Name: Détection optique de E. coli Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Découvrez la détection optique rapide de bactéries E. coli par biocapteurs à silicium mésoporeux. Cette méthode sans marquage utilise des anticorps monoclonaux immobilisés pour capturer les bactéries directement.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation sciences Israël (subvention n ° 1118-1108 et n ° subvention 1146-1112) et le Fonds de recherche Memorial Kroll Minna. ES reconnaît avec gratitude le soutien financier de la Berrie Nanotechnology Institute Russell.

Une. Préparation du oxydé poreux SiO 2 <ol><li> Plaquettes Etch Si (un seul côté brillant sur la &lt;100&gt; visage et fortement dopée, de type p, 0,0008 Ω · cm) dans une solution 3:1 (v / v) de solution aqueuse de HF et d&#39;éthanol absolu pendant 30 secondes à un courant constant densité de 385 mA / cm 2. S&#39;il vous plaît noter que HF est un liquide très corrosif, et il doit être manipulé avec un soin extrême. </li><li> Rincer la surface du Si poreux (PSi) film résultant avec de l&#39;éthanol absolu à plusieurs reprises; sécher les films sous un gaz d&#39;azote sec. </li><li> Oxyder les échantillons PSi fraîchement gravé dans un four tubulaire à 800 ° C pendant 1 h dans l&#39;air ambiant (placer l&#39;échantillon dans le four à la température ambiante, chauffer le four à 800 ° C, laisser dans le four pendant 1 heure, éteignez le la chaudière et retirer les échantillons du four seulement à la température ambiante). </li></ol> 2. Biofonctionnalisation de Psio 2 échafaudages <ol><li> Incuber un PSi oxydé (PSIO 2) l&#39;échantillon pendant 1 heure dans mercaptopropyl (95% (MPTS) solution de triméthoxysilane-3) (108 mM dans du toluène). </li><li> Rincer le Psio 2 échantillon traité au silane avec du toluène, le méthanol et l&#39;acétone; sec sous un gaz d&#39;azote sec. </li><li> Incuber la Psio 2 échantillon de silane modifié pendant 30 min dans 1 ml de solution 100 mM PEO-iodoacétyle biotine. </li><li> Rincer le Psio 2 Extrait biotine traités avec 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS) de solution à plusieurs reprises. </li><li> Incuber l&#39;échantillon 2 Psio biotine modifiée pendant 30 min dans 1 ml de pg / ml de streptavidine (SA) solution 100. </li><li> Rincer le SA-traité Psio 2 échantillon avec une solution 0,1 M PBS plusieurs fois. </li><li> Incuber l&#39;échantillon SA-modifié Psio 2 résultant pendant 30 min dans 1 ml de 100 pg / ml biotinylé E. Anticorps monoclonal coli (immunoglobuline G, IgG) ou avec une solution de 100 ug / ml d&#39;IgG de lapin biotinylé (comme un modèle pour un anticorps monoclonal). </li></ol> 3. Marquage fluorescent et microscopie de fluorescence <ol><li> Incuber les surfaces IgG modifiés avec 15 ug / ml de fluorescéine (FITC) marqué d&#39;anti IgG de lapin pendant 40 min et à 15 ug / ml de fluorescéine (FITC) marqué IgG anti-souris comme témoin. </li><li> Rincer les échantillons modifiés avec 0,1 M de solution PBS à plusieurs reprises. </li><li> Examiner les échantillons sous un microscope à fluorescence. </li></ol> 4. Culture de bactéries <ol><li> Cultiver E. bactéries coli K12 dans un tube de 10 ml avec 5 ml de milieu Luria Bertani (LB) (moyenne composition dans 1 litre d&#39;eau désionisée: 5 g de NaCl, 5 g d&#39;extrait de levure et 10 g de tryptone). Incuber les bactéries secouant la nuit à 37 ° C. </li><li> Surveiller la concentration des bactéries par la lecture de la densité optique (DO) à une longueur d&#39;onde de 600 nm. Après croissance pendant une nuit dans du milieu LB, lire la DO600 en utilisant un spectrophotomètre pour déterminer la concentration bactérienne. Le nombre de cellules est désastreusecte proportionnelles aux mesures (OD 600 DO 600 = 1 10 8 cellules / ml). </li></ol> 5. Les bactéries de détection <ol><li> Placez le Psio IgG-2 modifié et soigné Psio 2 (comme le contrôle) des échantillons dans une cellule d&#39;écoulement en plexiglas sur mesure. Fixer la cellule d&#39;écoulement pour s&#39;assurer que l&#39;échantillon réflectivité est mesurée au même endroit au cours de toutes les mesures. </li><li> Incuber les échantillons avec E. coli K12 suspension (10 4 cellules / ml) pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, retirer la suspension de bactéries par rinçage de la cellule avec 0,85% p / solution saline v pendant 30 min. </li><li> Surveiller les changements dans les données de réflectivité dans l&#39;ensemble de l&#39;expérience. Toutes les mesures optiques doivent être effectués dans un milieu aqueux environnant. Spectra devrait être recueilli en utilisant un spectromètre CCD et analysée par application d&#39;une transformée de Fourier rapide (FFT), comme décrit précédemment 25,26. </li><li> Confirmer la présence de la bactérie sur lasurface du biocapteur, par l&#39;observation des échantillons sous un microscope optique verticale immédiatement après l&#39;expérience de biocapteurs. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Un immunocapteur optique sans étiquette, sur la base d&#39;un Psio 2 nanostructure (un film mince de Fabry-Pérot) est fabriqué, et son application potentielle comme un biocapteur pour la détection de bactéries est confirmée. Modifications et dépannage L&#39;une des préoccupations majeures lors de la conception d&#39;un immunocapteur est la sensibilité des anticorps à subir des changements de conformation non souhaitées pendant le dépôt et la structuration...

