Name: Mesure du calcium total dans les neurones par sonde électronique X-ray microanalyse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Découvrez la microanalyse par sonde électronique pour mesurer le calcium total dans les neurones en culture avec une résolution subcellulaire. Cette méthode révèle les changements de concentration calcique impliqués dans la signalisation intracellulaire.

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Nous tenons à remercier Mme Christine A. Winters pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Programme de neurosciences de base du Programme de recherche intra-muros NINDS, NIH (Z01 NS002610).

L&#39;approche décrite ici a été développé en utilisant des instruments, des outils et des logiciels. Parce que les laboratoires ne seront pas utiliser le même dispositif expérimental de la démarche est généralisée, si possible. Une. La congélation rapide La méthode d&#39;analyse d&#39;être décrite est tout à fait dépendante de méthodes cryogéniques pour: 1) la &quot;cryofixation&quot; des cellules ou des tissus d&#39;une manière qui préserve quantitativement la distribution des composants des tissus diffusibles et éléments chimiques comme ils l&#39;étaient dans des cellules vivantes à l&#39;instant de congélation et 2) la préparation d&#39;ultramince cryosections approprié pour l&#39;imagerie et l&#39;analyse dans un TEM. Ces techniques sont brièvement décrites ici, mais les détails nécessaires pour reproduire ces procédures dans d&#39;autres laboratoires sont au-delà de la portée de cet article. Les lecteurs intéressés sont appelés à d&#39;excellents articles récents 9,14. Attention: Cette section décrit l&#39;utilisation de savon mouéthane efied, qui est hautement inflammable et potentiellement explosif; précautions appropriées devraient être prises. L&#39;opérateur doit également se familiariser avec de l&#39;azote liquide (LN2) les mesures de sécurité, y compris couche protectrice de laboratoire, des lunettes et des gants cryoresistant. Remarque: Ici comme partout, tous les outils (pinces, etc) utilisés pour manipuler les échantillons congelés doivent être pré-refroidies dans LN 2 avant utilisation pour éviter la décongélation accidentelle. Les cellules cultivées sur des lamelles couvre <ol><li> Préparer un dispositif de gel profond par condensation de l&#39;éthane gazeux à -160 ° C dans la LN puits central 2 refroidi. Remplir à la marque et couvrir le puits avec le couvercle pivotant en aluminium lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. </li><li> En utilisant des cales de papier-filtre, tache lamelles en plastique de cellules cultivées dans des conditions appropriées expérimentalement à un film aqueux mince. Éponger à partir du bord de façon à éviter de toucher le tissu, le film résiduel idéal, déterminé par essai-erreur, est aussi mince que possible, mais pas si edans d&#39;évaporer et de permettre le séchage de la surface du tissu. </li><li> En tenant la lamelle couvre-objet par le bord avec une pince de serrage, rapidement plonger dans de l&#39;éthane liquide, soit manuellement, soit à l&#39;aide du piston de la gravité alimenté. </li><li> Placer la lamelle congelé dans un bol en polystyrène expansé à proximité de LN 2, assez grand pour manipuler le nombre souhaité de lamelles couvre-objet dans des récipients de stockage à long terme. boîtes à bouchon à vis en aluminium qui ne saisissent pas sous LN2 sont recommandés. </li></ol> Congélation rapide des tranches de cerveau de culture <ol start="5"><li> Sous un microscope de dissection, vue et orienter une tranche de l&#39;hippocampe organotypique, intact et toujours attaché à l&#39;insert de membrane de culture. Placez points repères sur la membrane près du bord de la tranche avec un stylo Sharpie black-type et la photographie. </li><li> Encore sous le microscope, couper env. 5 x 5 mm carrés de membranes avec des tranches individuelles centrées sur les places. Évitez de toucher la tranche ou la flexion du membrane. </li><li> Monter une tranche de membrane soutenu, amortie par un ¼ dans la garniture de gélose de diamètre, sur un disque en aluminium conçu sur mesure pour s&#39;adapter à un cryoultramicrotome (décrit ci-dessous). Rapidement geler la tranche par pneumatique projetant