Name: Membrane-SPINE: un outil biochimique pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Découvrez la méthode Membrane-SPINE pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires in vivo par réticulation chimique, purification d'affinité et spectrométrie de masse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été soutenue par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 et SFB940 à SH

Remarque: Les informations détaillées concernant les tampons indiquées dans le protocole est disponible dans le tableau 1. Une. Fixation des interactions protéine-protéine par formaldéhyde réticulation dans les cellules vivantes <ol><li> Pour commencer la préparation des milieux de culture, solutions mères et de tampon P1 <ol><li> Préparer 500 ml de milieu: Le milieu doit offrir des conditions qui favorisent l&#39;interaction entre les protéines membranaires de protéines appâts et proies. En outre, une expérience doit être réalisée dans des conditions où l&#39;on prévoit aucune interaction (par exemple, sans réticulation). Note: Nous comparons les interactions protéine-protéine dans des bactéries stressées et non stressées. Par conséquent, on prépare 500 ml de milieu Luria Bertani (LB) (tableau 1) que nous sommes complémentaires avec un agent inducteur de stress (par exemple NaCl 0,5 M) dans un ballon d&#39;Erlenmeyer de 2 litres. Pour le contrôle, nous utilisons milieu LB normale avec 0,17 M de NaCl (pH 7,0). </li><li> Préparer du tampon Tris (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) et 0,1 M d&#39;acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), pH 8,0, solution mère (Tableau 1). </li><li> Préparer tampon P1. Dissoudre le saccharose à une concentration finale de 0,5 M dans du tampon Tris. Stériliser tampon P1 par filtration et stocker à 4 ° C. </li></ol></li><li> Cultiver des cellules exprimant la protéine appât de la membrane avec une Strep-tag fusion C-terminale à partir d&#39;un vecteur. Induire l&#39;expression de protéines d&#39;appât de la membrane pendant une durée suffisante. Note: on induit l&#39;expression de protéines d&#39;appât de la membrane bactérienne lors de la phase précoce-log (A 600 = 0,3) par addition de 250 ul de 1 M d&#39;isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 500 ml de milieu (concentration finale: 0,5 mM) . Afin de permettre une expression suffisante, l&#39;incubation de la bactérie jusqu&#39;à la phase logarithmique tardive (A 600 = 1,2). </li><li> Préparer pour chaque culture deux béchers de centrifugation d&#39;un volume minimum de 300 ml chacun et de les placer sur la glace. </li><li> Effectuer formaldéhyde réticulation. CAUTION: Le formaldéhyde est hautement toxique Nous recommandons de travailler sous une hotte de sécurité.. <ol><li> Transférer le récipient de culture sous une hotte de sécurité. Diviser chaque échantillon en deux échantillons, l&#39;un en omettant de réticulation (- X) et y compris le formaldéhyde une réticulation (+ X). Ajouter une solution de 4 ml de formaldéhyde à 37% à 250 ml de la culture pour parvenir à une concentration finale de 0,6%. </li></ol></li><li> Transférer les récipients de culture en arrière et cultiver des cellules pour 20 minutes supplémentaires comme avant. </li><li> Remplissez vos cultures dans les tubes de centrifugation sous une hotte de sécurité. Recueillir les cellules par centrifugation à 3000 xg pendant 30 min. </li><li> Rejeter le surnageant par pipetage avec précaution sous une hotte de sécurité. Recueillir toxique surnageant contenant du formaldéhyde et jetez-la. </li><li> Afin d&#39;atteindre un rendement optimal