Name: Utilisation de Click Chemistry pour mesurer leffet de linfection virale sur Host-Cell Synthèse des ARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Découvrez la chimie click pour mesurer l'activité transcriptionnelle dans les cellules infectées par le virus de la fièvre de la vallée du Rift. Cette méthode sans radioactivité permet une visualisation par microscopie ou cytométrie en flux.

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Nous remercions RB Tesh pour fournir la souris des anticorps polyclonaux anti-RVFV sérum et M. Griffin de l&#39;UTMB cytométrie en flux Core Facility de l&#39;aide avec la cytométrie de flux. Ce travail a été soutenu par 5 U54 AI057156 par le Centre régional de l&#39;Ouest de l&#39;excellence, NIH R01 AI08764301 et le financement du Centre Sealy pour le développement de vaccins à UTMB.BK a été soutenu par le Fonds James W. McLaughlin Fellowship à UTMB.OL a été soutenue par une bourse de chercheur Maurice R. Hilleman stade précoce carrière.

Analyse de la transcription par microscopie à fluorescence 1. Infecter les cellules avec MP-12 et étiquettes ARN naissant avec l&#39;UE <ol><li> Placer les lamelles rondes de 12 mm dans la plaque de culture tissulaire à 12 puits, une lamelle par puits. </li></ol> Note: Si les cellules ont du mal à adhérer à lamelles, manteau avec de la poly-L-lysine (MW ≥ 70.000) avant de le placer dans les puits. Dans ce but, des lamelles de plonger dans une solution mg / ml stérile à 0,1 en H 2 O de poly-L-lysine pendant 5 min. Rincer lamelles avec H 2 O stérile et sécher à l&#39;air pendant au moins 2 heures. <ol start="2"><li> Aux semences de 293 cellules sur des lamelles, ajouter 5 x 10 4 cellules dans un milieu de croissance 1 ml (DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine) par puits. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 O / N. </li><li> Infecter les cellules avec MP-12 à une multiplicité d&#39;infection (moi) de 3. Inclure au moins deux<html> puits non infectés: l&#39;un des deux puits serviront de témoins non infectés, l&#39;autre sera traité avec actinomycine D (ACTD) à l&#39;étape 1.5 en tant que témoin pour la répression de la transcription. Retirez le milieu de croissance et de diluer le stock de virus de sorte que le volume total ajouté à chaque puits est de 200 ml. Incuber pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> Remarque: Au lieu d&#39;infecter les cellules, les cellules peuvent également être transfectées avec l&#39;ADN plasmidique ou synthétisés in vitro d&#39;ARN codant pour une protéine virale spécifique. Dans ce but, la transfection de cellules avec un réactif de transfection chimique approprié conformément aux instructions du fabricant et passez à l&#39;étape 1.5 à 16 h après la transfection. Il est conseillé d&#39;optimiser les conditions de transfection et le temps d&#39;incubation avant l&#39;ARN étiquetage et la fixation. <ol start="4"><li> Retirer inoculum et ajouter 1 ml de milieu de croissance frais par puits. Incuber à 37 ° C pendant 15 heures. </li></ol>ove_content &quot;&gt;. Remarque: Si l&#39;adaptation de ce protocole pour l&#39;utilisation avec un autre virus, il est conseillé d&#39;effectuer une expérience de stage de temps pour déterminer le moment optimal pour l&#39;ARN étiquetage et la fixation mettre en place cette évolution dans le temps de sorte que les temps d&#39;infection sont décalés et tous échantillons peuvent être étiquetés, fixe, et colorées en même temps. <ol start="5"><li> À 15 h après l&#39;infection (HPI), remplacer le milieu de croissance avec un milieu contenant 1 mM UE. Pour l&#39;un des puits infectés simulacres, ajouter également 5 ug / ml ACTD. Cela servira de contrôle pour la suppression de la transcription, comme ACTD inhibe la synthèse de l&#39;ARN ADN-dépendante. Retour aux cellules de l&#39;incubateur. </li><li> A 16 HPI, éliminer le milieu et laver les lamelles une fois avec 1 ml de PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) par puits. Fixer les cellules en ajoutant 1 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) par puits et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li></ol>&gt; NOTE: Pour préparer la solution de fixation de 4% PFA, dissoudre 10 g de paraformaldéhyde dans 150 ml H 2 O chauffée à 60 ° C sur un agitateur magnétique chauffant. Ajouter 