contre un bloc de saphir LN 2-refroidi au moyen d&#39;un dispositif sur mesure &quot;claquement de congélation&quot;. </li><li> Déplacer vers stockage comme décrit pour les cellules en culture. </li></ol> 2. Cryosectioning MISE EN GARDE: produire avec succès des rubans de coupes ultrafines sec coupées, tandis que simple et logique, une formation, de la patience et beaucoup de pratique. <ol><li> Cuire un cryoultramicrotome équipé d&#39;un cryoattachment et laisser refroidir à -135 ° C. </li><li> Couper des lamelles congelés dans env. 3 x 3 cases mm en utilisant un pointu, scalpel préalablement refroidi. Incluez morceaux avec des cultures vers le haut dans un liquide &quot;cryoglue&quot; visqueux (un mélange 01:06 d&#39;éthanol et de 2-propanol 11), type sur 3mm broches d&#39;aluminium de diamètre conçu pour s&#39;adapter à l&#39;échantillon mandrin microtome. Éviter les fuites cryoglue sur la surface de culture. Solidifier cryoglue en abaissant la température de cryobox à ≤ 160 ° C. <ul class="lalpha"><li> Pour des tranches de cerveau congelés, fixer les disques directement à un échantillon mandrin sur-mesure au moyen d&#39;un collier à vis. </li></ul></li><li> Coupez des régions choisies des échantillons congelés - par exemple les zones riches cellules de pièces de lamelle ou domaines identifiés de tranches - une env. Face de bloc de 250 x 250 um et environ 100 um de profondeur à l&#39;aide d&#39;un outil de coupe au diamant. </li><li> Rubans sec coupe de lames minces à ca. -160 ° C en utilisant un diamant cryoknife 35 °, essentiellement comme décrit dans Références d&#39;4, 9. Vitesse de coupe et angle de dégagement du couteau sont déterminées de manière empirique, un bon point de départ est de 0,4-0,6 mm / sec à 9 °. L&#39;épaisseur nominale, c&#39;est à dire spécimen avance, des articles hydratés is typiquement 80 nm, bien que les articles sont en fait de 1,5 2.0x plus épais, principalement due à la compression. Pour sectionnement satisfaisante, un dispositif antistatique est essentiel. Placez la pointe ionisante des périphériques de 0,5-1 cm du bord de couteau et régler la puissance de sortie jusqu&#39;à rubans satisfaisantes des articles sont produits. </li><li> Préparer des sondes de cils par collage (époxy) cils de bois bâtons applicateurs. En utilisant une telle sonde, ramasser et sections de transfert de l&#39;arrière de la lame sur des films de soutien pioloform revêtues de carbone lueur déchargée exprimés plus de 100 mailles des grilles de cuivre de pliage et reposant sur une indium enveloppe d&#39;aluminium plié en deux sur une étagère de travail derrière le couteau. Replier la moitié supérieure de la grille et l&#39;enveloppe, la presse avec un outil pression à froid. </li><li> Transfert grilles enveloppés dans une boîte de grille pratique et la ranger dans un aluminium peuvent, comme décrit dans l&#39;étape 1.4. </li></ol> 3. Cryotransfert des échantillons à la microscope électronique L&#39;instrument de base pour EPMAdans ce laboratoire est un microscope électronique analytique fonctionnant à 120 kV et équipé pour cryo-microscopie, qui est, conçu avec un vide propre, spécimen anticontaminator-zone, une haute sensibilité appareil photo numérique 2k x 2k et cryotransfert support de spécimen. Vérifier au préalable l&#39;alignement du microscope et des conditions de fonctionnement dans les deux modes à faible et à fort grossissement et confirmer un vide de la colonne satisfaisante, idéalement ≤ 10 -7 Torr. Tune up si nécessaire. <ol><li> Confirmer que l&#39;isolation sous vide de la composante de la cryoholder Dewar est satisfaisante. Pompe selon les besoins. </li><li> Refroidir le cryoholder à sa température minimum, au moins 160 ° C, tandis que sous vide poussé dans la platine du microscope, détachez le câble reliant le titulaire à son boîtier de commande. Inclinez le goniomètre 45 ° vers la droite avant de retirer le support de minimiser LN 2 répandre sur les surfaces de l&#39;opérateur et du microscope. </li><li> Préparer la cryoworkstation de paillasse par le refroidissement de la isoler intégranted tasse à ≤ 160 ° C. </li><li> Transfert (quickly!) le cryoholder refroidi de microscope à Cryo poste de travail. Rétracter gel bouclier de la porte. </li><li> Récupérer sous LN 