Name: Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture dembryons sans sérum (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez une méthode de culture d'embryons de souris sans sérum et oxygénée pour étudier le développement embryonnaire. Ce système permet de maintenir la viabilité des embryons à 37°C tout en éliminant les variables externes du sérum.

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Nous tenons à remercier le Dr Julie Gordon et le Dr Nancy Manley pour leurs conseils utiles à la technique de la culture. Ce travail a été soutenu par la Fondation des enfants glaucome et Sharon Stewart Aniridie Research Trust.

Embryon de souris culture: Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en stricte conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices en suivant le protocole # A2010 07-119, qui a été examiné et approuvé par l&#39;Université de Géorgie institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité, qui assure la surveillance réglementaire continue. Une. Préparation de milieux de culture <ol><li> Préparer le milieu de culture en utilisant commercialement disponibles médias de cellules souches et les suppléments pour les montants suivants: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Supplément (1x), d&#39;albumine, de sérum bovin (2%), la pénicilline ( 50 UI / ml), streptomycine (50 ug / ml) et de l&#39;amphotéricine-B (1,25 ug / ml). Le milieu de culture préparé est similaire à celui décrit précédemment 15 avec les modifications suivantes: l&#39;addition d&#39;anti-mycotics et en utilisant le double de la concentration d&#39;antibiotiques (pour des détails sur le matériel et les réactifs spécifiques, voir Lier des matériaux). Remarque: la concentration en antibiotique utilisé précédemment (. Moore-Scott, et al 15) est suffisante pour les cultures d&#39;embryons réalisés jusqu&#39;à 24 période de temps d&#39;une heure. Toutefois, lorsque la culture a été poursuivie au-delà de 24 heures, nous avons eu contamination de la culture et cela a été contrôlé avec succès par le doublement de la concentration de l&#39;antibiotique. </li><li> Stocker les composants de médias à 4 ° C ou à -20 ° C selon les recommandations du fabricant. KSR et N-2 Complément doivent être stockés dans des aliquotes à -20 ° C pour éviter la congélation et la décongélation répétées. KnockOut DMEM une fois ouvert doit être utilisé dans les 30 jours selon les recommandations du fabricant. Avant utilisation, réchauffer les composants dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Préparez le support dans des conditions stériles. Désinfecter la surface de tout l&#39;équipement et les bouteilles contenant les composants de médias avec 70% d&#39;alcool pulvérisation avant de les placer dans la hotte de culture. </li><li> Les composants du milieu peuvent être mélangés soit dans un bêcher stérile ou directement dans le système de filtre (Corning). D&#39;abord ajouter la poudre d&#39;albumine à la KnockOut DMEM. Bien mélanger en secouant doucement jusqu&#39;à ce que le albumine se dissout complètement. Puis ajouter la N-2 Supplément, KSR et les antibiotiques et bien mélanger à l&#39;aide d&#39;une pipette. Puis filtrer stériliser le support à l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,22 um de taille de pore avec aspiration sous vide. Distribuer les médias dans 50 ml tubes coniques et magasins à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Les médias, une fois préparés doivent être utilisés dans les 4-5 jours pour la culture. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;équipement Culture <ol><li> Stériliser les flacons de culture en verre et bouchons en caoutchouc. Envelopper les flacons de culture dans une feuille d&#39;aluminium et placer les bouchons en caoutchouc dans un bêcher d&#39;eau et stériliser à l&#39;autoclave. </li><li> Stériliser la chambre de culture (Unité de précision Incubateur) avec 70% de pulvérisation d&#39;alcool et chaud à 37 ° C avant de commencer la culture. La chambre de culture est eplaisanté avec un disque de roulement au centre qui maintient les bouteilles de culture. L&#39;écoulement du gaz dans la chambre est régulée par une jauge de pression et le débit d&#39;écoulement peut être ajustée en observant la sortie de bulles d&#39;air à travers l&#39;eau dans un tube de verre à la fin. Cet appareil de culture de la bouteille de roulement est une version modifiée de l&#39;appareil d&#39;origine introduit par la Nouvelle et Cockroft 17. </li><li> Raccorder une bouteille de gaz contenant un mélange gazeux de 95% O 2/5% CO 2 dans la chambre de culture et d&#39;ajuster le débit de gaz à &quot;une bulle d&#39;air par seconde&quot; qui donne un débit de 50 cc / min d&#39;écoulement et assure un approvisionnement suffisant en oxygène pour les embryons de culture. </li></ol> 3. Embryon de souris prélèvement et la préparation de la Culture <ol><li> Pour obtenir des embryons de souris de