lors de la préparation de protéine membranaire, de préparer d&#39;abord des sphéroplastes. Ici, nous fournissons un protocole pour la formation de sphéroplastes de bactéries à Gram négatif: <ol><li> Prepare tampon P2 (tableau 1) à partir de poudre lyophilisée. Dissoudre doucement 2 mg de lysozyme dans 0,1 M d&#39;EDTA, pH 8, dans un tube de 1,5 ml. Toujours préparer fraîchement tampon P2 pour le jour de l&#39;expérience. </li><li> Préparer le tampon Tris avec un inhibiteur de la protéase (P3 tampon). A 10 ml de Tris-tampon, ajouter 0,1 ml de 1 M de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) (tableau 1) à une concentration finale de 10 mM. Utiliser le tampon immédiatement, afin d&#39;assurer le bon fonctionnement de PMSF comme inhibiteur de protéase. </li><li> culots cellulaires d&#39;Remettre en suspension dans 10 ml de Tris-tampon avec un inhibiteur de protéase et de la solution de transfert à un tube conique de 15 ml. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon P2 et incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Recueillir sphéroplastes par centrifugation à 3000 g pendant 30 min et éliminer le surnageant avec précaution. </li></ol></li><li> Incuber les pastilles de sphéroplastes pendant une nuit à -20 ° C. </li></ol> 2. Purification de Strep-tag Membrane Protein (Bait) <ol><li> Placez sphéroplaste pastille sur la glace. &lt;/ Li&gt; <li> Pendant le temps des pastilles de sphéroplaste dégel sur la glace, préparer 10 ml de tampon P3 pour chaque préparation sphéroplaste. Dissoudre délicatement 1 mg DNaseI dans 10 ml de Tris-tampon. Ajouter 0,1 ml de 1 M de PMSF juste avant utilisation. </li><li> Reprendre le culot dans 6 ml de P3 fraîchement préparé. Soniquer l&#39;échantillon quatre fois pendant 1 min en continu sur de la glace avec 1 min de pause entre chaque rafale, afin de perturber les sphéroplastes. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 10 000 xg pendant 10 minutes à des débris de cellules de la récolte. Transférer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette dans un tube d&#39;ultracentrifugation. </li><li> Sédimenter la fraction membranaire à 100 000 xg pendant 30 min. Laver le culot avec soin dans du tampon Tris sans dissolvant. Sécher le tube avec un mouchoir en papier (par exemple Kleenex). Ne pas perturber le culot, à tout moment. </li><li> Reprendre le culot (= membranes) avec précaution 1 ml de Tris-tampon. Utiliser une fraction aliquote de 20 ul de déterminer la concentration en protéine par dosage BCA par exemple. À cette étape, les membranes peuvent être congelés dans un choc lichique azote et conservés à -80 ° C. </li></ol> 3. Purification de Strep-tag Membrane Protein Bait et SDS-PAGE <ol><li> Normaliser la concentration en protéines de la fraction membranaire à 5 mg / ml avec du tampon Tris. Prendre 2,5 ml fraction de membrane (5 mg / ml) dans un tube d&#39;ultracentrifugation et ajouter 0,25 ml de 20% de Triton X-100 pour atteindre une concentration finale de 2%, afin de solubiliser les protéines membranaires. Ajouter une tige micro-magnétique et remuer sur de la glace pendant 1 heure. Remarque: Bien que, en général, nous avons de bons résultats en utilisant du Triton X-100 comme détergent, il peut être utile de modifier le détergent pour l&#39;optimisation. A cet égard, il faut obtenir les meilleurs résultats avec les détergents utilisés pour la purification de la protéine fonctionnelle de l&#39;appât de la membrane respective. </li><li> Tout en exécutant l&#39;étape 3.1, de préparer 50 ml de tampon B et 5 ml de tampon E (tableau 1). Remplir 10 ml 5x tampon