2, un sandwich au réseau de stockage et de place sur la table de travail de la cryoworkstation. Un anneau de retenue pour l&#39;échantillon le puits de la titulaire est également mis sur la table. </li><li> Ouvrez l&#39;enveloppe d&#39;indium et déplacer la grille de pliage ci-joint pour le bien de l&#39;échantillon de la cryoholder. Fixez la grille avec la bague de retenue en utilisant l&#39;outil de clé fournie et fermer l&#39;écran de gel. </li><li> Enlever rapidement la cryoholder du cryoworkstation et l&#39;insérer dans le sas du microscope et de passer par la séquence de pompage le plus rapidement possible. Lors de l&#39;insertion, il devrait y avoir une interruption minimale du vide de la colonne. </li><li> Goniomètre revenir à 0 ° d&#39;inclinaison. Rebranchez et redynamiser le boîtier de commande et de confirmer que la température de l&#39;échantillon est ≤ 150 ° C. </li><li> Remplir le Dewar de laporte-échantillon et permettent vide et la température se remettre complètement. </li></ol> 4. Enquête visuelle des sections <ol><li> Rentrer le bouclier de gel de la porte pour exposer spécimen et tourner sur le faisceau d&#39;électrons. </li><li> Évaluer visuellement l&#39;échantillon à faible grossissement, généralement 250X, et un éclairage faible. Comme illustré sur la figure 1, les sections doivent être minces et lisses, non pliée ou en chevauchement, plane et bien attaché à la feuille de support, et généralement pas obscurcie par les barres de la grille. </li><li> Éventuellement photographier sections choisies. (REMARQUE: Réduire l&#39;exposition au faisceau, depuis les coupes congelées hydraté sont très sensibles aux dommages induits par faisceau.) Utilisez la platine de goniomètre numérique automatisé pour stocker les coordonnées des articles sélectionnés. </li></ol> 5. La lyophilisation des articles <ol><li> Lyophiliser sections en augmentant la température de titulaire à ca. 100 ° C pendant environ 30 min. </li><li> Recool support à -160 ° C ou moins. </li><li&gt; Avant imagerie, éteignez l&#39;unité de contrôle de cryoholder et câble de contrôleur physique déconnexion pour éviter la dérive de l&#39;image due à un cycle thermique et / ou des vibrations ramassage. </li></ol> 6. Imagerie des cellules et des organites Images structurels des articles lyophilisés sont obtenus à ca. -160 ° C, à faible dose, les images sans perte enregistrés numériquement à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD à balayage lent 2k x 2k contrôlé par un logiciel approprié. <ol><li> Activez l&#39;EM en mode salut-mag. </li><li> Choisissez et de l&#39;image à ~ 2000 X (comme TIFF, voir la figure 2) cellules sélectionnées et les zones sub-cellulaires d&#39;intérêt dans les sections de haute qualité dont les emplacements ont déjà été enregistrées et stockées. (NOTE: Les sections sèches sont maintenant beaucoup moins fragile et moins sensible aux électrons du faisceau dommages. </li><li> Évaluer images afin de sélectionner des régions d&#39;intérêt (ROI) pour analyse aux rayons X. Cette étape peut éventuellement être effectuée hors ligne, auquel cas l&#39;EM peut être tournéet hors de l&#39;échantillon laisse se réchauffer à la température ambiante. </li></ol> 7. Acquisition de rayons X Spectra Spectres de rayons X peut être enregistré en utilisant n&#39;importe quel de plusieurs commerciale conçue sur mesure ou X-ray systèmes d&#39;analyse minimum consistant en un X (EDX) détecteur à dispersion d&#39;énergie, l&#39;électronique impulsion processeurs et logiciels associés d&#39;acquisition et d&#39;affichage compatible. (Le système utilisé dans ces travaux est décrit dans le tableau 1.) <ol><li> Configurer l&#39;EM pour l&#39;acquisition de rayons X par l&#39;insertion, le détecteur EDX dans la colonne (si nécessaire), le retrait de l&#39;ouverture objectif, et l&#39;insertion et le centrage des ouvertures de rayonnement parasite. Ajuster le cryoholder à la plus basse température à laquelle le gel contamination de l&#39;échantillon est évitée, mais au moins au-dessous de -100 ° C. </li><li> Incliner le support à 20 ° vers le détecteur. </li><li> Dans des conditions de formation d&#39;image à grand champ, et en supposant que l&#39;on envisage d&#39;analyser la matrice d&#39;un individual