type sauvage, nous avons utilisé des souris de C57BL/6J et CD-1 (Charles River Laboratories) souches de fond génétique. </li><li> Vérifiez la souris femelle pour bouchon vaginal tous les matins de jour. Le midi le jour de trouver èmee bouchon vaginal doit être considérée comme E 0,5 dpc (jours après le coït). </li><li> Recueillir des embryons de souris à E10.5 dpc par euthanasier les souris enceintes suivant des protocoles standard. Les souris ont été euthanasiés au moyen d&#39;un dispositif d&#39;inhalation de CO 2 comme spécifié par l&#39;American Veterinary Medical Association (AVMA) Lignes directrices pour l&#39;euthanasie des animaux (2013). Pour assurer la mort, la dislocation cervicale a été réalisée après exposition au CO 2. </li><li> Vaporiser éthanol à 70% sur la surface ventrale pour éviter le collage de cheveux abdominale pour les instruments. Ensuite, ouvrez la cavité abdominale ventrale en utilisant un arêtes franches ciseaux d&#39;exploitation et une paire de 4-3/4 à microdissecting pince pour localiser l&#39;utérus. L&#39;utilisation d&#39;un 4 en pince microdissecting soulever tout l&#39;utérus et le séparer du corps en le coupant avec des ciseaux une lumière d&#39;exploitation sur le corps de l&#39;utérus et à la pointe des cornes utérines. </li><li> Rincer rapidement tout l&#39;utérus en 1x PBS chauffé à 37 ° Cpour éliminer toute adhérence de sang à l&#39;utérus et placer immédiatement dans du DMEM réchauffé à 37 ° C dans une boîte de Pétri. Stériliser les instruments de 70% d&#39;éthanol pulvérisation avant une nouvelle utilisation. Remarque: le préchauffage de la solution, y compris le PBS, du DMEM et du milieu de culture et de les maintenir à 37 ° C pendant toute la procédure est conseillée. </li><li> Sous un microscope de dissection, l&#39;utérus doit être disséqué par segments avec une lumière ciseaux d&#39;exploitation. Il en résulte de petites ouvertures de chaque côté de l&#39;utérus segmentée à travers laquelle une paire de pinces de microdissecting modifiés (extrémités émoussées) peut être inséré en douceur à élargir l&#39;ouverture. Ceci permet à l&#39;exposition de la caduque placentaire, qui peut ensuite être éliminé par déchirement doucement avec une paire de pinces de microdissecting pour exposer le sac vitellin pariétal (PYS) avec la membrane de Reichert. Utilisation d&#39;un bord de la pince à épiler doucement percer la membrane de Reichert avec les PYS et séparée de the sous-jacente vésicule ombilicale viscérale (VYS) une couche d&#39;exposer les embryons avec VYS intactes. Le cône ectoplacentaire et les dérivés de trophoectoderm peuvent être éliminés soit par la caduque ou de placenta avec la membrane de Reichert. Des précautions doivent être prises pour éviter la rupture de la VYS que les embryons sautent immédiatement. </li><li> Les embryons avec VYS intactes doivent ensuite être transférés sur une boîte de Pétri contenant le milieu de culture chauffé à 37 ° C en utilisant une pipette de transfert en plastique. Remarque: Le transfert de milieu de culture immédiatement après la séparation de l&#39;utérus aide pour un meilleur développement de l&#39;embryon dans la culture. </li><li> Une petite ouverture doit être faite dans le sac vitellin d&#39;une paire de pincettes microdissecting en évitant les vaisseaux sanguins principaux. Une paire de pinces pointu peut être utilisé pour rendre l&#39;ouverture par perçage doucement dans une zone adjacente à la zone de tête. Vous pouvez également deux paires de pinces franches peuvent être utilisés pour maintenir le sac jaune et doucement déchirer pour faire une petite ouverture.Puis creuser doucement l&#39;ouverture par l&#39;expansion avec les pinces à la taille juste assez pour tenir la tête embryonnaire. La membrane amniotique qui est enveloppant étroitement l&#39;embryon doit être délicatement tenu loin du corps et déchiré en utilisant une paire de pinces. La tête embryonnaire et par la suite l&#39;ensemble de l&#39;embryon doit être doucement extériorisés à partir de la vésicule ombilicale, tout en maintenant l&#39;intégrité du système vasculaire embryonnaire à celle de la vésicule ombilicale 15. Remarque: Les dommages aux vaisseaux sanguins de la vésicule ombilicale peut potentiellement affecter le développement de l&#39;embryon dans la culture. Ces embryons avec vasculaire endommagé ne doivent pas être utilisés pour la culture et peuvent être utilisés pour mettre en scène les embryons qui peuvent ensuite être éliminés. </li><li> Critères d&#39;arrêt embryonnaires: Examiner les embryons au microscope de dissection et de groupe par des critères morphologiques dont le corps et la taille de la tête, des membres et de la morphologie de l&#39;œil et le stade en comptant le nombre de somites (s) pour au moins deux embryons de chaque groupe. &lt;strong&gt; Note: Habituellement embryons obtenus à partir des mêmes déchets présentent des différences dans le développement in utero et