Précoce et précise l&#39;identification des bactéries pathogènes est extrêmement important pour la sécurité alimentaire et de l&#39;eau, surveillance de l&#39;environnement, et le point-of-care diagnostic 1. Les techniques traditionnelles de microbiologie sont longues, laborieuses, et n&#39;ont pas la capacité de détecter des micro-organismes en &quot;temps réel&quot; ou à l&#39;extérieur de l&#39;environnement de laboratoire, les biocapteurs évoluent pour répondre à ces défis 2-5. Au cours des dernières années, le Si poreux (PSI) a émergé comme une plate-forme prometteuse pour la conception de capteurs et biocapteurs 6-20. Cours de la dernière décennie, de nombreuses études concernant les capteurs et biocapteurs optiques à base de PSI-ont été publiés 21,22. La couche nanostructurée PSi est typiquement fabriqué par gravure électrochimique anodique à partir d&#39;un monocristal de Si plaquette. Les nanomatériaux PSi obtenus présentent de nombreuses caractéristiques avantageuses, comme une grande surface et le volume libre, tailles de pores qui peuvent être contrôlés et accordable optipropriétés cal 10,16. Les propriétés optiques de la couche de PSi, comme photoluminescence 8,11 et lumière blanche interférométrie à base de réflectance 7,19, sont fortement influencées par les conditions environnementales. Capture d&#39;analytes voyageurs molécules / cible à l&#39;intérieur des résultats de couches poreuses à une variation de l&#39;indice de réfraction moyen de la pellicule, comme une modulation observée dans le spectre de photoluminescence ou sous forme de décalage de longueur d&#39;onde dans le spectre de réflectivité 10. Bien que la grande innovation dans la technologie des biocapteurs optiques PSi, il n&#39;y a que peu de rapports sur les plates-formes à base de PSI-pour la détection de bactéries 6,8,20,23-29. En outre, la plupart de ces études de preuve de concept ont démontré «indirecte» de détection des bactéries. Ainsi, en général, avant la lyse des cellules est nécessaire pour extraire les fragments de protéine / ADN ciblés, caractéristiques de la bactérie étudiée 29. Notre approche consiste à saisir directement les bactéries ciblescellules sur le biocapteur psi. Par conséquent, les anticorps monoclonaux, qui sont spécifiques à une cible, les bactéries, sont immobilisés sur la surface poreuse. La liaison de cellules de bactéries, par l&#39;intermédiaire d&#39;interactions anticorps-antigène, à la surface du biocapteur induire des changements dans l&#39;amplitude (intensité) du spectre de réflectivité de 24 à 26. Dans ce travail, nous rapportons sur la construction d&#39;un biocapteur à base de PSI-optique et de démontrer son application comme les biocapteurs plate-forme sans étiquette pour la détection d&#39;Escherichia coli (E. coli) K12 (utilisées comme un micro-organisme modèle). L&#39;surveillés le signal optique est de la lumière réfléchie à partir de la nanostructure PSi raison de Fabry-Pérot mince film interférence (Figure 1A). Les variations de l&#39;amplitude / intensité de la lumière sont corrélés à l&#39;immobilisation spécifique des cellules des bactéries cibles sur la surface du biocapteur, permettant une détection rapide et une quantification des bactéries.