500 ul de NaOH 1M et continuer à remuer jusqu&#39;à ce que solution devient limpide. Filtrer la solution PFA travers un papier filtre pour éliminer les particules et ajouter un tampon phosphate 62,5 ml (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4). Ajoutez H 2 O jusqu&#39;à un volume total de 250 ml. Congeler à -20 ° C en aliquots à usage unique. <ol start="7"><li> Laver une fois avec 1 ml de PBS par puits. Pas le temps d&#39;incubation est nécessaire pour cela et toutes les étapes de lavage ultérieures. Procéder immédiatement à l&#39;étape 2. </li></ol> Note: Il est important de procéder immédiatement à la réaction de clic, comme l&#39;ARN dégénère si elles sont conservées à ce stade pour des périodes prolongées; une perte du signal de fluorescence ARN peut déjà être observée si les cellules sont conservées pendant 1 h à 4 ° C . De même, si parla formation d&#39;une expérience de stage de temps, n&#39;oubliez pas de l&#39;étiquette, fixer, et aux taches tous les échantillons en même temps. 2. Cliquez réaction pour détecter les ARN marqué <ol><li> Perméabiliser les cellules par addition de 1 ml de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS. Incuber pendant 10 min à température ambiante. </li></ol> Note: Toutes les solutions utilisées dans les étapes 2.1 à 2.3 doivent être nucléase libre. <ol start="2"><li> Laver trois fois avec 1 ml de PBS par puits. </li><li> Retirez les lamelles sur la plaque de 12 puits et le transfert dans la chambre humide. Couvrir chaque lamelle avec 50 - une solution de coloration de clic de 100 ul (Tris 100 mM, pH 8,5, 1 mM de CuSO 4, 20 uM d&#39;azides fluorescente [excitation / émission maximale: 590/617 nm], l&#39;acide ascorbique 100 mM) chacune. Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Note: Pour assembler la chambre humide, tapisser le fond d&#39;une culture cellulaire ou boîte de Pétri avec un 10 cm de diamètre avec un film de paraffine plastique. Ligne à l&#39;intérieur du bord de la dish avec du papier absorbant humide. Placer les lamelles sur la pellicule de paraffine plastique. Remarque: Veillez à ne pas laisser les lamelles se dessèchent pas pendant cette ou toute autre étape dans le protocole. Il est préférable d&#39;ajouter la solution de coloration à chaque lamelle directement après qu&#39;il a été placé dans la chambre humide. Note: Préparer la solution de coloration de clic frais immédiatement avant cette étape. Les solutions mères de Tris 1,5 M pH 8,5, 100 mM de CuSO 4, et de l&#39;acide ascorbique 500 mM peuvent être conservés à 4 ° C. Toutefois, jeter toute solution mère d&#39;acide ascorbique qui a jauni. Remarque: Veillez à sélectionner un fluorophore qui correspond aux filtres sur votre microscope à fluorescence. <ol start="4"><li> Retirez les lamelles de la chambre humide et le placer dans une assiette fraîche de 12 puits et laver trois fois avec 1 ml de PBS par puits. </li></ol> Remarque: Si aucun detection des protéines virales est souhaitée, des lamelles peut être monté et imagée après cette étape (passez à l&#39;étape 3.3). 3. Immunofluorescence pour détecter l&#39;expression de protéines virales <ol><li> Ajouter 1 ml de tampon de blocage (3% (p / v) de sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS) à chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirez les lamelles sur la plaque de 12 puits, le transfert dans la chambre humide et couvrir avec 50 - 100 pi d&#39;anticorps primaire (anti-FVR, un cadeau aimable du Dr RB Tesh, UTMB) dilué dans du tampon de blocage (1:500). Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Remarque: Lors de l&#39;adaptation de ce protocole à utiliser avec un autre virus, déterminer la dilution optimale pour votre premier anticorps primaire. Note: Alternativement, cette étape peut être effectuée O / N à 4 ° C dans l&#39;obscurité. <ol start="3"><li> Retirez les lamelles de la chambre humide et remettez-le dans la plaque de 12 puits et lavertrois fois avec 1 ml de PBS par puits. </li><li> Retirez les lamelles de place de 12 puits, lieu dans la chambre humide et couvrir avec 50 - 100 pi d&#39;anticorps secondaire (IgG anti-souris conjugué à un colorant fluorescent [excitation / émission maximale: 495/519 nm]) dilué dans du tampon de blocage (1: 500). Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Remarque: Veillez à sélectionner un anticorps secondaire qui peut reconnaître votre anticorps primaire et correspond aux filtres sur votre microscope à fluorescence. Note: Si vous le souhaitez, à 200 ng / ml DAPI peut être ajouté à la dilution d&#39;anticorps secondaire de visualiser les noyaux. <ol start="5"><li> Retirez les lamelles de la chambre humide et remettez-le dans la plaque de 12 puits et laver trois fois avec 1 ml de PBS par puits. </li><li> Monter les lamelles en plaçant une goutte (ca. 15 pi) de Fluoromount-G sur une lame de microscope. Trempez la lamelle en H 2 O, enlever l&#39;excès de H 2 O en touchant èmecôté de l&#39;e sur une serviette en papier, et le lieu du côté de la cellule vers le bas dans la goutte de Fluoromount-G. Air sec pendant 5 min. </li></ol> Remarque: Si l&#39;imagerie sur un microscope inversé, permettre Fluoromount-G à se solidifier à 4 ° CO / N ou apposer les lamelles à la lame de microscope en scellant le bord avec du vernis à ongles transparent. Note: Les diapositives peuvent être visualisés immédiatement ou conservés à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant une semaine. 4. Acquisition de données <ol><li> L&#39;image en utilisant un microscope à fluorescence. </li></ol> Remarque: Veillez à sélectionner fluorophores appropriés qui peuvent être visualisés à l&#39;aide de votre microscope. Pour référence, voici les fluorophores et des jeux de filtres utilisés pour acquérir des images présentées dans cette publication. DAPI: filtre d&#39;excitation: BP 330-385 Dichromatique miroir: 400 DM Filtre d&#39;émission: LP 420 filtre d&#39;excitation: BP 460-490 Dichromatique miroir: DM 505 Filtre d&#39;émission: LP 510 Fluorophore avec une excitation / émission maximale de 590/617: filtre d&#39;excitation: BP 545-580 Dichromatique miroir: 600 DM Filtre d&#39;émission: LP 610 L&#39;analyse de la transcription par cytométrie de flux 5. Infecter les cellules avec MP-12 et étiquettes ARN naissant avec l&#39;UE <ol><li> Graine de 293 cellules en plaque de culture tissulaire à 6 puits dans un milieu de croissance (DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine). Incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2, jusqu&#39;à ce que les cellules ont atteint 80 - 100% de confluence. </li><li> Infecter les cellules avec MP-12 à une MOI de 3. Inclure au moins deux puits non infectés: l&#39;un des deux puits servira de témoin non infecté, l&#39;autre sera traité avec ACTD à l&#39;étape5.4. Retirez le milieu de croissance et de diluer le stock de virus de sorte que le volume total ajouté à chaque puits est de 400 pi. Incuber pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Retirer inoculum et ajouter 2 milieu de croissance frais ml par puits. Incuber à 37 ° C pendant 12 heures. </li></ol> Remarque: Si l&#39;adaptation de ce protocole pour l&#39;utilisation avec un autre virus, il est conseillé d&#39;effectuer une expérience de stage de temps pour déterminer le moment optimal pour l&#39;étiquetage et la récolte. Mettre en place cette évolution dans le temps de sorte que les temps d&#39;infection sont décalés et tous les échantillons peuvent être étiquetés, récolté, et colorées en même temps. <ol start="4"><li> A 12 HPI, remplacer le milieu de croissance avec un milieu contenant 0,5 mM UE. Pour l&#39;un des puits infectés simulacres, ajouter également 5 ug / ml ACTD. Cela servira de contrôle pour la suppression de la transcription, comme ACTD inhibe la synthèse de l&#39;ARN ADN-dépendante. Retour aux cellules de l&#39;incubateur. </li><li> À 13 HPI, laver les cellules une fois l&#39;esprith PBS et la récolte par la trypsine des cellules. Laver les cellules récoltées trois fois avec du PBS contenant 1 mM EDTA (PBS-EDTA). </li></ol> Remarque: Pendant ce sujet et les étapes ultérieures, ne pas centrifuger les cellules plus rapidement que 500 - 1000 xg pour éviter la rupture des cellules. Centrifuger les cellules pendant 1 - 2 min à sédiments. Remarque: Si un immunomarquage de surface est prévu après la réaction clic, la récolte en utilisant une spatule en caoutchouc ou d&#39;un grattoir cellulaire jetable à la place. <ol start="6"><li> Fixer les cellules en les remettant en suspension dans 1 ml de PFA 4% et incuber pendant 30 min à température ambiante. Reportez-vous à l&#39;étape 1.6 pour obtenir des instructions sur la façon de préparer PFA 4%. </li><li> Laver une fois avec 1 ml de PBS-EDTA par puits. Procéder immédiatement à l&#39;étape 6. </li></ol> Note: Il est important de procéder immédiatement à la réaction de clic, comme l&#39;ARN dégénère si elles sont conservées à ce stade pour des périodes de temps prolongées. De même, si vous effectuez un moment cexpérience ourse, n&#39;oubliez pas d&#39;étiqueter, fixer et colorer tous les échantillons en même temps. 