diffèrent par la taille du corps, les caractéristiques morphologiques et le nombre de somites. Cependant, nous avons constaté que les embryons groupés par nos critères morphologiques exposées habituellement au nombre de somites similaire (± 1). Pour cette raison, il n&#39;est pas nécessaire de compter somites pour chaque embryon comme ce serait retarder le moment de démarrage de la culture. Note: Ne pas utiliser les embryons qui ont été utilisés pour compter les somites de la culture. Compter les somites après le début de la culture des embryons pour les autres afin d&#39;éviter le retard dans le démarrage de la culture. Les embryons qui ont été retardés à la culture après la séparation de l&#39;utérus présentent généralement faible développement. </li><li> Transférer les embryons immédiatement à une boîte de Pétri avec la culture du milieu frais chauffé à 37 ° C et le prendre à la hotte de culture où les embryons doivent encore être transférés à une boîte de Pétri avec cultur stérilee médias avant de les mettre dans les bouteilles de culture avec du milieu pour commencer la culture. Remarque: Les transferts multiples de médias pour les embryons avant la culture aide à prévenir la contamination que les différentes étapes de collecte et de dissection embryon ont été réalisées sous un microscope à dissection qui n&#39;a pas été installé dans la hotte de culture. Remarque: Lorsque la taille de la portée est grande (&gt; 12 embryons), le processus de la moitié des embryons et de commencer la culture ou les mettre dans un plat avec un milieu de culture et le placer dans un incubateur à CO2 à 37 ° C. Lorsque les embryons ont été laissés à l&#39;extérieur pendant de longues périodes (&gt; 35-40 min), nous avons observé le rythme cardiaque ralentir et cela va affecter le développement ultérieur de la culture. </li></ol> 4. La culture embryons de souris <ol><li> Ouvrez les bouteilles de culture autoclave dans la hotte de culture et bien les étiqueter. Transfert de 3 ml de milieu de culture chauffé à 37 ° C à chacun des tes bouteilles, puis les embryons de souris devraient être transférés doucement dans les flacons de culture à l&#39;aide de pipettes de transfert en plastique stériles. Les flacons de culture doivent ensuite être coiffés avec des bouchons en caoutchouc qui aident à tenir les flacons de culture au disque de laminage dans le dispositif de culture. Remarque: Les flacons de culture avec les médias peuvent être préparés et placés sur le disque de roulement de l&#39;appareil de culture avant euthanasier les souris. Cela réduit le temps de transfert d&#39;embryons dans les flacons de culture. Remarque: Des embryons de souris peuvent être cultivées individuellement ou en tant que co-cultures avec deux ou trois embryons dans le même flacon de culture. </li><li> Les flacons de culture doivent être effectuées de manière aseptique à l&#39;appareil de culture à 37 ° C et hermétiquement les accrocher sur les trous du disque de roulement avec des bouchons en caoutchouc. Allumer le disque de roulement de tourner à une vitesse constante de 35 tours par minute (rpm), ce qui permet la flottaison libre de la embryo dans les médias et contribue également à l&#39;échange de gaz libre par le tissu embryonnaire. Le gaz de la bouteille reliée à la chambre de culture s&#39;écoule à travers le disque de roulement et les bouchons en caoutchouc dans les flacons de culture. </li><li> Culture des embryons pour 16-40 h et vérifier régulièrement pour l&#39;évacuation des gaz et de la température de la chambre de culture. Remarque: la manipulation des embryons de souris en culture: Laissez les embryons se adaptées aux conditions de culture pendant au moins 30 min. Ensuite, les embryons qui exécutent mal et montrant le rythme cardiaque faible peuvent être jetés et les embryons restants peuvent être utilisés pour des études ultérieures de manipulation. manipulations d&#39;embryons comme l&#39;électroporation 5,9,16, 18 micro-injections, perle implantation 16, traitement de la toxicomanie et d&#39;autres procédures peuvent être effectuées à cette époque. Nous avons effectué avec succès de l&#39;implantation des billes d&#39;agarose Affi-Gel traités avec certaines molécules de signalisation pour étudier leur rôle dans le développement précoce de l&#39;œil. Les embryons aprèsmanipulations peuvent être retournés dans un milieu frais et continué dans la culture. </li><li> Remplacer les milieux de culture totalement avec les médias frais à des intervalles spécifiques après 9-10 h et 18-19 h de culture lorsque la culture a été poursuivie pendant 40 heures. Remarque: Culture remplacement des médias ne peut pas être nécessaire si la culture est arrêtée par 16-18 h. </li><li> Les mesures de succès dans la culture: la survie embryonnaire dans la culture devrait être déterminée par battement de coeur visible et la circulation sanguine dans le corps alors que la croissance embryonnaire dans la culture doit être évaluée par l&#39;augmentation de la taille du corps, le nombre de somites et le développement morphologique de la tête, des membres, le cœur et les yeux. </li><li> In utero développé embryons à E11.0 dpc (~ 40-41 s) et E12.0 dpc (~ 49-50 s) devraient être utilisés comme témoins pour comparer embryons cultivés pour 16-18 h et 38-40 h, respectivement. </li><li> Le développement embryonnaire à différents moments au cours de la culture et de par étapes in utero peut être CAPTureD sous loupe binoculaire. logiciel d&#39;imagerie Spot a été utilisé pour capturer les images et plus tard transformé en utilisant un logiciel de traitement d&#39;image. </li></ol>