W concentré à 50 ml et ajouter 150 ul 20% de Triton X-100. <ol><li> Remplir 1 ml 5x Buffer E concentré à 10 ml et ajouter 30 ul de 20% de Triton X-100. Equilibrer une colonne de débit 1 ml Strep-Tactin superflow gravité avec 8 ml de tampon W. Remarque: il est essentiel d&#39;ajouter le détergent utilisé pour la solubilisation dans un facteur 10 de la concentration au-dessus de la concentration micellaire critique (cmc) dans tout le tampon au cours de la procédure de purification. </li></ol></li><li> Retirer la tige de micro-magnétique à partir de l&#39;échantillon de solubilisation et par ultracentrifugation à 100000 g pendant 30 min, pour obtenir un culot de la fraction membranaire insoluble. Retirer le surnageant avec une pipette pour une purification supplémentaire. </li><li> Charger le surnageant à la colonne. Exécutez la colonne uniquement avec écoulement par gravité. Laver la colonne avec 5 ml de tampon W. Répétez cette étape de lavage 5x. </li><li> Éluer protéines appâts de la membrane avec 1 ml de tampon E. Répétez cette étape d&#39;élution 4x. </li><li> Concentrer les fractions d&#39;élution 2, 3, et 4 à 300 ul avec une unité de filtre centrifuge. </li><li> Mélanger 200 ul de chaque échantillon avec 50 pi 5x SDS-PAGE colorant de chargement. Fendez chaque préparation dans 125 aliquotes. Faire bouillir une fraction aliquote de chaque préparation pendant 20 min à 95 ° C, pour inverser formaldéhyde liaisons transversales. Laissez refroidir les échantillons à la température ambiante pendant au moins 10 min au-dessus de banc. </li><li> Charge: 30 ul de chaque échantillon à une seule voie d&#39;un gel de polyacrylamide-adapté à un immunotransfert. Utilisez un marqueur Prestained de poids moléculaire pour une meilleure orientation et exécuter SDS-PAGE 10. </li></ol> 4. Analyse par immunoblot pour confirmer interaction Partenaires <ol><li> Une fois l&#39;étape 3.8 est terminée, protéines de transfert sur ​​une membrane de nitrocellulose par exemple demi-sec. </li><li> Bloquer la membrane pour éviter l&#39;étiquetage imprécis. Préparer le tampon de blocage en pesant le sérum-albumine bovine (BSA) pour atteindre 3% en poids par volume dans une solution saline tamponnée au Tris supplémenté avec une concentration finale de 0,05% de Tween-20 (TBS-T). Utiliser un volume suffisant de tampon de blocage pour couvrir la membrane. Bloquer la membrane pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Diluer unend incuber le premier anticorps spécifique de la protéine proie comme d&#39;habitude. Utilisation d&#39;un anticorps HRP-lié en tant que second anticorps. </li><li> Développer l&#39;immunoblot en utilisant un kit de détection de chimioluminescence avec une grande sensibilité. Surveiller le signal en utilisant une procédure de traitement de film classique ou de l&#39;équipement d&#39;imagerie numérique. </li></ol> 5. NanoLC-ESI-MS/MS haute résolution expériences pour repérer interaction Partenaires <ol><li> Dans le cas où aucun anticorps spécifique est disponible pour la protéine proie ou partenaires d&#39;interaction inconnus doivent être identifiés, utiliser la spectrométrie de masse (MS) pour l&#39;identification. Afin d&#39;empêcher la contamination de la kératine, en utilisant des gels precasted pour la séparation des protéines. </li><li> Coloration à l&#39;argent du SDS-PAGE en utilisant un kit de coloration MS-compatible selon le protocole du fabricant. Effectuez toutes les étapes de lavage et coloration dans les réservoirs de verre. </li><li> Accise bandes respectives et analyser ceux-ci en haute résolution LC / MS 9. </li></ol>