<table><tbody><tr><td>Siwafer</td><td>Siltronix Corp.</td><td></td><td>Hautement dopé B, type p, résistivité de 0,0008 &Omega ;-cm, < HF aqueux orienté 100></td></tr><tr><td>(48 %)</td><td>Merck</td><td>101513</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td> Solution tampon PBS <td>Merck</td><td>818760</td><td></td></tr><tr><td>(pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>préparée par dissolution de 50 mM de Na2HPO><4, 17 mM de NaH2PO4 et 68 mM de NaCl dans de l’eau Milli-Q (18,2 M&Omega ;)</td></tr><tr><td>Solution saline à 0,85 % p/v</td><td></td><td></td><td>préparée en dissolvant 0,85 g de NaCl dans 100 ml d’eau Milli-Q (18,2 M&Omega ;)</td></tr><tr><td>95 % (3-Mercaptopropyl)Triméthoxysilane (MPTS)</td><td>Sigma Aldrich Chemicals</td><td>175617</td><td></td></tr><tr><td>PEO-iodoacetyl biotine</td><td>Sigma Aldrich Chemicals</td><td>B2059</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (SA)</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>016-000-114</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine (DTAF)-streptavidine</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>016-010-084</td><td></td></tr><tr><td>IgG de lapin biotinylé</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>011-060-003</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin marqués par fluorescence</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>111-095-003</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-souris marqués par fluorescence</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>115-095-003</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps biotinylés E. coli</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (K-12)</td><td></td><td></td> <td>a été généreusement fourni par le Prof. Sima Yaron, Technion</td></tr></tbody></table>

détection optique de e. coli bactérie par mésoporeux silicon biocapteurs

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

<html> Un biocapteur optique sans étiquette basée sur une nanostructure poreuse de Si est conçu pour la saisie rapide et la détection de bactéries Escherichia coli K12, comme un micro-organisme du modèle. Le biocapteur repose sur la liaison directe des cellules des bactéries cibles sur sa surface, tandis qu&#39;aucun traitement préalable (par exemple par lyse cellulaire) de l&#39;échantillon étudié est nécessaire. Un film mince de Si mésoporeux est utilisé comme élément de capteur optique du biocapteur. Sous éclairage en lumière blanche, la couche poreuse affiche motifs de franges de Fabry-Pérot bien résolus dans le spectre de réflectivité. En appliquant une transformée de Fourier rapide (FFT) pour les résultats des données de réflectivité dans un seul pic. Les variations de l&#39;intensité du pic FFT sont surveillés. Ainsi, les bactéries cibles capturer sur la surface du biocapteur, par des interactions anticorps-antigène, induit des changements mesurables dans l&#39;intensité des pics de la FFT, permettant une observation «en temps réel» de l&#39;attachement de bactéries. nt &quot;&gt; Le film de Si mésoporeux, fabriqué par un procédé d&#39;anodisation électrochimique, est conjugué avec des anticorps monoclonaux, spécifiques de la bactérie cible. L&#39;immobilisation, immunoactivité et la spécificité des anticorps sont confirmées par des expériences de marquage par fluorescence. Une fois que le capteur biologique est exposée à l&#39; bactéries cibles, les cellules sont directement capturés sur la surface de Si poreux anticorps modifié. Ces événements de capture spécifiques entraînent des changements d&#39;intensité dans le film mince spectre du biocapteur optique interférentiel. Nous démontrons que ces biocapteurs peuvent détecter des concentrations relativement faibles de bactéries (détection limite de 10 4 cellules / ml) en moins d&#39;une heure.

PSi oxydée (2) Psio films sont préparés comme décrit dans la section du texte protocole. Figure 1B montre une micrographie électronique à balayage à haute résolution de la pellicule de PSi obtenu après oxydation thermique. La couche Psio 2 est caractérisé par des pores cylindriques bien définis ayant un diamètre dans la gamme de 30 à 80 nm. L'anticorps monoclonal (IgG) molécules sont greffées sur les Psio deux surfaces à l'aide d'une technolo...

Un biocapteur optique sans étiquette pour la détection de bactéries rapides est introduit. Le biocapteur est basé sur un silicium poreux nanostructuré, qui est conçu pour capter directement les cellules des bactéries cibles sur sa surface. Nous utilisons des anticorps monoclonaux, immobilisés sur le transducteur poreux, comme les sondes de capture. Nos études démontrent l&#39;applicabilité de ces biocapteurs pour la détection de concentrations bactériennes faibles en quelques minutes sans traitement préalable de l&#39;échantillon (telle que la lyse cellulaire).