6. Cliquez réaction pour détecter les ARN marqué <ol><li> Perméabiliser les cellules en remettant en suspension dans 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS. Incuber pendant 10 min à température ambiante. </li></ol> Note: Toutes les solutions utilisées dans les étapes 6.1 à 6.3 doivent être nucléase libre. Note: Si les cellules ne sont pas correctement les sédiments au cours de cette étape, augmenter le temps de centrifugation de 5 min. comportement de sédimentation va s&#39;améliorer une fois que les cellules sont mises en suspension dans un tampon FACS (étape 6.4). <ol start="2"><li> Laver une fois avec 1 ml de PBS. </li></ol> Note: Ne pas utiliser EDTA dans cette étape car cela chélate le Cu 2 + ions nécessaires à la réaction de clic. <ol start="3"><li> Remettre les cellules dans 200 ul de solution de coloration de clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM CuSO 4, 200 nM azoture marqué par un colorant fluorescent [HTitation / émission maximale: 650/665 nm], acide ascorbique de 100 mm). Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Note: Préparer la solution de coloration de clic frais immédiatement avant cette étape. Les solutions mères de Tris 1,5 M pH 8,5, 100 mM de CuSO 4, et de l&#39;acide ascorbique 500 mM peuvent être conservés à 4 ° C. Toutefois, jeter toute solution mère d&#39;acide ascorbique qui a jauni. Note: Si les cellules s&#39;agrègent lors de cette étape, remettre en suspension par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Remarque: Veillez à sélectionner un fluorophore qui peut être détecté par votre cytomètre en flux. Note: préparent également un échantillon des cellules infectées qui ne sont pas soumises à la procédure de coloration de clic; ceux-ci seront nécessaires pour l&#39;étalonnage du cytomètre de flux. Soit utiliser la moitié des cellules infectées ou comportent un supplément de bien infecté à l&#39;étape 5.2. Ces concellules contrôle seront immunocolorées à l&#39;étape 7.1. <ol start="4"><li> Laver deux fois avec du tampon FACS (PBS contenant 1 mM d&#39;EDTA et 0,5% (p / v) BSA). </li></ol> Remarque: Si aucun immunomarquage des protéines virales est souhaitée, les cellules peuvent être analysés immédiatement (passez à l&#39;étape 8). 7. Immunofluorescence pour détecter l&#39;expression de protéines virales <ol><li> Remettre les cellules dans 200 ul d&#39;anticorps primaire (anti-FVR) dilué dans tampon FACS (1:10,000) et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Note: Alternativement, cette étape peut être effectuée O / N à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Note: préparent également un échantillon de cellules non infectées qui ont été soumises à la procédure de coloration de clic, mais ne sera pas immunocolorées, ceux-ci seront nécessaires pour l&#39;étalonnage du cytomètre de flux. Soit utiliser la moitié des cellules infectées simulées ou comprennent un puits non infecté supplémentaire àl&#39;étape 5.2. Remarque: Lors de l&#39;adaptation de ce protocole à utiliser avec un autre virus, déterminer la dilution optimale pour votre premier anticorps primaire. <ol start="2"><li> Laver les cellules deux fois dans le tampon FACS. </li><li> Remettre les cellules dans 200 ul d&#39;anticorps secondaire (IgG anti-souris conjugué à un colorant fluorescent [excitation / émission maximale: 495/519 nm]) dilué dans tampon FACS (1:1000) et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules une fois dans un tampon FACS. </li></ol> Remarque: À ce stade, les cellules peuvent être stockées O / N à 4 ° C dans l&#39;obscurité. 8. Acquisition de données <ol><li> Resuspendre les cellules dans 500 pl de tampon FACS, le transfert dans des tubes de 5 ml de polystyrène et d&#39;analyser en utilisant un cytomètre de flux. Utilisez-12 MP cellules infectées (aucune réaction clic, coloration anti-RVFV seulement) et les cellules infectées simulées (cliquez réaction uniquement) pour calibrer l&#39;instrument. </li></ol> None: Veillez à sélectionner fluorophores appropriés qui peuvent être détectés par votre instrument. Pour référence, voici les lignes laser et jeux de filtres utilisés pour acquérir les données présentées dans cette publication. Fluorophore avec un spectre d&#39;excitation / émission de 495/519: Laser: 488 nm Filtre: 530/30 Fluorophore avec un spectre d&#39;excitation / émission de 650/665: Laser: 640 nm Filtre: 670/20

