modèle Potentiostat/ Galvanostat MPG2</td><td>BioLogic Science Instruments, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EC-Lab</td><td>BioLogic Science Instruments, France</td><td></td><td>Logiciel pour la réalisation de mesures électrochimiques</td></tr><tr><td>Origin 8.6</td><td>Logiciel d’analyse de données</td> <td>OriginLab</td><td></td></tr></tbody></table>

eaux usées dérivées électroactifs microbiennes biofilms: croissance, l&#39;entretien et la caractérisation de base

Waste Water Derived Electroactive Microbial Biofilms: Growth, Maintenance, and Basic Characterization

La croissance de biofilms microbiens électroactifs anodiques à partir d’inoculums d’eaux usées dans un réacteur à commande extensive est démontrée à l’aide d’une configuration à trois électrodes contrôlée par un potentiostat. Ainsi, l’utilisation de potentiostats permet un réglage précis du potentiel de l’électrode et garantit des conditions de culture microbienne reproductibles. Pendant la croissance, la production actuelle est surveillée à l’aide de la chronoampérométrie (CA). Sur la base de ces données, la densité de courant maximale (jmax) et l’efficacité coulombienne (CE) sont discutées comme mesures pour la caractérisation de la performance bioélectrocatalytique. La voltampérométrie cyclique (CV), une méthode non destructive, c’est-à-dire non invasive, est utilisée pour étudier le transfert d’électrons extracellulaire (EET) des bactéries électroactives. Les mesures CV sont effectuées sur des électrodes de biofilm anodique en présence du substrat microbien, i.e. et en l’absence du substrat, c’est-à-dire des conditions de non-retournement, en utilisant différentes vitesses de balayage. Par la suite, l’analyse des données est illustrée et les paramètres thermodynamiques fondamentaux de l’EET microbien sont dérivés et expliqués : potentiel de crête (Ep), densité de courant de crête (jp), potentiel formel (Ef) et séparation des pics (ΔEp). De plus, les limites de la méthode et l’analyse des données de pointe sont abordées. Ainsi, cet article vidéo fournira un guide pour les étapes expérimentales de base et l’analyse fondamentale des données.

La croissance chronoampérométrique de biofilms microbiens électroactifs anodiques dans un réacteur à commande commandée utilisant une configuration à trois électrodes, contrôlée par un potentiostat, est démontrée. Le transfert d’électrons extracellulaire est caractérisé par voltampérométrie cyclique en présence du donneur d’électrons et en l’absence du donneur d’électrons. L’analyse fondamentale des données est démontrée.

Eaux usées dérivées électroactifs microbiennes biofilms: croissance, l&#39;entretien et la caractérisation de base

The growth of anodic electroactive microbial biofilms from waste water inocula in a fed-batch reactor is demonstrated using a three-electrode setup ...