Détection optique de E. coli Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de concevoir un biocapteur optique sans marquage pour la détection rapide des bactéries basé sur un silicium poreux nanostructuré. Ceci est réalisé en construisant du silicium poreux oxydé qui sera utilisé comme élément de transducteur optique du biocapteur. Dans un deuxième temps, des sondes de capture spécifiques, telles que des anticorps, sont immobilisées sur la surface poreuse pour fournir le composant actif du biocapteur.Ensuite, le biocapteur est exposé à la bactérie cible afin de capturer directement les cellules bactériennes sur l’anticorps. Des résultats de surface de silicium poreux oxydé modifié sont obtenus qui montrent des changements d’intensité dans le spectre d’interférence optique du film mince du biocapteur. En raison de la capture de bactéries, la microscopie optique est utilisée afin de confirmer la présence de bactéries à la surface du biocapteur.Le principal avantage de notre technique par rapport aux méthodes existantes comme la culture conventionnelle et les techniques, est que notre méthode détecte la présence de bactéries de manière très rapide en moins d’une heure. Cette méthode peut aider à relever les principaux défis liés à la surveillance environnementale de micro-organismes spécifiques, ainsi qu’à assurer la sécurité de l’eau et des aliments. Il permet également la détection d’espèces bactériennes spécifiques en temps réel et dans les paramètres du point de service Pour commencer, graver des plaquettes de silicium dans une solution de trois pour un de fluorure d’hydrogène aqueux et d’éthanol pendant 30 secondes à une densité de courant constante de 385 milliampères par centimètre carré.Veuillez noter que le fluorure d’hydrogène est un liquide hautement corrosif et qu’il doit être manipulé avec une extrême prudence. Rincez plusieurs fois la surface du film de silicium médiocre obtenu avec de l’éthanol. Ensuite, séchez les films sous un gaz d’azote sec, puis oxydez les échantillons de silicium poreux fraîchement gravés dans un four tubulaire à 800 degrés Celsius pendant une heure à l’air ambiant.Pour biofonctionnaliser l’échantillon de silicium poreux oxydé, incubez d’abord le film pendant une heure et une solution à 95 % de MPTS. Après rinçage au toluène, au méthanol et à l’acétone, séchez l’échantillon de silicium poreux oxydé traité au sinus sous un gaz d’azote sec. Ensuite, incubez l’échantillon sinuso-modifié dans un millilitre de solution de biotine PEOI oto acétyl de 100 millimolaires pendant 30 minutes.Rincez plusieurs fois l’échantillon traité à la biotine avec une solution saline tamponnée au phosphate 0,1 molaire ou une solution PBS. Ensuite, incubez l’échantillon pendant 30 minutes dans un millilitre de solution de streptocoque de 100 microgrammes par millilitre avant de le rincer à nouveau avec la solution PBS plusieurs fois. Ensuite, incubez l’échantillon de silicium poreux oxydé modifié à la streptavidine pendant 30 minutes dans un millilitre de 100 microgrammes par millilitre, un e coli biotinylé, un anticorps IgG monoclonal ou avec 100 microgrammes par millilitre.IgG de lapin biotinylées pour marquer par fluorescence l’échafaudage. Incuber les surfaces modifiées aux IgG avec 15 microgrammes par millilitre. Fluorescéine marquée anti IgG de lapin pendant 40 minutes.Incuber avec 15 microgrammes par millilitre. Fluorescéine marquée anti-IgG US comme contrôle. Examinez les échantillons au microscope à fluorescence après avoir rincé plusieurs fois les échantillons modifiés avec la solution PBS.Cultivez la bactérie e coli K 12 dans un tube de 10 millilitres avec cinq millilitres de luria britani ou de milieu LB. Incuber les bactéries pendant la nuit, en les secouant à 37 degrés Celsius, après une croissance nocturne. Dans un milieu LB, lire la densité optique à une longueur d’onde de 600 nanomètres ou OD 600 à l’aide d’un spectrophotomètre pour déterminer la concentration bactérienne.Le nombre de cellules est directement proportionnel à la mesure OD 600. Lieu. Les échafaudages en silicium poreux oxydé modifié IgG et le contrôle. Échantillons de silicium poreux oxydé dans une cellule d’écoulement en plexiglas sur mesure.Fixez la cellule d’écoulement pour vous assurer que la réflectivité de l’échantillon est mesurée au même endroit pendant toutes les mesures. Incuber les échantillons avec la suspension Coli K 12 pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez ensuite la suspension de bactéries en rinçant la cellule avec une solution saline, 0,85 % poids par volume pendant 30 minutes.Surveiller l’évolution des données de réflectivité tout au long de l’expérience sur un spectromètre CCD. Effectuez toutes les mesures optiques dans un environnement aqueux après avoir collecté les spectres sur un spectromètre CCD analysé en appliquant une transformée rapide à quatre oreilles. Enfin, confirmez la présence de bactéries à la surface du biocapteur en observant les échantillons au microscope optique droit immédiatement après l’expérience de biodétection.Voici une micrographie électronique à balayage haute résolution des films de silicium poreux après oxydation thermique. La couche de silicium poreux oxydé est caractérisée par des pores cylindriques bien définis d’un diamètre compris entre 30 et 80 nanomètres. La fixation des anticorps à la surface du silicium poreux oxydé est confirmée par un marquage fluorescent, suivi d’une observation de la surface au microscope à fluorescence.De plus, les études fluorescentes permettent de caractériser l’activité et la spécificité antigénique des anticorps immobilisés en surface par liaison d’IgG anti-lapin et d’IgG anti-souris marquées par fluorescence en tant que contrôle. L’expérience de contrôle sans IgG pour démontrer que les changements de biodétection des bactéries dans l’amplitude ou l’intensité de la lumière réfléchie par la nanostructure de silicium poreux oxydé sont surveillés un spectre de transformation rapide du biocapteur avant et après l’introduction de la bactérie E coli est montré ici Suite à l’exposition à la bactérie E coli. Une diminution d’intensité de sept plus ou moins 1 % est enregistrée, tandis que des changements non significatifs sont observés pour la surface de silicium poreux oxydé non modifiée.De plus, afin de confirmer la présence de cellules capturées sur la surface de silicium poreux oxydé, les biocapteurs sont observés au microscope optique immédiatement après la fin de l’expérience de biodétection affichée. Voici des cellules bactériennes immobilisées à la surface du biocapteur. Bien qu’aucune cellule ne soit observée sur les surfaces de contrôle non modifiées Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure si elle est correctement exécutée.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de planifier un biocapteur optique spécifique pour la surveillance d’un analyte cible.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Biocapteurs s'interfacer avec des environnements complexes et biologiques et effectuer une détection ciblée en combinant des capteurs très sensibles avec des sondes très spécifiques attachés à la sonde par l'intermédiaire d'une modification de surface. Ici, on démontrer la fonctionnalisation de la surface de capteurs optiques en silice avec de la biotine en utilisant des agents de couplage silane pour combler le capteur et le milieu biologique.