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Nous n&#39;avons pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

L&#39;embryon de souris de phase à mi-gestation ont été cultivées dans un milieu de culture exempt de sérum dans une atmosphère de 95% O 2/5% CO 2 dans un appareil de culture de flacon roulant à 37 ° C. le développement de l&#39;embryon ex utero dépendait essentiellement de plusieurs facteurs, à chaque étape au cours de la procédure à partir du moment de l&#39;utérus est isolé à partir des souris euthanasiées à la fin de la culture (Figure 1). Le facteur le plus important ...

Méthodes in vitro de culture en utilisant des embryons entiers sont bien adaptés à l&#39;étude des mécanismes impliqués dans l&#39;organogenèse embryonnaire qui sont difficiles d&#39;accès dans l&#39;utérus de signalisation. Embryons entiers fournissent l&#39;intégrité des tissus et de soutien appropriés pour les interactions de tissus qui sont cruciaux pour survenue en temps opportun des mécanismes essentiels de signalisation pour les différents processus cellulaires pendant l&#39;organogenèse. Tandis que les cultures d&#39;embryons entiers fournissent une plate-forme pour une multitude d&#39;applications telles que des études de transplantation, les manipulations génétiques et de tissus, des études perle d&#39;implantation, études toxicologiques, etc., Des systèmes de culture d&#39;embryons actuellement utilisés dépendent principalement de sérum pour la croissance et l&#39;entretien des embryons dans la culture de 1 à 9. Le sérum a été utilisé comme l&#39;un des principaux composants allant de 10 à 100% du milieu de culture 8.6, 10, 11.; Cependant, la composition de sérum n&#39;est pas bien défini et peut varier d&#39;un animal à chaque fois, et le sérum est recueilli. Alors que la préparation de sérum de laboratoire est consommatrice de temps et implique des procédures strictes, sérum procuré présente commercialement variabilité considérable entre les différents lots et augmente les coûts de laboratoire. Ajoutés à ceux-ci, le sérum peut contenir des facteurs inconnus tels que des facteurs de croissance, des hormones, ou d&#39;autres protéines, qui peuvent avoir une incidence sur les résultats de certaines expériences, en particulier ceux qui impliquent l&#39;étude des molécules importantes dans les interactions tissulaires de signalisation. Des études ont montré que l&#39;addition de sérum à la culture peut potentiellement modifier les niveaux intracellulaires de certaines molécules de signalisation telles que l&#39;adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et les protéines impliquées dans la signalisation mitogénique et 3 phosphoinositide (PI 3)-kinase voies de signalisation 12-14. Contrairement à ceux-ci, un système de culture sans sérum offre les avantages de l&#39;antigène libre environnement,abstinence de enzymes biologiquement actives qui peuvent altérer les processus cellulaires et permet la cohérence entre les expériences. Dans la présente étude, nous avons utilisé un milieu de culture sans sérum préparé à partir de commerce suppléments de milieux de cellules souches à toute la culture étape à mi-gestation des embryons dans une atmosphère de 95% d&#39;O 2/5% de CO 2 dans un appareil de culture de la bouteille de roulement à 37 ° C 15,16. Des embryons de souris en culture pendant 16 à 40 heures dans ces conditions définies présentaient progression dans le développement morphologique des structures du corps et les différentes embryonnaires globaux tels que le cœur, les membres, le cerveau et les yeux indiquant des niveaux appropriés de la prolifération cellulaire, la migration, la différenciation et interactions tissulaires. L&#39;analyse moléculaire du développement embryonnaire dans la culture de l&#39;un des systèmes organiques complexes tels que l&#39;œil a révélé la mise au point oculaire d&#39;être cohérent avec celui observé dans le tissu oculaire dans embryo développement in utero (Kalaskar et Lauderdale, en préparation). Ainsi, nous montrons que les embryons de souris en culture au stade mi-gestation, affichent une croissance progressive et le développement morphologique comparable à celle observée dans les embryons en développement in utero.