L’objectif global de cette procédure est de cultiver un biofilm microbien électroactif anodique à partir d’inoculation d’eaux usées et de caractériser ses propriétés bioélectrocatalytiques. Ceci est accompli en mettant d’abord en place, en inoculant et en démarrant un réacteur discontinu alimenté par bioélectrochimie à commande statique. La deuxième étape consiste à surveiller la production actuelle à l’aide de la pyrométrie Krono.Ensuite, le milieu est échangé régulièrement après l’épuisement du substrat jusqu’à ce qu’une densité de courant maximale reproductible soit atteinte, représentant la formation d’un biofilm à l’état stationnaire. La dernière étape consiste à étudier le transfert d’électrons extracellulaires de bactéries électroactives à l’aide de la télémétrie volique cyclique pendant la présence et l’absence du substrat. En fin de compte, l’analyse des données fournit des informations fondamentales sur la thermodynamique du transfert d’électrons microbien et permet de déterminer le potentiel formel des sites de transfert d’électrons extracellulaires possibles et réels.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’obtenir un aperçu direct du transfert d’électrons entre les micro-organismes et les électrodes solides, et ainsi d’obtenir des informations fondamentales sur le transfert d’électrons extracellulaires microbiens. En général, les personnes qui ne connaissent pas la méthode auront du mal à choisir le bon paramètre et à interpréter correctement le graphique dérivé. Lors de l’acquisition et de l’analyse des données, de graves erreurs peuvent être commises.Avant de commencer cette procédure, préparez une quantité appropriée de milieu de culture à l’aide d’un tampon phosphaté, y compris d’autres nutriments selon la référence suivante. Utilisez 10 millimolaires d’acétate de sodium comme substrat. Ajouter un millilitre d’eaux usées primaires pour 20 millilitres de croissance, moyen comme inoculum.Insérez ensuite une aiguille dans le milieu et rincez-le avec de l’azote pendant au moins une demi-heure. Pour le désaérer pendant le rinçage à l’azote, mesurez la taille de l’électrode pour la configuration à trois électrodes. Insérez l’électrode de travail, la contre-électrode et l’électrode de référence dans une fiole à fond rond modifiée à quatre cols de 250 millilitres à l’aide de bouchons en silicone.Enveloppez les bouchons en silicone avec du paraform pour sceller le système pendant le rinçage à l’azote. Versez 250 millilitres du mélange de milieu de croissance et d’inoculum à travers l’orifice d’échantillonnage dans le réacteur. Fermez l’orifice d’échantillonnage à l’aide d’un bouchon en silicone et fermez-le hermétiquement avec du perfil.Placez le récipient dans une chambre à température contrôlée de 35 degrés Celsius afin d’assurer des conditions environnementales constantes. Ensuite, connectez les électrodes aux câbles respectifs de la statistique potentielle. Ouvrez le logiciel pour contrôler la statistique potentielle et choisissez la technique.Chrono pyrométrie. Réglez l’électrode de travail sur un potentiel constant de 0,2 volts pendant une durée de 500 heures, en enregistrant toutes les 600 secondes, puis démarrez la chronopyrométrie et observez le graphique du courant mesuré dans le temps. Après avoir calculé les densités de courant préférentielles, tracez la densité de courant mesurée en fonction du temps.Une fois que le courant oxydatif a atteint un plateau et est revenu à zéro, interrompez la mesure métrique de l’ampère chrono pour un échange de fluide. Par conséquent, transférez le récipient dans une boîte à flux laminaire et rincez le système avec de l’azote. Déchargez soigneusement le milieu et remplissez-le de milieu frais et désaéré après le réapprovisionnement du milieu.Fermez l’orifice d’échantillonnage et scellez-le avec du paraform. Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que le courant oxydatif maximal atteigne un état stable Après chaque cycle de croissance, prélevez un échantillon d’un millilitre des solutions de milieu frais et de milieu échangé pour l’analyse du substrat par HPLC. Pour étudier le transfert d’électrons extracellulaires, sélectionnez la technique de télémétrie cyclique dans le logiciel de contrôle des statistiques de potentiels.Réglez ensuite le potentiel initial EI de l’électrode de travail à moins 0,5 volt par rapport à l’électrode de référence, le potentiel de sommet E à 0,3 volt et le potentiel final E deux à moins 0,5 volts. Utilisez une vitesse de balayage d’un millivolt par seconde. Démarrez l’expérience et enregistrez au moins trois cycles pour obtenir un CV reproductible.Après avoir calculé les densités de courant préférentielles, tracez la densité de courant