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole fourni décrit une méthode pour mesurer l&#39;effet de l&#39;infection virale sur la transcription de la cellule hôte via l&#39;incorporation de l&#39;uridine analogique UE en ARN naissants. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes précédentes: il est rapide, sensible et il ne repose pas sur l&#39;utilisation des isotopes radioactifs. En outre, le procédé peut être adapté pour fournir des données qualitatives par microscopie à fluorescence ou des données quantitatives par cytométri...

<html> Traditionnellement, l&#39;activité transcriptionnelle a été mesurée par incorporation de deux radioactif (3 H-uridine) ou 1 (BRU) 2 nucléosides halogénés en ARN naissants. Ces analogues d&#39;uridine sont prises par les cellules, convertis en uridine triphosphate (UTP) à travers la voie de récupération nucléosidique, et par la suite incorporés dans l&#39;ARN nouvellement synthétisé. 3H-uridine peuvent être détectés par autoradiographie, ce qui peut prendre beaucoup de temps, ou scintillation comptage, qui nécessite un équipement spécialisé. En outre, l&#39;utilisation d&#39;isotopes radioactifs ne peut être pratique dans un certain nombre de paramètres de laboratoire, y compris les laboratoires de biosécurité Haut de confinement. BrU peut être détectée par immunomarquage avec des anticorps anti-Bru, qui peuvent nécessiter perméabilisation dur pour assurer l&#39;accès de l&#39;anticorps dans le noyau ou la dénaturation partielle de l&#39;ARN, que la structure secondaire de l&#39;ARN pourrait être un encombrement stérique de la liaison d&#39;anticorps. _content &quot;&gt; Le protocole décrit ici utilise le récemment développé click chemistry 3 pour mesurer l&#39;activité transcriptionnelle dans les cellules infectées par la souche RVFV MP-12. click chemistry s&#39;appuie sur un cuivre très sélective et efficace (I) catalysée par réaction de cycloaddition entre un alcyne et un groupement azoture de 4,5. Dans ce protocole, ARN naissant dans les cellules infectées est d&#39;abord marqué par l&#39;incorporation de l&#39;uridine analogique de l&#39;UE. Dans un deuxième temps, le incorporée UE est détectée par réaction avec un azoture fluorescent. Les principaux avantages de cette méthode sont (1) qu&#39;il ne nécessite pas l&#39;utilisation d&#39;isotopes radioactifs et (2) qu&#39;il ne nécessite pas de perméabilisation sévère ou dénaturation de l&#39;ARN. avec un poids moléculaire de moins de 50 Da, l&#39;accès de l&#39;azoture fluorescent n&#39;est pas entravée par l&#39;insuffisance structure secondaire perméabilisation ou d&#39;ARN. Par ailleurs, les chercheurs ne sont pas limités dans leur choix d&#39;anticorps primaires en combinant la détection de l&#39;ARN avec une classeimmunocoloration iCal pour les protéines virales. Deux méthodes différentes sont décrites dans ce protocole: l&#39;un pour la visualisation de la transcription par microscopie à fluorescence (étapes 1-4), et l&#39;autre pour quantifier la transcription par cytométrie de flux (étapes 5-8). Ces deux méthodes combinent l&#39;étiquetage des ARN naissant avec un immunomarquage intracellulaire des protéines virales, ce qui permet d&#39;établir une corrélation entre l&#39;activité transcriptionnelle et l&#39;infection virale sur une base par cellule à cellule. Les auteurs ont utilisé avec succès le protocole décrit ici de déterminer l&#39;activité de transcription dans les cellules infectées par la souche RVFV MP-12 6 cellules infectées par différents-12 MP mutants 7,8, 9, et les cellules infectées par le virus Toscana (TOSV) 10. Le protocole décrit ici peut être facilement adapté pour une utilisation avec différents virus et a le potentiel d&#39;être modifié pour inclure immunofluorescence des protéines virales ou cellulaires spécifiques.