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplément</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stock : 100x</td></tr><tr><td>Albumine, à partir de sérum bovin</td><td>Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Stock : 100 %</td></tr> <tr><td>Antibiotique - Solution antimycosique</td><td>Cellgro</td><td>30-004-CL</td><td>Stock : Pénicilline (10 000 UI/ml) ; Streptomycine (10 000 & micro ; g/ml ; L’amphotéricine (250 & micro ; g/ml)&nbsp ;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Unité d’incubation de précision</td><td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge Angleterre</td><td>Id.No. 840-374</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles en verre pour unité rotative</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone Rubber Cork</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95 % O2/5 % CO2 Cylinder</td><td>AirGas Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection Stemi SV11 Apo Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubateur à chemise d’eau</td><td>Forma Scientific</td><td>Modèle : 3110</td><td></td></tr><tr><td>Hotte de culture</td><td>Nuaire Enceintes de sécurité biologique Classe II TypeA2</td><td>Modèle : Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Fisher Scientific</td><td>IsoTemp205</td><td></td></tr><tr><td>Balance de pesée</td><td>Mettler Toledo</td><td>AG285</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux d’opération légers</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux d’opération tranchants&nbsp ;</td><td>Pince</td> de microdissection <td>Roboz RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>, 4 po</td><td>Pince</td> de microdissection <td>Roboz RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>- Hudson (cWALD), 4-3/4 po</td><td>Pince</td> à épiler de microdissection <td>Roboz RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>(5/45)</td><td>Roboz</td><td>RS-5005</td><td>Modifié - Les extrémités pointues ont été rendues émoussées</td></tr><tr><td>Pince à épiler de microdissection (5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5060</td><td>Modifié - Les extrémités pointues ont été rendues émoussées</td></tr><tr><td>Pince à épiler pour microdissection (55)</td><td>Roboz</td><td>RS-5063</td><td>Modified - Les extrémités pointues ont été rendues émoussées</td></tr><tr><td>Plateau d’instruments</td><td>Roboz</td><td>RT-1401S</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle du plateau d’instruments</td><td>Roboz</td><td>RT-1401L</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri-100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>087571Z</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri-60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri-35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Système de filtre ( 0,22 & micro ; m Acétate de cellulose)-150 ml</td> Système <td>de filtre 431153</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>(0,22 & micro ; m Acétate de cellulose)-250 ml</td> Système <td>de filtre 430756</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>(0,22 & micro ; m Acétate de cellulose)-500 ml</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>Pipette auxiliaire</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>D57849</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique-10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique jetable-25 ml</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert - 7,7 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>202-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

L&#39;embryon de souris de phase à mi-gestation ont été cultivées en utilisant un milieu de culture sans sérum disponibles dans le commerce préparé à partir de suppléments de milieux de cellules souches dans un système de culture de flacon roulant oxygéné. Des embryons de souris à E10.5 ont été soigneusement isolés à partir de l&#39;utérus intact avec le sac vitellin et dans un processus impliquant geste chirurgical précis les embryons ont été extériorisés doucement à partir de la vésicule ombilicale, tout en maintenant la continuité vasculaire de l&#39;embryon avec le sac vitellin. Par rapport aux embryons préparés avec intact sac vitellin ou avec le sac vitellin éliminée, ces embryons exposés taux de survie supérieur et la progression du développement quand elle est cultivée dans des conditions similaires. Nous montrons que ces embryons de souris, lorsqu&#39;elles sont cultivées dans un milieu défini dans une atmosphère de 95% O 2/5% CO 2 dans un appareil de culture de flacon roulant à 37 ° C pendant 16 à 40 heures, présentent une croissance et un développement comparable à morphologique les embryons en développement in utero. Nous croyons èmeest la méthode sera utile pour les enquêteurs qui ont besoin d&#39;utiliser la culture de l&#39;embryon entier pour étudier les interactions importantes dans l&#39;organogenèse embryonnaire de signalisation.

