Procédé de préparation de lame pour préserver l’architecture de chromatine tridimensionnelle de cellules germinales testiculaires

Cette méthode de préparation de lames tridimensionnelle préserve l’arrangement chromatinal 3D des cellules tel qu’il a été démontré avec des cellules germinales testiculaires de souris. Tout d’abord, perméez les tubules féreux pour éliminer les matériaux cytoplasmiques et améliorer l’accessibilité des réactifs de coloration tels que les anticorps et les sondes de poisson. Après avoir fixé les matériaux nucléaires, dissocier mécaniquement les cellules germinales à l’aide d’une pince et cytoser les échantillons sur des lames.

Ensuite, acquérez des données avec plusieurs sections Z pour couvrir un noyau en 3D lorsqu’elles sont appliquées stratégiquement à partir de préparations de lames 3D. En utilisant COT one RNA, les poissons peuvent montrer les ARN nucléaires naissants pour détecter les régions transcriptionnellement actives dans le noyau. J’ai développé cette méthode lorsque j’étais dans le laboratoire de gènes du Massachusetts General Hospital.

À cette époque, j’ai optimisé la méthode de préparation des lames pour l’analyse fluorescente de l’ARN du coton à l’hybridation, également appelée poisson pour détecter nacent. ARN. Les sondes en coton peuvent hybrider des séquences répétitives dans les introns et les tls et visualiser le site de transcription active. Les poissons RA du coton nécessitent la préservation de la distribution de l’ARN nucléaire.

Le point clé de cette bonne méthode de préparation est que les étapes de fixation doivent se dérouler L’étape de fixation. Pour éliminer le fond plasmique Cy, démêlez les tubules OUS d’un testicule rompu dans le PBS sur de la glace, transférez plusieurs morceaux de tubules de cinq à 10 millimètres de longueur à 500 microlitres de tampon CSK avec 0,5 % de tritton X 100, et incubez pendant six minutes sur de la glace. Transférez maintenant tous les tubules dans une solution à 4 % P-F-A-P-B-S dans un puits d’un plat à quatre puits et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, incubez tous les tubules dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Installez les chambres cyto spin et cyto spin pendant les périodes d’incubation à l’arrière d’une lame de verre, transférez tous les tubules dans 30 microlitres de PBS. Ensuite, à l’aide des pointes de deux pinces, déchirez les tubules en morceaux.

Hachez les tubules dans le sens horizontal en coupant les tubules entre les pointes de deux pinces et en tirant la pince horizontalement. Après avoir ajouté 30 microlitres de PBS, mélangez la suspension par pipetage, puis transférez-la dans un microtube à centrifuger et ajoutez du PBS à un volume total de 1,3 millilitre. Appliquez maintenant 100 microlitres de suspension dans chacune des chambres de spin cyto. Cyto.

Faites tourner les échantillons à 2000 tr/min pendant 10 minutes à température ambiante. Faites sécher les lames sur une paillasse de laboratoire pendant quelques minutes à température ambiante à l’aide d’un bocal coplan contenant du PBS. Lavez les lames pendant cinq minutes à température ambiante.

Transférez ensuite les lames à 70 % d’éthanol pendant au moins deux minutes. Dans une réaction de 20 microlitres, ajoutez 100 nanogrammes capturés, une sonde NA 1D, un complexe ribonucléotidique vanadyle de 20 millimolaires et un tampon d’hybridation. À l’aide d’un appareil PCR, incuber pendant 10 minutes à 80 degrés Celsius, suivi d’une préa.

Pas à genoux à 42 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Maintenant, déshydratez successivement les lames dans de l’éthanol à 80 % pendant deux minutes, puis à 100 % d’éthanol pendant deux minutes. Sécher complètement les lames sur la paillasse de laboratoire à température ambiante.

Placez maintenant la diapositive sur une chambre de boîte à pointes à 42 degrés Celsius. Ensuite, centrifugez brièvement les sondes nécessaires et pipetez-les directement sur les lames déshydratées. Placez délicatement une lamelle sur la lame pour l’étape d’hybridation d’au moins six heures à 42 degrés Celsius.

Préchauffez les solutions de lavage dans des bocaux coplan à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes au bain-marie à l’aide d’une lame de rasoir, retirez la lamelle du bord de la lame sans rayer les échantillons, immergez progressivement les lames dans la solution de lavage pendant cinq minutes chacune. En commençant par le premier pot coplan contenant deux XSSC et 50 % de forme amid, suivi du deuxième pot coplan contenant deux XSSC et 50 % de forme amid. Et puis les deux derniers pots contenant deux XSSC.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de support de montage DPI aux échantillons et placez une lamelle. Appuyez doucement sur la vitre de protection et épongez le support de montage supplémentaire avec un chiffon de nettoyage. Dans cette expérience, un poisson à ARN capturé a été réalisé pour détecter simultanément la transcription naissante et l’immunocoloration des protéines qui se localisent dans l’immunohistochimie du corps XY.

Sur cette PACU, le spermatocyte a détecté la protéine d’hétérochromatine CCB X un ainsi qu’une forme phosphorylée de la variante d’histone H deux A X sur le corps XY. Le poisson qui en résulte attrapé un signal accumulé sur les régions chromatiques dans des étalements de surface traités avec une solution hypotonique. La structure tridimensionnelle de la chromatine est perturbée et tous les axes chromosomiques myotiques peuvent être capturés dans un seul plan Z.

La préparation des lames 3D, cependant, préserve la structure intacte de la chromatine après cette procédure. Cette méthode de préparation appropriée est applicable aux poissons d’ADN et d’ARN d’immunofluorescence, ainsi qu’à la combinaison de ces méthodes de détection.