Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou In Vivo

L’objectif global de cette procédure est de surveiller les événements mitochondriaux uniques tels que les éclairs de superoxyde et les fluctuations de potentiel membranaire in situ ou in vivo afin d’obtenir une évaluation en temps réel de la fonction mitochondriale dans un contexte physiologiquement pertinent. Ceci est accompli en exposant d’abord le muscle squelettique dans le membre postérieur de la souris. Ensuite, des images confocales en accéléré des muscles squelettiques sont obtenues in vivo.

Ensuite, le cœur de la souris est perfusé et imagé à l’aide de la microscopie confocale. Enfin, les images sont traitées et les données sont analysées. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des flashs de superoxyde mitochondriaux uniques et des fluctuations de potentiel membranaire dans les muscles squelettiques, in vivo ou dans le cœur perfusé par le biais d’images confocales en accéléré et bidimensionnelles.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux muscles existants comme l’évaluation de la fonction mitochondriale dans l’isolement des mitochondries est que cette technique permet l’évaluation en temps réel de la fonction mitochondriale unique dans une condition physiologiquement pertinente. La démonstration de cette méthode est essentielle car l’imagerie confocale est difficile à apprendre car il s’agit d’une procédure plus raide et compliquée. Après avoir préparé une solution saline équilibrée isotonique ou IBSS, le tampon de lumière Krebs HENSEL, ou KHB et des instruments chirurgicaux selon le protocole textuel, anesthésez une souris avec une injection intrapéritonéale de Pentobarbital et effectuez un pincement des orteils pour confirmer que l’animal est sédatif.

À l’aide d’un rasoir, épilez les poils de l’une des pattes arrière avant de désinfecter le site avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, faites une incision sur la peau le long de la face externe du membre pour exposer les muscles de l’anémie gastrique. Ensuite, à l’aide d’une pince tranchante, soulevez doucement l’épimysium et utilisez des ciseaux pour faire une incision à travers celui-ci.

Disséquez davantage pour enlever l’épimysium et exposer les fibres musculaires en dessous. Ajoutez 500 nanomolaires de tétraéthyle, ester méthylique de domination de bâtonnet ou TMRM à l’IBSS et plongez le muscle dans la solution pendant 30 minutes. Après avoir chargé TMRM dans le muscle, lavez le muscle avec TMRM free IBSS à l’aide d’un objectif d’huile 40x.

Placez la souris sur le côté sur la platine du microscope confocal et retenez le membre arrière de sorte que le muscle squelettique exposé soit dans une chambre faite sur mesure contre la lamelle. Ensuite, appuyez doucement sur la jambe pour établir un contact étroit entre le tissu et la lamelle de couverture et immergez les muscles exposés dans l’IBSS en utilisant une profondeur de pixel de huit bits et un taux d’échantillonnage d’une seconde par image, enregistrez un balayage en série bidimensionnel du muscle. Collectez des images séquentielles en les excitant d’abord à 405 nanomètres et en les collectant à plus de 505 nanomètres.

Puis passionnant à 488 nanomètres tout en collectant à plus de 505 nanomètres. Pour l’excitation à double longueur d’onde de la MT. CCP YFP, utilise une excitation séquentielle à 405, 488 et 543 nanomètres et collecte des émissions à 505 à 5, 45,505 à 5, 45 et supérieures à 560 nanomètres, respectivement. Pour l’imagerie d’excitation à trois longueurs d’onde de M-T-C-P-Y-F-P et TMRM pour imager le cœur de la souris, injectez à l’animal 200 unités d’héparine.

Après avoir attendu 10 minutes et euthanasié la souris par thoracotomie, retirez rapidement le cœur, les poumons et le thymus qui y sont attachés. Transférez rapidement le tissu implanté dans le SCI glacé. Identifiez ensuite les lobes du thymus et épluchez-les délicatement.

Pour exposer l’aorte ascendante, retirez le poumon et le thymus et isolez l’aorte en retirant soigneusement tout tissu environnant. Ensuite, faites une incision à l’extrémité supérieure de l’aorte ascendante avant la première branche de l’arc aortique. Ensuite, à l’aide de deux micro-pinces de suture, tenez doucement la paroi de l’aorte pour exposer la lumière et placez-la soigneusement sur une canule.

Utilisez une pince à micro-vaisseaux pour maintenir l’aorte en place et attachez rapidement des sutures autour d’elle. Retirez la pince et utilisez une pince pour vérifier soigneusement que l’extrémité de la canule se trouve au-dessus de la racine aortique. Fixez des attaches supplémentaires si nécessaire pour maintenir le cœur en place.