Le développement d'embryons de souris ex utero dépend de multiples facteurs de départ à partir du moment de l'utérus est isolé de l'organisme à la fois les embryons sont mis en culture. Comme représenté sur la figure 1, la procédure implique une série d'étapes comprenant la séparation de l'utérus gravide à partir du corps (figure 1A), l'isolement des embryons avec sac vitellin intact (figure 1B), l'extériorisation des embryons provenant d'une vésicule ombilical...

Sérum utilisé dans les cultures d&#39;embryons contient des composants inconnus qui peuvent affecter le résultat d&#39;expériences en particulier dans les études portant sur les interactions de signalisation. Ici nous avons utilisé un système de culture oxygéné sans sérum et montrons que les embryons mi-gestation souris en culture pour 16-40 h présentent développement morphologique comparable à des embryons en développement in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser un système de culture oxygénée sans sérum pour étudier et manipuler des aspects spécifiques du développement embryonnaire de souris. Ceci est accompli en isolant d’abord l’utérus avec des embryons de la souris mère. La deuxième étape consiste à séparer les embryons avec un sac vitellin intact de la décidue placentaire après dissection segmentaire de l’utérus.Ensuite, les embryons doivent être doucement extériorisés du sac vitellin tout en maintenant l’intégrité du système vasculaire embryonnaire. La dernière étape consiste à cultiver les embryons dans un appareil de culture en bouteille roulante oxygénée sans sérum à 37 degrés Celsius pendant une durée déterminée. En fin de compte, l’ensemble de ce système de culture d’embryons, qui soutient le développement de différentes structures aux niveaux morphologique et moléculaire, peut être utilisé pour l’étude du développement d’embryons de souris à l’aide d’une variété de techniques.Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que le rôle de différents mécanismes de signalisation dans la spécification du sulfate et la morphogenèse tissulaire dans l’embryon de mammifère en développement. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’isolement des embryons avec un sac vitellin intact et les étapes de maturation ultérieures ou, difficiles à apprendre, tout dommage au système vasculaire embryonnaire ou au système vasculaire osac peut affecter le développement de l’embryon dans la culture. Pour commencer, désinfectez toutes les surfaces de travail avec de l’alcool à 70 % et vaporisez chaque article avant de le placer dans la hotte de culture.Lorsque vous êtes prêt, préparez le milieu de culture et tous les suppléments nécessaires à la procédure Tout d’abord, ajoutez la poudre d’albumine au DMEM knock-out et mélangez soigneusement jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous. Ensuite, ajoutez le supplément de N deux, KSR, et les antibiotiques mélangez soigneusement et filtrez la stérilisation. Conservez le média dans des tubes coniques de 50 millilitres à quatre degrés Celsius jusqu’au moment de l’utilisation Avant de commencer la dissection, préchauffez les solutions nécessaires à 37 degrés Celsius et maintenez-les au chaud tout au long de leur procédure.À ce stade, les bouteilles de culture doivent également être préparées et placées dans l’appareil de culture afin de les pré-gazer et de les maintenir à 37 degrés Celsius. Cela permettra également de gagner du temps lors du transfert ultérieur des embryons. Pour commencer, placez l’animal euthanasié sur une surface de travail stérile et vaporisez de l’éthanol sur la surface abdominale ventrale.Pour éviter que les cheveux ne collent aux instruments, ouvrez la cavité abdominale pour localiser l’utérus. Soulevez l’utérus à l’aide d’une pince et utilisez des ciseaux légers pour couper le corps utérin et l’extrémité des cornes utérines. Pour le séparer rapidement, rincez tout l’utérus dans du PBS chaud pour éliminer tout sang et placez-le immédiatement dans une boîte de Pétri remplie de DMEM chaud.Stérilisez les instruments avec de l’éthanol à 70 % Avant de