mitochondries, choisissez une mitochondrie pour l&#39;analyse, le déplacer vers le centre du champ et de se concentrer. </li><li> Passer en mode spot (sur certains microscopes juste converger le faisceau en utilisant deuxième foyer du condenseur) et augmenter le courant de faisceau à ca. 3 nA (mesurée avec une cage de Faraday ou similaire) dans un endroit 100 nm. </li><li> Lancez le logiciel d&#39;acquisition de spectre et de commencer à 100 acquisitions sec, qui peut être consulté temps en direct sur l&#39;écran d&#39;affichage. Enregistrer spectre enregistré (Figure 2). Le format EMSA standard de l&#39;industrie est préférable. </li><li> Arrêtez l&#39;EM et transférer le fichier (s) multi-spectres à un (offline) analyse poste de travail. </li></ol> 8. Analyse des rayons X Spectra L&#39;analyse qualitative Un spectre EDX (figure 2, en médaillon) est essentiellement un complot xy de l&#39;intensité des rayons X vs énergie. Spectra contiennent des informations qualitatives et quantitatives sur la composition élémentaire de til a analysé volume, en ce que l&#39;énergie &quot;caractéristique&quot; d&#39;un pic identifie l&#39;élément donnant lieu à ce que l&#39;intensité maximale alors que reflète la quantité de cet élément. Les pics caractéristiques montent au-dessus d&#39;un fond lentement variable, le &quot;continuum&quot;. (La légende de la figure 2 présente en outre des détails importants sur les spectres EDX). L&#39;énergie des collecteurs de pointe pour l&#39;ensemble du tableau périodique sont définis par la structure électronique bien connue d&#39;éléments, donc tous les liens de logiciels EDX à une base de données qui identifie automatiquement les éléments de un analyte. Dans un contexte physiologique, éléments d&#39;intérêt général qui sont bien adaptées à l&#39;analyse EDX comprennent Na (K α à 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) et Ca (3,69 keV). <ol><li> Profitez de base de données de logiciels disponibles et routines pic correspondant à identifier les éléments majeurs dans les spectres. Dans un échantillon biologique s&#39;attendre à trouver des pics de Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca et. (ATTENTION:Les deux derniers éléments se superposent!) </li></ol> Analyse quantitative L&#39;analyse quantitative des spectres EDX consiste à extraire l&#39;aire intégrée des pics identifiés, et la conversion de cette valeur à une concentration. Pour l&#39;analyse biologique, la méthode est la méthode établie pic / continuum salle 4,7,10, qui tire parti du fait que l&#39;intensité du continuum (défini ci-dessus et sur ​​la figure 2) est proportionnelle à la masse sèche du volume analysé . Ainsi, le rapport du pic de la zone / zone continuum, par rapport au même rapport dans les spectres de normes de composition connue, indique la concentration dans le compartiment cellulaire ciblée. Notez que cette approche fournit des concentrations en unités de moles par poids, généralement exprimées en mmol / kg de poids sec. Cette unité est inhabituel et d&#39;interprétation peut exiger la conversion supplémentaire, par exemple, mmol / L poids humide ou mmol / mg de protéine, comme décrit elsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Extraire des zones de pointe (et des estimations d&#39;erreur) d&#39;éléments biologiques entre Z = 10 à 20 (0,5 à 4,0 keV), à savoir Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca et, avec l&#39;une des routines de montage intégrée dans le logiciel d&#39;analyse (voir le tableau 1, en ​​particulier la note 4). Ce laboratoire utilise Simplex ou plusieurs places-moins approprié. Notez que cette mise en place nécessite une attention particulière à la résolution du chevauchement entre K et Ca pics (voir la figure 2). </li><li> Intégrer le continuum entre 1,45 à 1,61 keV. Régions sans interférences alternatives peuvent être utilisées. </li><li> Le calcul des ratios de pointe / continuum puis concentrations par rapport aux normes. Propager des erreurs tout au long de l&#39;analyse. </li><li> Utiliser des logiciels et des formules statistiques standard pour estimer les moyennes qui reflètent la variabilité biologique. </li></ol>

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Les auteurs rapportent aucun conflit d&#39;intérêt.