<ol><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li>
<li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li>
<li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li>
<li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li>
<li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li>
<li>Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-SPINE%3A+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li>
<li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE%3A+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li>
<li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li>
<li>Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry%3A+Issues+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li>
<li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+%3A+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Analyse membrane colonne vertébrale est une approche biochimique que l&#39;on permet de confirmer et d&#39;identifier à ce point inconnus partenaires d&#39;interaction de protéines membranaires. Membrane SPINE combine in vivo réticulation par le formaldéhyde à la purification d&#39;une protéine appât de membrane Strep-marqué. La combinaison avec des immuno-empreinte facilite la confirmation de partenaires d&#39;interaction prédites (Figure 2). En outre, la combinaison avec l&#39;analyse MS perm...

Pour comprendre la fonction d&#39;une protéine, il est essentiel de connaître ses partenaires d&#39;interaction. Plusieurs techniques classiques sont disponibles pour l&#39;identification des partenaires d&#39;interaction de protéines solubles. Cependant, ces techniques ne sont pas facilement transférables à des protéines membranaires du fait de leur nature hydrophobe 4. Pour contourner cette limitation, nous avons développé la membrane Strep-protéine interaction expérience (Membrane-SPINE) 6. Il est basé sur la méthode de la colonne vertébrale, qui était uniquement pour les protéines solubles 7. Membrane-SPINE bénéficie de deux avantages de la formaldéhyde agent de réticulation: d&#39;abord, le formaldéhyde peuvent facilement pénétrer les membranes et donc génère un aperçu précis de l&#39;interactome d&#39;une cellule vivante 8. Deuxièmement, le formaldéhyde liaisons transversales peuvent être inversées en faisant bouillir 9. Ici, ces deux avantages sont utilisés pour identifier non seulement les IPP permanents mais aussi transitoires de prote de la membraneins 6. En bref, une Strep-tag est fusionnée à l&#39;extrémité C-terminale de la protéine appât membranaire intégrale. Les cellules exprimant la protéine appât de la membrane sont mises en incubation avec du formaldéhyde qui réticule les protéines s&#39;attaquent à la protéine appât de la membrane (Figure 1). Les modifications des protéines de la proie ne sont pas nécessaires. Ensuite, la fraction membranaire est préparée. Par conséquent, les protéines membranaires sont solubilisés par traitement avec un détergent et de l&#39;appât protéines sont co-purifiés avec ses protéines de proie en utilisant une purification par affinité. Par la suite, la liaison réticulée est inversé par ebullition, et l&#39;appât et de proie ses protéines co-éluées sont séparés par SDS-PAGE. Enfin, les protéines de proie peuvent être identifiés par une analyse par immunotransfert ou spectrométrie de masse.

<table><tbody><tr><td>37 % Formaldéhyde</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>Ne doit pas avoir plus d’un an</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit de dosage des protéines</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Tige micromagnétique</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 mm de longueur, 2 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>détergent standard pour la solubilisation</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta ;-maltoside</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>le meilleur détergent pour solubiliser CpxA</td></tr><tr><td>1 ml Strep-Tactin superflow colonne d’écoulement par gravité</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tampons de purification de protéines streptococciques</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>Contient le tampon W et le tampon E</td></tr><tr><td>Filtre centrifuge Amicon Ultra-4</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Kit de coloration à l’argent</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireKit de coloration à l’argent</td><td>Proteome Factory</td><td>P-S-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membrane-spine: un outil biochimique pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires in vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Les protéines membranaires sont essentielles pour la viabilité des cellules et sont donc des cibles thérapeutiques importantes 3.1. Comme ils fonctionnent dans des complexes 4, méthodes pour identifier et caractériser leurs interactions sont nécessaires 5. À cette fin, nous avons développé l&#39;expérience d&#39;interaction Strep-protéine de membrane, appelée membrane-SPINE 6. Cette technique combine in vivo de réticulation réversible à l&#39;aide du formaldéhyde agent de réticulation avec une purification par affinité de la protéine d&#39;appât de la membrane à étiquette Strep. Au cours de la procédure, les protéines de proies réticulés sont co-purifiés avec la protéine appât de la membrane et ensuite séparées par ébullition. Ainsi, deux grandes tâches peuvent être exécutées lors de l&#39;analyse des interactions protéine-protéine (IPP) de protéines membranaires en utilisant membrane-SPINE: d&#39;abord, la confirmation d&#39;un partenaire d&#39;interaction proposé par immunoblot, et d&#39;autre part, l&#39;identification de nouveaux partenaires d&#39;interaction par spectrométrie de masse . En outre, même low affinité, les IPP transitoires sont détectables par cette technique. Enfin, Membrane-SPINE est adaptable à presque n&#39;importe quel type de cellule, qu&#39;il s&#39;applique à un outil de dépistage pour identifier des IPP de protéines membranaires.

Analyse membrane RACHIS permet la co-purification des protéines membranaires et interagissant de manière transitoire partenaires protéiques. La co-purification est réalisée en utilisant l'agent formaldéhyde transversale de liaison. Deux paramètres sont critiques pour éviter des liaisons transversales non spécifiques: la concentration en formaldéhyde et le temps de réticulation. L'utilisation suffisante, mais non excessive de formaldéhyde peut être facilement contrôlé par immuno. Complexes protéiques formaldéhyde réticul...

Une approche biochimique est décrite in vivo pour identifier les interactions protéine-protéine dans (PPI) de protéines membranaires. Le procédé combine la réticulation des protéines, purification par affinité et la spectrométrie de masse, et peut être adapté à presque n&#39;importe quel type de cellule ou un organisme. Avec cette approche, même l&#39;identification des IPP transitoires devient possible.