passer sous un microscope de dissection, disséquez segmentairement l’utérus avec des ciseaux opératoires légers pour produire de petites ouvertures de chaque côté. Insérez doucement une paire de pinces à épiler micro-dissectionnantes émoussées pour élargir l’ouverture avec les feuilles caduques placentaires exposées. Déchirez-le doucement avec une paire de pinces à épiler micro-dissectionnantes pour exposer le sac vitellin pariétal avec la membrane du riker.Utilisez un bord de la pince à épiler pour percer doucement les deux et les séparer du sac vitellin viscéral sous-jacent Pour exposer les embryons embryons. Avec des sacs viscéraux intacts, les sacs vitellins doivent être transférés immédiatement dans un milieu de culture chaud après la séparation de l’utérus. Pour aider au développement de l’embryon en culture, faites une petite ouverture dans le sac vitellin avec une pince à épiler pointue en perçant doucement une zone adjacente à la région de la tête, en prenant soin d’éviter les gros vaisseaux sanguins.Alternativement, deux paires de pinces à épiler émoussées peuvent être utilisées pour tenir le sac de jaunes et le déchirer doucement pour faire une petite ouverture. Élargissez l’ouverture avec la pince à épiler à une taille juste suffisante pour s’adapter à la tête embryonnaire. Tenez la membrane amniotique, en enveloppant doucement l’embryon loin du corps et déchirez-le avec une pince à épiler, la tête embryonnaire, et plus tard l’embryon entier doit être doucement extériorisé du sac vitellin tout en maintenant l’intégrité du système vasculaire embryonnaire.Tout dommage à la vascularisation du sac vitellin peut affecter le développement et ces embryons ne doivent pas être utilisés pour la culture. Ensuite, examinez les embryons et regroupez-les selon des critères morphologiques, notamment la taille du corps et de la tête, la morphologie des membres et des yeux. Mettez-les en scène en comptant le nombre de somites.Transférez immédiatement les embryons dans une boîte de Pétri avec un milieu de culture frais et chaud, et apportez-les à la hotte de culture où les embryons doivent à nouveau être transférés dans une boîte de Pétri. Ensuite, transportez les bouteilles de culture de manière aseptique jusqu’à l’appareil de culture. Fixez-les au disque roulant et lancez la rotation.Cela permet aux embryons de flotter librement dans le milieu et aide également à l’échange gazeux libre. Le gaz s’écoule d’une bouteille voisine dans la chambre, puis dans les bouteilles à travers la culture de liège en caoutchouc. Les embryons pendant 16 à 40 heures et vérifient régulièrement l’écoulement des gaz et la température de la chambre de culture.Les milieux de culture doivent être complètement remplacés par des milieux frais à des intervalles de temps précis. Il est préférable de laisser les embryons s’adapter aux conditions de culture pendant au moins 30 minutes avant d’effectuer toute manipulation Les embryons qui fonctionnent mal et présentent des battements cardiaques faibles peuvent être jetés, et les embryons restants qui montrent un bon rythme cardiaque peuvent être utilisés pour des études plus approfondies. Ces images démontrent que les embryons en culture se reproduisent dans le développement in utero.Environ 58 % des embryons cultivés présentent un développement comparable à celui des embryons développés in utero. Un développement intermédiaire est observé chez environ 28 % des embryons C et 14 % des embryons présentent un faible développement en culture D. Des différences de développement se produisent lorsque les embryons de souris sont des embryons co-cultivés qui semblent similaires au début de la co-culture A et B présentent des différences dans leur développement embryonnaire. Au bout de 16 heures, A et B une fois maîtrisés, cette technique peut être réalisée en 25 à 30 minutes pour une taille ultérieure de 10 à 12 embryons.Nous avons constaté que ce système de culture d’embryons est un ajout précieux à nos études envivo sur le développement embryonnaire.

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