La méthode analytique basée microscope à électron présenté ici permet la détection, l&#39;identification et la quantification de plusieurs éléments d&#39;intérêt biologique, notamment Na, K, P, Ca et surtout. Ces analyses peuvent être effectuées à subcellulaire, soit intra-organite, la résolution en raison de la capacité de localiser et d&#39;identifier les structures d&#39;intérêt dans les images de haute qualité de cryosections préparés à partir de spécimens congelés rapidement. Notez qu&#39;aucune coloration...

Les ions calcium sont sans doute entité de signalisation cellulaire le plus important et polyvalent en biologie, en jouant un rôle essentiel dans les processus normaux aussi divers que la transmission synaptique et l&#39;expression des gènes. D&#39;autre part, le calcium est également important dans la mort cellulaire. En particulier, la déréglementation de calcium est un facteur clé dans les lésions neuronales dans l&#39;AVC, la maladie de Parkinson, la maladie d&#39;Alzheimer et autres maladies neurodégénératives 3,5. Ainsi, il est important de comprendre quantitativement comment le calcium est distribué dans les cellules, et comment cela change suivant stimuli physiologiques ou physiopathologiques. Ce but est compliquée par le fait que le calcium est distribué de façon dynamique entre les deux états physiques - libres en solution ou lié à un substrat - et que les concentrations en calcium cellulaire changé au cours de plusieurs ordres de grandeur à la suite d&#39;une stimulation. Bien qu&#39;il existe plusieurs méthodes avancées disponibles pour l&#39;analyse de free calcium intracellulaire, la détermination des concentrations totales de calcium dans les compartiments intracellulaires définies est réaliste limitée à une approche, à savoir, microsonde électronique (EPMA). EPMA est une technique qui couple un spectromètre à rayons X à un microscope électronique à transmission (MET). Le canon à électrons de TEM se concentre une sonde électronique fixe, submicronique sur une région subcellulaire d&#39;intérêt et les rayons X spécifiques à un élément émis à la suite d&#39;un bombardement d&#39;électrons sont recueillies et analysées (voir les références 7, 4 pour les examens techniques détaillées). Avantages de l&#39;EPMA comprennent résolution unique au niveau de l&#39;organite et sensibilité submillimolar. En pratique, cependant, EPMA nécessite cryotechniques spécialisées et de l&#39;instrumentation pour la préparation et l&#39;analyse spécimen. Ici, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour les mesures de calcium intracellulaire utilisant EPMA sont décrits. Calcium intramitochondrial est de i spécialentérêt en raison du rôle crucial que joue la surcharge de calcium mitochondrial dans les maladies neurodégénératives.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS/MATERIALS</td></tr><tr><td>Thermanox lamelles en plastique</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de culture</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Pour plaques à 6 puits</td></tr><tr><td>Cryopins</td><td>Leica Microsystems</td><td>16701952</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs en bois</td> rainuré <td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>Grilles EM pliantes</td><td>Ted Pella</td><td>4GC100/100</td><td>100 mesh</td></tr><tr><td>Feuille d’indium</td><td>Alfa Aesar</td><td>13982</td><td>0,25 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Appareil de congélation plongeante</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>Appareil de congélation Slam</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Cryofixation pour microtome</td><td>Leica Microsystems</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>Outil de cryorognage diamant</td><td>Diatome</td><td>Cryotrim 45</td><td></td></tr><tr><td>Cryoknife diamant</td><td>Diatome</td><td>Cryo 35</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif antistatique</td><td>Diatome</td><td>Hauf Ligne statique</td><td></td></tr><tr><td>Cryomicroscope électronique</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td>EM912 Omega</td><td></td></tr><tr><td>Porte-échantillon cryogénique EM</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD à balayage lent, 2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td><td>Logiciel</td><td></td></tr><tr><td>d’acquisition d’images</td><td>Olympus SIS</td><td>iTEM suite</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de rayons X ED</td><td>Oxford Instruments</td><td>Linksystem Pentafet</td><td></td></tr><tr><td>Processeur d’impulsions</td><td>Oxford Instruments</td><td>XP-3</td><td></td></tr><tr><td>Fond de panier PCI carte</td><td>4pi Systems</td><td>Spectral Engine II</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur de bureau</td><td>Apple</td><td>Tout modèle</td><td></td>compatible OS9</tr><tr><td>Logiciel d’analyse par rayons X</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>Tableur</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li>Le CF100 n’est plus vendu dans le commerce, bien que l’appareil soit disponible dans de nombreux établissements universitaires, et des machines ou des pièces complètes peuvent être trouvées en ligne.