Membrane-SPINE: un outil biochimique pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier in vivo les interactions protéiques et protéiques des protéines membranaires par le biais d’une expérience d’interaction de protéines streptococciques membranaires ou d’une colonne vertébrale membranaire. Ceci est accompli par réticulation in vivo à l’aide de l’agent de réticulation réversible pour le formaldéhyde. La deuxième étape consiste à purifier la protéine d’appât membranaire marquée au streptoque avec les protéines de proie réticulées.Ensuite, la réticulation est inversée par ébullition. La dernière étape est la séparation de la protéine d’appât membranaire et des protéines de proie co-purifiées par le sulfate de désalch, l’électrophorèse sur gel de poly acrylamide ou la page SDS. En fin de compte, l’analyse par immunotransfert et spectrométrie de masse est utilisée pour identifier les protéines de proie, ce qui permet d’analyser les interactions entre les protéines membranaires.Je m’appelle Sabina Hunka et nous allons vous montrer aujourd’hui la technologie de la colonne vertébrale à membrane. Le principal avantage de cette technologie par rapport aux méthodes existantes comme la co-IP, est qu’elle vous permet même de détecter des interactions protéiques de faible affinité ou transitoires. Kline Shaana vous montrera la procédure.Elle est l’une de mes étudiantes au doctorat qui a développé le protocole Pour commencer cette procédure, des cellules bactériennes en croissance exprimant la protéine d’appât membranaire avec une fusion de marqueur streptococcique terminal C induisent l’expression des protéines d’appât membranaire au début de la phase logarithmique par l’ajout de 0,5 millimolaire IPTG à 500 millilitres de milieu pour permettre une expression suffisante. Incuber les bactéries jusqu’à la fin de la phase logarithmique. Préparez-vous à effectuer une réticulation du formaldéhyde sous une hotte de sécurité en raison de la toxicité du formaldéhyde.Transférez le récipient de culture sous une hotte de sécurité. Divisez chaque échantillon en deux échantillons, l’un omettant la réticulation et l’autre, incluant la réticulation du formaldéhyde. Ajoutez quatre millilitres de solution de formaldéhyde à 37 % à une culture de 250 millilitres pour atteindre une concentration finale de 0,6 %. Transférez les récipients de culture et faites croître les cellules pendant 20 minutes de plus comme auparavant.Remplissez ensuite les cultures dans des tubes à centrifuger sous une hotte de sécurité. Recueillir les cellules par centrifugation à 3000 fois G pendant 30 minutes. Éliminer le surnageant par décantation d’abord et ensuite par aspiration.À l’aide d’une pipette placée sous une hotte de sécurité, jeter correctement les surnageants qui éliminent correctement le formaldéhyde toxique contenant du surnageant. Afin d’obtenir un rendement optimal lors de la préparation des protéines membranaires, préparez d’abord des plateaux Sphero pour commencer à dissoudre doucement deux milligrammes de lysozyme dans 0,1 molaire E-D-T-A-P-H huit dans un tube de 1,5 millilitre. Pour préparer le tampon P deux, qui doit être rafraîchi le jour de l’expérience.Resus suspend les pastilles cellulaires dans 10 millilitres de tampon de trissaccharose fraîchement préparé avec inhibiteur de protéase, et transfère la solution dans un tube conique de 15 millilitres. Ajouter un millilitre de tampon P deux et incuber sur glace pendant 30 minutes. Récupérez les plateaux Sphero par centrifugation à 3000 fois G pendant 30 minutes et jetez le surnageant.Incuber soigneusement les granulés Sphero plast pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius en travaillant sur de la glace. Resus suspend le palais de Sphero Plast dans six millilitres de tampon fraîchement préparé. P trois.Soniquez l’échantillon quatre fois pendant une minute en continu sur de la glace avec une pause d’une minute entre chaque rafale. Afin de perturber la centrifugeuse Sphero plast, l’échantillon à 10 000 fois G pendant 10 minutes pour récolter les débris cellulaires après la centrifugation. Transférez le surnageant à l’aide d’une pipette dans un tube à ultracentrifuger.Granulez la fraction membranaire à 100 000 fois G pendant 30 minutes. Lavez soigneusement la pastille dans un tampon tris de 20 millimolaires pH huit sans la dissoudre. Ensuite, enfoncez un tube avec un mouchoir en papier en évitant de déranger la pastille à tout moment.Pour remettre en suspension la pastille contenant les membranes, ajoutez un millilitre de tris, tamponnez une tige micromagnétique et remettez la pastille en suspension, en partie avec une pipette en remuant sur de la glace pendant une heure, utilisez une aliquote de 20 microlitres pour déterminer la concentration en protéines. Normaliser la concentration protéique de la fraction membranaire à cinq milligrammes par millilitre avec une pipette tris buffer 2,5 millilitres de la fraction membranaire dans un tube ultracentrifuge et ajouter 0,25 millilitre de 20 % Triton X 100 pour atteindre une concentration finale de 2 % afin de solubiliser les protéines membranaires. Ajoutez ensuite une tige micromagnétique et remuez sur de la glace pendant une heure.