Fixation des sondes biologiques à des biocapteurs optiques de silice à l&#39;aide d&#39;agents de couplage au silane

Nous avons récemment rapporté une nouvelle approche pour générer des sondes DNAzyme fluorogènes qui peuvent être appliqués à mettre en place un simple, «mix-and-lire" immunofluorescence pour la détection bactérienne. Ces sondes d'ADN spécifiques catalyser le clivage d'un chromophore de modification d'ADN-ARN substrat chimérique en présence d'un mélange brut extracellulaire (LEC) produite par une bactérie spécifique, traduisant ainsi la détection de bactéries dans la génération du signal de...

Détection des bactéries à l&#39;aide ADNzymes fluorogènes

Nous décrirons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour la détection rapide de bactéries et d'identification. L'essai comporte une matrice de capteurs fonctionnalisé avec de l'ADN d'oligonucléotides sondes de capture pour des séquences spécifiques d'espèces d'ARN ribosomique (ARNr). Sandwich hybridation de l'ARNr cible avec la sonde de capture et une sonde de détection d'oligonucléotides d'ADN lié à la peroxydase de raifort produit un courant ampérométrique mesurable.

Bacterial Detection &amp; identification au moyen de capteurs électrochimiques

Source : Barber, A. E., et al. Préparation et application d’un nouveau biocapteur bactérien pour la détection présumée des résidus de balle. J. Vis. Exp. (2019).Cette vidéo montre la détection d’analytes spécifiques à l’aide d’un biocapteur bactérien. Une culture bactérienne portant un plasmide avec un gène de protéine fluorescente rouge (RFP) sous un promoteur sensible à l’analyte est prélevée. Après avoir soigneusement essuyé la surface d’essai, une petite partie de la lingette est immergée...

Détection d’un analyte cible à l’aide d’un biocapteur bactérien

Cette vidéo présente une technique permettant de détecter les contaminants bactériens dans des échantillons d’aliments et d’eau à l’aide de nanocapteurs. Les bactéries pathogènes cibles sont détectées par une combinaison de relaxation magnétique et de modalités d’émission de fluorescence.

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