</li> <li>Un tutoriel vidéo pour le support de cryotransfert CT3500 est disponible à l’adresse <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4 » target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li>Le SEII est obsolète ; le moteur spectral universel est un produit ultérieur, compatible avec les PC, avec des fonctionnalités comparables. 4pi a cessé sa fabrication et ses ventes, mais fournit toujours un support technique à la clientèle. Les systèmes usagés se trouvent souvent en ligne.</li> <li>La DTSA originale est désormais obsolète. Le NIST propose dans le domaine public un successeur mis à jour, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm » target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol> </td></tr></tbody></table>

mesure du calcium total dans les neurones par sonde électronique x-ray microanalyse

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Dans cet article, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour des mesures quantitatives de contenu élémentaire intracellulaire en utilisant la technique dite de la microsonde électronique (EPMA) sont décrits. Calcium intramitochondrial est une attention particulière en raison du rôle essentiel que la surcharge calcique mitochondriale joue dans les maladies neurodégénératives. La méthode est basée sur l&#39;analyse des rayons X générés dans un microscope électronique (EM), par l&#39;interaction d&#39;un faisceau d&#39;électrons avec l&#39;échantillon. Afin de maintenir la distribution d&#39;éléments native diffusibles dans les échantillons en microscopie électronique, EPMA nécessite &quot;cryofixation&quot; du tissu suivie de la préparation de coupes cryogéniques ultraminces. La congélation rapide des cellules en culture ou des cultures de tranches organotypiques est effectuée par congélation plonger dans de l&#39;éthane liquide ou un gel par le claquement contre un bloc de métal froid, respectivement. Cryocoupes nominalement 80 nm d&#39;épaisseur sont coupées à sec avec un couteau de diamant à ca. -16076, C, monté sur carbone / grilles de cuivre pioloform revêtu, et cryotransferred dans un cryo-EM en utilisant un support de cryospecimen spécialisé. Après inspection visuelle et la cartographie de l&#39;emplacement à une température ≤ 160 ° C et une faible dose d&#39;électrons, cryosections congelés-hydraté sont lyophilisés à -100 ° C pendant ~ 30 min. les images au niveau des organites de cryosections séchées sont enregistrées, également à faible dose, au moyen d&#39;une caméra CCD à balayage lent et les régions sous-cellulaires d&#39;intérêt sélectionné pour analyse. les rayons X émis par ROI par une sonde fixe, concentré, à haute intensité électrons sont collectés par un X-ray à dispersion d&#39;énergie (EDX) spectromètre, traitée par l&#39;électronique associée, et présenté comme un spectre de rayons X, qui est un terrain de l&#39;intensité des rayons X vs énergie. Logiciel supplémentaire facilite: 1) l&#39;identification des composants élémentaires par leur énergie et leur empreinte digitale de pointe «caractéristiques», et 2) l&#39;analyse quantitative par extraction de zones de pic / fond. Ce document se termine par deux exemples qui illustrent typiqueApplications EPMA, celui dans lequel l&#39;analyse du calcium mitochondrial fourni des informations essentielles sur les mécanismes de blessures excitotoxic et un autre qui a révélé la base de la résistance à l&#39;ischémie.

Les cellules du cerveau subissent généralement des blessures excitotoxic à la suite de la libération de neurotransmetteurs pathologique qui se produit dans des conditions ischémiques. EPMA était essentiel pour découvrir comment la capacité des mitochondries neuronales pour séquestrer des quantités massives de calcium sous-tend le mécanisme de la blessure. La micrographie électronique de la figure 3 illustre l'aspect des mitochondries dans les cryosections lyophilisées de neurones d'hippocampe en culture...

Ce document décrit l&#39;application de la microscopie électronique cryoanalytical à la mesure quantitative de la teneur en calcium total et la répartition à la résolution subcellulaire dans des échantillons biologiques physiologiquement définies.