Équilibrez une colonne d’écoulement par gravité d’un millilitre d’actine strept super flow avec huit millilitres de tampon. W.Retirez la tige micromagnétique de l’échantillon de solubilisation et de l’ultracentrifugeuse à 100 000 fois G pendant 30 minutes pour granuler la fraction membranaire insoluble une fois l’exécution terminée, retirez l’état à l’aide d’une pipette. Pour une purification supplémentaire, appliquez le surnageant sur la colonne en utilisant l’écoulement par gravité.Lavez la colonne avec quatre millilitres de tampon W en répétant cette étape de lavage cinq fois. Éluez les protéines de l’appât membranaire avec un millilitre de tampon E.Répétez cette élution. Étape quatre fois, concentrez les fractions auxquelles il est fait allusion.Deux, trois et quatre à 300 microlitres avec une unité de filtration centrifuge. Mélangez 200 microlitres de chaque échantillon avec 50 microlitres de cinq x comme colorant de chargement de page DS. Divisez chaque préparation en aliquotes de 125 microlitres avant ébullition.Une aliquote de chaque préparation pendant 20 minutes à 95 degrés Celsius pour inverser les liaisons transversales du formaldéhyde. Laissez les échantillons refroidir à température ambiante pendant au moins 10 minutes sur la paillasse. Chargez par le haut 30 microlitres de chaque échantillon sur une seule voie d’un gel de polyacrylamide adapté à l’immuno-buvardage.Utilisez un marqueur de poids moléculaire précoloré pour la meilleure orientation et effectuez comme page SD après le transfert des protéines vers une membrane de nitrocellulose. Bloquez la membrane pour éviter un marquage non spécifique pendant une heure. À température ambiante, diluez et incubez l’anticorps primaire spécifique de la protéine de proie.Utilisez un anticorps lié à la HRP comme anticorps secondaire et développez l’immuno-transfert à l’aide d’un kit de détection chimiluminescent à haute sensibilité. Surveillez le signal à l’aide d’un procédé de développement de film classique ou d’un équipement d’imagerie numérique. S’il n’y a pas d’anticorps spécifique disponible pour la proie, la protéine ou l’interaction inconnue, les partenaires doivent être identifiés.Utilisez la spectrométrie de masse ou la spectrométrie MS pour l’identification. Colorez à l’argent la page SDS à l’aide d’un kit de coloration compatible MS. Selon le protocole du fabricant, effectuez toutes les étapes de coloration et de lavage dans les cuves en verre.Exciser les bandes respectives avant de les analyser par LCMS à haute résolution en tant que protéine d’appât. La protéine membranaire intégrale CPXA de VISIA coli a été utilisée. CPXA est une kinase de capteur et se compose d’un domaine de capteur terminal N avec deux domaines transmembranaires intégrant un grand domaine de capteur extracytoplasmique et un domaine catalytique cytoplasmique terminal C hautement conservé.Après la stimulation, CPXA active son régulateur de réponse apparenté, CPXR activé par CPXR diffuse pour médier la réponse de la colonne vertébrale membranaire. L’étiquette streptococcique a été fusionnée à l’extrémité C de CPX. Une analyse de la colonne vertébrale membranaire révèle que le streptocoque CPXA s’est réticulé à d’autres protéines ou complexes protéiques indiqués par un frottis dans l’échantillon traité au formaldéhyde dévoilé.Sans traitement au formaldéhyde, ce frottis est absent. De plus, une interaction protéique directe du streptocoque CPXA avec sa protéine régulatrice de réponse apparentée CPXR en tant que protéine de proie n’est détectable qu’en présence de formaldéhyde. Soutenir la spécificité de la réticulation du formaldéhyde avec coloration à l’argent.Une bande spécifique à l’échantillon bouilli est apparente. La flèche marque une bande qui a été analysée par MS. Analyse et qui a confirmé CPXR en tant que partenaire d’interaction de CPXA. Après avoir regardé cette vidéo, il devrait avoir une bonne compréhension de la façon de combiner la purification d’affinité pro et de réticulation à la spectrométrie de masse pour identifier les partenaires d’interaction des protéines membranaires.