<table><tbody><tr><td>5-éthynyl-uridine</td><td>Berry Associates</td><td>PY 7563</td><td>dissoudre dans du DMSO pour 100 mM stock 12</td></tr><tr><td>mm rond lamelles</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>5 ml tubes en polystyrène</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycine D (ActD)</td><td>Sigma</td><td>9415</td><td>dissoudre dans du DMSO pour 10 mM stock</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>dissoudre dans H2O pour 100 mM de stock</td></tr><tr><td>DAPI </td><td>Sigma</td><td>D-9542</td><td>dissoudre dans H2O pour 5 mg/ml de</td></tr><tr><td>stock DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Azoture fluorescent Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>(couplé à Alexa Fluor 594)</td><td>Azoture fluorescent Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>(couplé à Alexa Fluor 657)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>à dissoudre dans H2O pendant 500 mM </td></tr><tr><td>filtre en papier</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde </td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine (MW &#8805 ; 70000)</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>dissoudre dans H2O pour un stock de 1,5 M, pH 8,5</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td> à fluorescence<td> par exemple Cytomètre</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> en flux Olympus IX71<td> par exemple BD Biosciences LSRII Fortessa</td></tr></tbody></table>

utilisation de click chemistry pour mesurer l&#39;effet de l&#39;infection virale sur host-cell synthèse des arn

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

De nombreux virus à ARN ont développé la capacité à inhiber la transcription de la cellule hôte comme un moyen de contourner les défenses cellulaires. Pour l&#39;étude de ces virus, il est donc important de disposer d&#39;un moyen rapide et fiable de mesure de l&#39;activité transcriptionnelle dans les cellules infectées. Traditionnellement, la transcription a été mesurée soit par incorporation de nucléosides radioactifs tels que 3H-uridine suivie d&#39;une détection par autoradiographie ou comptage à scintillation, ou l&#39;incorporation d&#39;uridine halogénés analogues tels que le 5-bromouridine (BRU) suivie d&#39;une détection par coloration immunologique. L&#39;utilisation d&#39;isotopes radioactifs, cependant, nécessite un équipement spécialisé et n&#39;est pas réalisable dans un certain nombre de paramètres de laboratoire, tandis que la détection de BrU peut être lourde et peut souffrir d&#39;une faible sensibilité. La chimie de clic récemment mis au point, ce qui implique une formation de triazole cuivre catalysée par un azoture et un alcyne, offre maintenant une rapide et highly alternatif sensibles à ces deux méthodes. Cliquez chimie est un processus en deux étapes dans lequel ARN naissant est d&#39;abord marquées par incorporation de l&#39;uridine analogique 5 éthynyluridine (UE), suivie par la détection de l&#39;étiquette avec un azoture fluorescent. Ces azides sont disponibles en plusieurs fluorophores différents, ce qui permet un large éventail d&#39;options pour la visualisation. Ce protocole décrit une méthode permettant de mesurer la répression de la transcription dans les cellules infectées par le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (FVR) souche MP-12 à l&#39;aide click chemistry. Parallèlement, l&#39;expression de protéines virales dans ces cellules est déterminé par immunomarquage intracellulaire classique. Les étapes 1 à 4 en détail une méthode pour visualiser la répression de la transcription par microscopie à fluorescence, tandis que les étapes 5 à 8 détaillent une méthode pour quantifier la répression de la transcription par cytométrie de flux. Ce protocole est facilement adaptable pour une utilisation avec d&#39;autres virus.

La protéine NS du RVFV (famille des Bunyaviridae, genre Phlebovirus) 11 inhibe la cellule hôte transcription général à travers deux mécanismes distincts: (i) en séquestrant la sous-unité p44 du facteur de transcription basal TFIIH 11 et (ii) en favorisant la dégradation par le protéasome de la p62 sous-unité de TFIIH 6. La souche vaccinale RVFV MP-12 13 a été utilisé pour les expériences décrites dans ce protocole depuis souche MP-12 peut être manipulé dans u...