Mesure du calcium total dans les neurones par sonde électronique X-ray microanalyse

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

L’objectif général de cette procédure est d’utiliser la microscopie électronique analytique pour mesurer quantitativement la concentration d’éléments biologiquement importants tels que le calcium à la résolution subcellulaire dans les neurones en culture. Ceci est accompli en congelant d’abord rapidement des cultures de cellules vivantes et en préparant des sections cryogéniques ultra-minces. La deuxième étape consiste à transférer des coupes cryogéniques dans un microscope électronique analytique et à les lyophiliser.Ensuite, des images et des spectres de rayons X sont nécessaires à partir de régions subcellulaires sélectionnées, y compris les mitochondries neuronales. La dernière étape consiste à analyser quantitativement les spectres de rayons X pour déterminer les concentrations élémentaires localisées. En fin de compte, cette approche connue sous le nom d’EPMA est utilisée pour révéler les changements dans les concentrations et la distribution du calcium qui sous-tendent la signalisation intracellulaire du calcium.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes connexes telles que la fluorescence, la microscopie, l’absorption de radio-isotopes ou la photométrie de flamme, est la résolution au niveau de l’organite unique et la sensibilité submillimolaire. La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Natalia pva, scientifique principale dans notre laboratoire. Pour commencer, préparez un bain de congélation en condensant de l’éthane gazeux à moins 160 degrés Celsius dans le puits central d’un système refroidi à l’azote liquide.Ensuite, épongez le bord d’une lamelle contenant des cellules collées pour enlever tout sauf une fine pellicule de liquide. Veillez à ne pas dessécher l’échantillon. Ensuite, tenez la lamelle par le bord et immergez rapidement l’échantillon dans l’éthane liquide.Après deux à trois secondes, retirez la lamelle de l’éthane et placez-la dans un bol en polystyrène de transfert d’azote liquide. Le couvercle congelé se glisse dans un cryomicrotome pré-refroidi à moins 135 degrés Celsius. Coupez les lamelles de couverture congelées en carrés de trois millimètres sur trois millimètres à l’aide d’un scalpel bien aiguisé et pré-refroidi.Ensuite, incrustez-les face vers le haut sur une goupille en aluminium de trois millimètres de diamètre dans un mélange de colle cryo composé d’une partie d’éthanol et de six parties. Isopropanol. Solidifiez la colle cryogénique en abaissant la température de la boîte cryogénique à moins 160 degrés Celsius. Ensuite, coupez les zones riches en cellules de l’engobe de recouvrement à une face de bloc d’environ 250 par 250 microns et à une profondeur de 100 microns.À l’aide d’un outil de coupe diamantée, coupez à sec des rubans de sections minces à moins 160 degrés Celsius à l’aide d’un couteau cryo diamanté à 35 degrés, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Transférez ensuite les sections sur un moule en forme de peola recouvert de carbone déchargé par incandescence. Films de support coulés sur 100 grilles de cuivre pliantes en maille dans une enveloppe ouverte en indium.La grille est fermée. Ensuite, l’enveloppe et le sandwich pressés à l’aide d’un outil de pressage refroidi avant le transfert cryogénique des échantillons vers le microscope électronique. Refroidissez le support cryogénique à sa température minimale d’au moins moins 160 degrés Celsius sous vide poussé dans la platine du microscope.Inclinez ensuite le goniomètre de 45 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre et retirez le support. Transférez rapidement le support cryogénique refroidi du microscope vers le poste de travail cryogénique refroidi et rétractez le pare-gel du support. Transférez ensuite l’échantillon dans le support cryogénique.Fixez la grille avec la bague de retenue à l’aide de la clé fournie et fermez le pare-gel. Ensuite, retirez rapidement le support cryogénique du poste de travail cryogénique et insérez-le dans le sas du microscope. Effectuez la séquence de pompage le plus rapidement possible avec le support cryogénique d’échantillon en place.Remettez le goniomètre à une inclinaison de zéro degré. Rebranchez et remettez sous tension le boîtier de commande et confirmez que la température de l’échantillon est inférieure ou égale à moins 150 degrés Celsius. Enfin, remplissez le faiseur du porte-échantillon et laissez le vide et la température se rétablir complètement.Tout d’abord, évaluez visuellement l’échantillon à un grossissement de 250 fois et à un faible éclairage. Les sections sélectionnées doivent être fines et lisses, et non pliées ou superposées. Ils doivent également être plats, bien fixés au film de support et généralement ne pas être masqués par des barres de grille.Utilisez l’étage de goniomètre numérique pour enregistrer les coordonnées des sections sélectionnées. Ensuite, augmentez la température du support à moins 100 degrés Celsius pendant 30 minutes afin de lyophiliser les sections pour les stabiliser et améliorer le contraste. Ensuite, reculez les échantillons jusqu’à moins 160 degrés Celsius ou moins.Avant l’imagerie haute résolution. Éteignez l’unité de commande du support cryogénique et débranchez physiquement le câble du contrôleur pour éviter la dérive de l’image due aux cycles thermiques et/ou à la captation des vibrations. Activez ensuite le microscope électronique en mode de grossissement élevé.