mesurée en fonction du potentiel de l’électrode de travail. À partir des mesures métriques chrono ampères, la densité de courant maximale et l’efficacité Kula peuvent être mesurées. Voici une courbe chronométrique typique de croissance d’un biofilm de plusieurs cycles de croissance à l’aide d’un réacteur discontinu alimenté.Après la phase de latence initiale, un premier maximum de densité de courant commence, puis le courant diminue jusqu’à un flux de courant presque nul en raison de l’épuisement du substrat. Après le réapprovisionnement du substrat. La densité de courant augmente à nouveau avec une densité de courant maximale plus élevée.Après plusieurs cycles de croissance, la densité maximale du courant est constante, ce qui indique la formation d’un biofilm à l’état stationnaire. Comme le maximum à l’état d’équilibre. La valeur de la densité de courant dépend de plusieurs paramètres.Il est souvent considéré comme une caractéristique des systèmes d’électrodes à biofilm microbien électroactif. La deuxième caractéristique de fonctionnement est l’efficacité omic, qui est le nombre d’électrons enregistrés sous forme de flux de courant électrique par cycle de lot alimenté par rapport au nombre maximum théorique d’électrons. Voir le protocole texte pour plus de détails sur la façon de calculer l’efficacité de l’appel, le flux de courant électrique et le nombre maximum théorique d’électrons indiqué.Voici un CV typique pour des conditions sans rotation. À une vitesse de balayage élevée, le CV d’un biofilm pour des vitesses de balayage élevées où une seule paire de pics et donc une FE potentielle formelle peuvent être identifiées est représentée. Ici. En général, le potentiel formel d’un couple redox peut être calculé à partir du potentiel de crête du pic d’oxydation EPA et du pic de réduction de l’EPC de l’espèce respective.En formant la moyenne arithmétique, voir le protocole texte pour plus de détails sur la façon de calculer le potentiel formel. En appliquant une vitesse de balayage suffisamment faible au biofilm identique, il est possible d’identifier jusqu’à quatre paires redox. Cependant, le CV sans retournement ne montre que tous les composés actifs redox à l’électrode, et donc la FE des sites possibles de transfert d’électrons extracellulaires.Seule l’analyse du CV du chiffre d’affaires fournit l’EF des sites EET réels lors de l’analyse plus approfondie des CV hors chiffre d’affaires. D’autres paramètres caractéristiques tels que la séparation des crêtes, le courant de crête maximal et la densité de courant de crête minimale peuvent être analysés. Ces paramètres, en particulier lorsqu’ils sont enregistrés pour différentes vitesses de balayage, peuvent être utilisés pour les analyses mécanistes et cinétiques des processus de transfert d’électrons au niveau des électrodes.Cependant, cette analyse cinétique bien établie pour les systèmes chimiques n’est pas simple pour les biofilms microbiens électroactifs. Lors de la mesure du CV en présence de substrat, un CV de retournement est obtenu. Après avoir tracé les données, la courbe bioélectrocatalytique typique en forme de S est observée.Lors d’une analyse plus poussée des données, le maximum de la dérivée première ou le point d’inflexion de la courbe fournit le FE potentiel formel des sites EET réels. Dans le cas d’un biofilm mince dominé par le rapport geobacter, deux points d’inflexion peuvent être observés. Par la suite, la dérivée présente deux maxima correspondant au potentiel formel des sites EET actifs bioélectrocatalytiques, qui sont respectivement dénommés EF deux et EF trois.Cette découverte montre également que les processus redox associés aux potentiels formels EF un et EF 4 ne sont pas liés à la bioélectrolyse. Au fur et à mesure que le biofilm grandit et s’épaissit, le CV ne montre qu’un seul point d’inflexion. Ce potentiel formel EEF négatif de 0,32 volts par rapport à l’argent et au chlorure d’argent est à peu près égal à la moyenne arithmétique des deux potentiels formels attribués à l’EET du biofilm mince.Ce résultat montre que l’analyse CV fondamentale fournit des informations sur la thermodynamique de l’EET de manière rapide et non invasive. Une fois maîtrisée, cette technique peut être facilement adaptée à différents systèmes d’intérêt et, en fonction des données, permet une profondeur d’analyse des données différente si elle est effectuée correctement. En suivant cette procédure et en apprenant les bases de la géométrie des biofilms microbiens, on peut facilement apprendre d’autres méthodes comme la télémétrie à ondes carrées ou la spectroscopie d’impédance électrochimique, ainsi que l’analyse approfondie des données.

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