Cette méthode décrit l&#39;utilisation de la chimie clic pour mesurer les changements dans la transcription de la cellule hôte après infection par le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (FVR) souche MP-12. Les résultats peuvent être visualisés qualitativement par microscopie à fluorescence ou obtenus quantitativement par cytométrie de flux. Cette méthode est adaptable pour une utilisation avec d&#39;autres virus.

Utilisation de Click Chemistry pour mesurer l&#39;effet de l&#39;infection virale sur Host-Cell Synthèse des ARN

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser l'activité transcriptionnelle dans des cellules infectées par un virus. Infectez d'abord les cellules 293 avec le virus de la fièvre de la vallée du Rift, souche MP-12. Ensuite, marquez les cellules avec l'analogue de l'uridine, le 5-éthynyl-uridine, qui s'incorpore dans l'ARN néosynthétisé. Puis, couplez le 5-éthynyl-uridine incorporé à une azoture fluorescente afin de visualiser l'ARN nouvellement synthétisé. Les résultats obtenus permettent d'évaluer les différences de quantité d'ARN nouvellement synthétisé entre les cellules infectées et non infectées, selon l'analyse par microscopie fluorescente ou par cytométrie en flux.Contrairement à l'étiquetage avec de l'uridine tritiée ou du 5-bromo-uridine, cette approche de chimie click ne nécessite pas l'utilisation d'isotopes radioactifs. Elle est également plus rapide et plus sensible que l'immunomarquage anti-bromo-uridine. L'idée de cette méthode découle de notre besoin d'une manière rapide et fiable de mesurer la suppression de la transcription dans des cellules infectées par différents virus de la fièvre de la vallée du Rift, souche MP-12. Placer des lamelles rondes de 12 millimètres dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Ensuite, ensemencer les cellules 293 dans un millilitre de milieu DMEM complet. Incuber les cellules dans une étuve humidifiée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Selon le plan expérimental, diluer le stock viral de manière à ce que l'infection des cellules par le MP-12 s'effectue à une multiplicité d'infection de trois dans un volume total de 200 microlitres par puits. Réserver un puits comme témoin non infecté et un autre comme témoin de suppression transcriptionnelle. Retirer maintenant le milieu de croissance. Ajouter l'inoculum viral et incuber pendant une heure dans l'étuve humidifiée. Aspirer l'inoculum. Ajouter un millilitre de milieu de croissance frais par puits, puis incuber à 37 degrés Celsius. À 15 heures post-infection, remplacer le milieu de croissance par un milieu contenant un millimolaire de l'analogue d'uridine, le 5-éthynyl-uridine. Dans l'un des puits témoins mock infecté, ajouter également cinq microgrammes par millilitre de l'inhibiteur de la synthèse de l'ARN dépendante de l'ADN, l'actinomycine-D. Remettre les cellules dans l'étuve. À 16 heures post-infection, retirer le milieu et laver les lamelles une fois avec un millilitre de PBS par puits. Fixer les cellules avec un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % par puits. Rincer une fois avec un millilitre de PBS par puits.Pour monter la chambre humide, tapisser le fond d'une boîte de culture ou d'une boîte de Pétri de 10 centimètres de diamètre avec un film plastique de paraffine. Tapisser l'intérieur du rebord de la boîte avec des serviettes en papier humides. Pour rendre les cellules perméables, ajouter un millilitre de Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Après trois lavages au PBS, transférer les lamelles dans la chambre humide. Pour la réaction « click » permettant de détecter l'ARN marqué, recouvrir chaque lamelle de 50 à 100 microlitres de solution de marquage « click » fraîchement préparée. Incuber pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière.Ajouter un millilitre de PBS dans les puits d'une nouvelle plaque de 12 puits et transférer les lamelles dans les puits. Laver deux fois supplémentaires avec un millilitre de PBS par puits. Pour monter les cellules en microscopie de fluorescence, déposer une goutte de fluoromount-G sur une lame de microscope. Plonger la lamelle dans l'eau, puis éliminer l'excès d'eau. Placer la lamelle côté cellules vers le bas dans la goutte de fluoromount G et laisser sécher à l'air pendant cinq minutes.Suivant le plan expérimental, infecter les cellules 293 avec le MP 12 à un MOI de trois. Retirer le milieu de croissance et ajouter le stock viral dilué, puis incuber pendant une heure dans une étuve humidifiée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Remplacer l'inoculum par