Étudiez les régions subcellulaires à un grossissement d’environ 2000 fois qui se trouvent dans des sections sélectionnées dont les emplacements ont été précédemment stockés. Enregistrez et stockez des images TIFF de zones prometteuses. Évaluez ensuite les images afin de sélectionner et d’annoter les régions d’intérêt pour l’analyse par rayons X.Une fois les régions d’intérêt sélectionnées, configurez le microscope électronique pour l’acquisition des rayons X en insérant le détecteur EDX dans la colonne, en retirant l’ouverture de l’objectif et en insérant et en centrant toutes les ouvertures de rayonnement parasite. Inclinez le support de 20 degrés vers le détecteur en mode spot. Augmentez le courant du faisceau à environ trois nanoampères, mesuré dans un spot de 100 nanomètres.Augmentez ensuite la température du support cryogénique à moins 100 degrés Celsius ou moins pour éviter la contamination par le givre dans des conditions d’imagerie à grand champ. Choisissez une mitochondrie pour l’analyse. Revenez en mode spot.Lancer le logiciel d’acquisition de spectre et commencer les 102e acquisitions. Enregistrez les spectres enregistrés au format de fichier standard EMSA. Échantillonnez suffisamment de mitochondries dans différentes cellules pour garantir un ensemble de données statistiquement significatif.Afin d’analyser qualitativement un spectre EDX, utilisez une base de données logicielle disponible et une routine d’appariement de pics telle que DTSA pour identifier les principaux éléments des spectres. Identifiez les éléments par les positions énergétiques caractéristiques de leurs pics. Les échantillons biologiques contiennent généralement du sodium, du cassium, du phosphore, du soufre, du chlore, du potassium et du calcium.Portez une attention particulière aux pics de calcium et de potassium car ils se chevauchent pour l’analyse quantitative. Commencez par extraire l’aire intégrée des pics identifiés à l’aide de l’un des nombreux algorithmes d’ajustement standard tels que la méthode du simplexe intégrée à DTSA pour estimer ensuite la masse sèche en intégrant le continuum entre 1,45 et 1,61 kilo-électronvolts. D’autres régions sans interférences, par exemple, de 4,0 à 5,0 kiloélectronvolts peuvent être utilisés pour éviter les signaux non biologiques étrangers dans la région du continuum primaire.Enfin, calculez les rapports de crête sur continuum et convertissez-les en concentrations par comparaison avec les normes. Cette approche est connue sous le nom de méthode du pic Hall sur le continuum. Voici une micrographie d’un neurone de l’hippocampe en culture, rapidement congelé à la suite d’une exposition à un stimulus cytotoxique, qui conduit à l’ouverture de canaux ioniques et à un flux de calcium.La plupart des mitochondries montrées ici semblent structurellement endommagées car elles sont très gonflées et contiennent de petites inclusions sombres. La microanalyse par sonde électronique a ensuite été utilisée pour effectuer une analyse élémentaire à l’intérieur et à l’extérieur des inclusions mitochondriales. L’étude a révélé que les inclusions sont en grande partie composées de quantités extrêmement élevées de calcium et de phosphore.Cela explique leur extraordinaire capacité tampon de calcium et pourquoi la surcharge de ce mécanisme tampon conduit à la surcharge de calcium déclenchée par la mort cellulaire. L’hippocampe, une zone du cerveau essentielle à l’apprentissage et à la mémoire, est un site majeur de lésion après l’ischémie. La région fonctionnellement distincte nommée CA trois est beaucoup moins vulnérable aux lésions ischémiques que la région adjacente synaptiquement connectée CA une : la microanalyse à la suite de stimuli toxiques de ces tranches a montré des élévations calciques beaucoup plus importantes dans les neurones CA vulnérables que dans les neurones CA trois résistants.Par conséquent, les mitochondries de CA un présentent des lésions et un dysfonctionnement étendus, ce qui indique que le dysfonctionnement mitochondrial induit par une surcharge de calcium est un facteur déterminant dans la vulnérabilité sélective des neurones de CA un. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la concentration de calcium total dans les mitochondries uniques des neurones culturels à l’aide de la microanalyse par sonde de collecte.

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