membrane-spine-biochemical-tool-to-identify-protein-protein

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Cette vidéo montre des expériences avec l'analyse subséquente des interactions protéine-protéine par l'utilisation de micro-surfaces texturées. L'approche offre la possibilité de détecter les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et combine haute capacité de débit avec la possibilité d'extraire des informations quantitatives.

In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

Test interaction protéine-protéine est indispensable pour la dissection de la fonctionnalité des protéines. Ici, nous introduisons...

Essai de superposition des protéines membranaires: Un protocole pour tester l&#39;interaction entre les protéines solubles et insolubles In vitro</em

Résonance plasmonique de surface (SPR) est une méthode sans étiquette pour la détection des interactions biomoléculaires en temps réel. Ici, un protocole pour une protéine de la membrane: expérience de l'interaction du récepteur est décrite, tout en discutant les avantages et les inconvénients de la technique.

Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)

Ici, nous présentons un protocole pour déterminer l’orientation et la topologie des protéines membranaires intégrales dans les cellules vivantes. Ce protocole simple repose sur la sensibilité sélective de la protéase des chimères entre la protéine d’intérêt et la GFP.

Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

De nombreuses protéines remplissent leur fonction lorsqu’elles sont attachées à des surfaces membranaires. La liaison des protéines extrinsèques sur les membranes des nanodisques peut être imagée indirectement par microscopie électronique à transmission. Nous montrons que l’empilement caractéristique (rouleau) des nanodisques induit par la coloration négative phosphotungstate de sodium est empêché par la liaison de protéines extrinsèques.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Ici, nous présentons un protocole de fractionnement de la membrane du cerveau qui représente une procédure robuste pour isoler les protéines appartenant à différents compartiments synaptiques.

Fractionnement des membranes cérébrales: une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approche pour évaluer la localisation des protéines sous-synaptiques

Nous présentons ici un protocole visant à contrôler le montage et le démontage de la toxine du charbon à l’aide de biolayer l’interférométrie (BLI). Suite de montage/démontage sur la surface du biocapteur, les complexes de protéine importante sont dispensés de la surface pour la visualisation et l’identification des composantes des complexes à l’aide de la microscopie électronique et microanalyse, respectivement.

Analyse des Complexes protéiques dynamique assemblés sur et libéré de Biolayer interférométrie biocapteur à l’aide de la spectrométrie de masse et de microscopie électronique

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de digestion on-membrane pour la préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse. Cette technique facilite l'analyse pratique des interactions protéines-protéines.

Évaluation des interactions protéines-protéines à l'aide d'une technique de digestion on-Membrane

Présenté ici est un protocole pour la détermination de l’état oligomérique des protéines membranaires qui utilise un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène en conjonction avec la microscopie électronique.

Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane

Cette étude décrit la procédure de reconstitution du canal K+ sensible aux acides lié à la protéine membranaire TWIK (Task2) en nanodisques. L’assemblage réussi a été confirmé par la cryomicroscopie électron à particule unique, qui a permis de fournir des moyennes de classe bidimensionnelles bien définies.

Une technique pour stabiliser les protéines membranaires dans les nanodisques

Découvrez la méthode Membrane-SPINE pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires in vivo par réticulation chimique, purification d'affinité et spectrométrie de masse.

Membrane-SPINE: un outil biochimique pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires In Vivo

Explorer plus de vidéos