deux millilitres de milieu de croissance frais par puits, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant le temps optimal pour l'étiquetage et la récolte du virus. Ensuite, remplacer le milieu de croissance par un milieu contenant 0,5 millimolaire de 5-éthynyl-uridine dans l'un des puits témoins non infectés. Ajouter également cinq microgrammes par millilitre d'actinomycine-D. Remettre les cellules dans l'étuve pendant une heure. Après un lavage au PBS, récolter les cellules par trypsination. Laver les cellules récoltées trois fois avec du PBS contenant un millimolaire d'EDTA. Pour fixer les cellules, resuspendre le culot dans un millilitre de PFA 4 % et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Laver une fois avec un millilitre de PBS-EDTA par tube. Puis permeabiliser les cellules dans 0,5 millilitre de Triton X-100 0,2 % dans le PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Laver une fois avec un millilitre de PBS sans nucléase. Pour la réaction « click », resuspendre le culot cellulaire dans 200 microlitres de solution de coloration « click » contenant le colorant fluorescent. Si les cellules s'agglomèrent, les resuspendre en pipetant. Incuber pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière. Laver deux fois avec le tampon FACS.Dans cette expérience, des cellules 293 ont été infectées par le virus MP-12 et par un virus mutant délétionnel qui ne possède pas la capacité de supprimer la transcription de la cellule hôte. Dans les cellules témoins non infectées, les noyaux apparaissent en rouge vif en raison de la transcription en cours. Étant donné que les cellules ont uniquement été marquées avec de l'EU pendant une heure, suivie d'une fixation immédiate, la majorité des ARN restent dans le noyau. En revanche, lorsque les cellules ont été traitées à l'actinomycine D afin d'inhiber pharmacologiquement la transcription, la fluorescence rouge des noyaux est nettement réduite. Cette fluorescence est également réduite lorsque les cellules sont infectées par le virus MP-12, mais pas par le mutant délétionnel, qui n'inhibe pas la transcription de l'hôte. Ici, les cellules ont été transféctées avec des ARNm synthétisés in vitro au lieu d'être infectées par un virus vivant. Le signal fluorescent rouge dans les noyaux indique qu'en comparaison avec les cellules non transféctées, les cellules transféctées avec un ARNm codant pour la protéine fluorescente verte n'ont pas modifié leur activité transcriptionnelle. Seule la transféction avec un ARNm codant pour le facteur de virulence NSs du virus de la fièvre de la vallée du Rift entraîne une diminution de la fluorescence rouge. Lorsqu'elles sont quantifiées, les données de cytométrie en flux obtenues peuvent être représentées sous forme de nuages de points, le signal fluorescent d'incorporation d'EU dans les ARN néosynthétisés étant porté sur l'axe des Y, et celui de la coloration anti-virus de la fièvre de la vallée du Rift sur l'axe des X. Les seuils des quadrants ont été définis de sorte que la majorité des cellules témoins se situent dans le quadrant supérieur gauche. La majorité des cellules traitées à l'actinomycine D se situe dans le quadrant inférieur gauche, et la majorité des cellules infectées se situe dans la moitié droite du graphique. Lorsque les cellules ont été infectées par le MP-12, 81,5 % de l'ensemble des cellules, ou 93 % des cellules positives à l'anticorps anti-virus de la fièvre de la vallée du Rift, présentaient une activité transcriptionnelle réduite. En revanche, lorsque les cellules ont été infectées par le MP-12, clone 13-type, 91,6 % de l'ensemble des cellules, ou 97 % des cellules positives à l'anticorps anti-virus de la fièvre de la vallée du Rift, présentaient une activité transcriptionnelle comparable à celle des cellules témoins non infectées. Ces données peuvent également être représentées sous forme d'un histogramme de marquage fluorescent des ARN par incorporation d'EU. Après cela, d'autres méthodes, telles que l'immunomarquage intracellulaire, peuvent être réalisées afin de visualiser l'expression des protéines virales dans ces cellules. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser la chimie click pour visualiser l'activité transcriptionnelle dans des cellules infectées par un virus, soit par microscopie fluorescente, soit par cytométrie en flux.N'oubliez pas que le travail avec un virus infectieux peut être extrêmement dangereux ; prenez donc des précautions telles que le port d'équipements de protection appropriés et évitez l'inhalation d'aérosols.

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