Allumez la pompe péristaltique et perfuser le cœur. À raison d’un millilitre par minute, le cœur recommencera à battre lors de la perfusion. Après 10 minutes de stabilisation, perfuser le cœur avec 10 BLE micromolaires de statine et 100 à 500 nanomolaires TMRM.

Le rythme cardiaque ralentira au bout de 10 minutes. Ensuite, ajustez la position du système de perfusion et placez le cœur sur la platine du microscope équipé d’un adaptateur pour chauffer la chambre à 37 degrés Celsius. Ajoutez un millilitre de solution de perfusion de KHB dans la chambre pour immerger partiellement le cœur.

Utilisez une pompe péristaltique pour évacuer l’effluent de la chambre. En augmentant progressivement la vitesse de la pompe pour fournir un débit suffisant au cœur afin d’assurer un contact étroit du cœur avec le couvercle et pour supprimer davantage le rythme cardiaque, appliquez une légère pression sur le cœur. Imagez l’organe tel que décrit pour le muscle plus tôt dans cette vidéo, en ajustant le plan focal pour révéler l’image la plus claire possible.

À l’aide du module d’analyse physiologique du logiciel de microscope confocal. Commencez par ouvrir la base de données générée automatiquement, puis le fichier image 2D à analyser. Cliquez sur la région d’intérêt ou la moyenne du retour sur investissement.

Pour passer en mode moyen des ROI. Désactivez l’affichage des canaux à l’exception de CP YFP à 488 nanomètres pour sélectionner les flashs. Zoomez sur l’image et déplacez manuellement la barre de défilement pour lire les images 2D en série.

Ensuite, identifiez les flashs de superoxyde mitochondriaux uniques en localisant le site où le signal fluorescent augmente transitoirement. Utilisez l’outil de retour sur investissement approprié pour marquer les flashs, la trace montrant le changement de fluorescence en fonction du temps de chaque retour sur investissement apparaîtra à côté de l’image. Après avoir sélectionné tous les flashs, activez l’affichage des autres canaux.

Sélectionnez une ROI sur l’image à l’extérieur de la cellule pour la soustraction du signal d’arrière-plan. Produisez ensuite la fluorescence moyenne de chaque retour sur investissement avec les étiquettes de temps. Enregistrez le nombre de flashs dans chacun des fichiers d’image de numérisation en série, ainsi que la durée et la zone de balayage de la cellule.

Utilisez Excel pour calculer la fréquence du flash en nombre de flashs par 100 secondes et par surface de cellule de 1000 microns carrés. Pour calculer le temps d’amplitude jusqu’au pic et le temps de décroissance pour chaque flash. Utilisez un programme développé sur mesure pour l’analyse des paramètres Flash qui fait partie d’un programme développé sur mesure et écrit dans un langage de données interactif.

À l’aide de ce protocole, l’imagerie in vivo d’événements mitochondriaux uniques peut être réalisée dans les muscles squelettiques de souris anesthésiées, suivie d’une imagerie insi dans le cœur perfusé. Comme illustré ici. La TMRM, qui est un indicateur de potentiel de membrane mitochondriale, est souvent utilisée pour vérifier l’emplacement de M-T-C-P-P-Y-F-P et devrait montrer un chevauchement complet avec le signal M-T-C-P-Y-F-P.

Son spectre se distingue de celui du CP YFP et, en utilisant la méthode d’excitation séquentielle, les signaux d’émission de TMRM et M-T-C-P-Y-F-P ne brouilleront pas les uns avec les autres. Ces images démontrent qu’un seul flash de superoxyde mitochondrial accompagné d’une dépolarisation membranaire peut être identifié dans les images de balayage 2D en série, qui ont montré une augmentation transitoire de la fluorescence sur les signaux de fond dans les tissus musculaires squelettiques et le myocarde. Outre une haute résolution, une intensité de fluorescence adéquate est également requise.

Cela peut être réalisé en modulant l’intensité du laser et le gain dans les canaux collecteurs. En général, le signal de fluorescence basale de la cellule est réglé à un tiers à un quart de l’intensité maximale du canal. Étant donné que le niveau d’expression de M-T-C-P-Y-F-P et la charge de TMRM peuvent varier d’un animal à l’autre, il faut affiner les conditions d’imagerie pour chaque expérience, qu’il s’agisse de perturbations physiologiques ou pathologiques, telles que les substrats métaboliques.

La stimulation électrique indiquée ici et la reperfusion ischémique ont été utilisées pour montrer que l’activité flash du superoxyde répond aux changements de l’état métabolique cellulaire. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir une anesthésie appropriée de la bouche et l’état correct du cœur perfusé. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’ischémie et la fusion peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le dysfonctionnement mitochondrial lors d’une leucémie myocardique et d’une lésion de reperfusion.