La méthode la Culture Slice pour la suite du développement des germes de dents dans explantation Culture

L’objectif global de l’expérience suivante est de suivre le développement des dents sur plusieurs jours. La culture ex plan in vitro est réalisée en disséquant la mandibule en développement de souris fœtales en tranches vivantes pour exposer les germes dentaires en développement dans un deuxième temps. Les tranches sont sélectionnées, placées sur des filtres au-dessus d’un milieu de culture et incubées pour permettre le développement.

Ensuite, les tranches sont marquées avec un traceur de lignée afin de suivre le mouvement cellulaire pendant la période de culture, des résultats sont obtenus qui montrent la nature dynamique des tissus dentaires tels qu’ils se développent au cours de la culture explan. Le principal avantage de cette technique par rapport à la culture d’explants conventionnelle est que les organes en développement interne, tels que les gemmes dentaires, peuvent être observés tout au long de leur développement dans le contexte des tissus environnants. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de hachage et de sélection peuvent être difficiles si la configuration de la machine ou l’orientation du tissu est imprécise.

Tout d’abord, préparez le milieu de dissection et de culture pour les organes embryonnaires en ajoutant 1 % de glutamate et 1 % de pénicilline streptomycine à 500 millilitres de milieu aigle modifié ECCO avancé F 12. Ensuite, comme décrit dans l’article vidéo de Takahashi Sumi, disséquez des embryons de souris entre les stades E 11.5 et E 15.5 du développement et placez-les dans une boîte de Pétri contenant un milieu frais. Ensuite, décapitez les embryons à l’aide d’une aiguille de tungstène stérile fraîchement aiguisée et transférez les têtes dans un plat frais de milieu pré-refroidi sur de la glace.

Ensuite, isolez les mandibules des têtes en plaçant une aiguille dans la cavité buccale et en coupant temporairement vers l’arrière de la tête. Conservez les mandibules isolées dans un milieu pré-refroidi sur de la glace avant d’être sectionnées. Avant de trancher le tissu de la mandibule, nettoyez le disque de montage et la lame du hachoir à tissus avec de l’éthanol à 70 % et assurez-vous que la lame affleure le disque de montage.

Lorsqu’elle tombe, la lame devra être remplacée après avoir coupé environ 200 mandibules, réglé la distance de coupe entre 200 et 400 micromètres en fonction de l’âge de l’échantillon, et selon que le germe de dent entier est nécessaire pour un embryon E 14.5 où l’isolement du germe de la dent est nécessaire, une distance de coupe de 250 micromètres est utilisée. Ensuite, transférez une mandibule sur le disque de montage en plastique et disposez-la de manière à ce que la langue en développement soit dans une orientation transversale frontale. Lorsque vous disséquez des molaires pour isoler les incisives, prélevez des tranches sagittales à travers la mandibule.

Une fois correctement orienté, retirez l’excès de milieu autour du tissu. À l’aide de papier filtre, cela enfoncera légèrement une mandibule qui le fixera en place sur le disque de montage. Immédiatement après le séchage avec le papier filtre, placez le disque sur la table circulaire en acier inoxydable du hachoir.

Réglez ensuite la force de la lame au maximum, allumez la machine et appuyez sur start. La table se déplace automatiquement de gauche à droite, tandis que le bras hachoir portant la lame est levé et abaissé jusqu’à 200 coups par minute. Une fois que le mouchoir a été complètement tranché, éteignez la machine.

Assurez-vous que le bras de la lame est en position relevée, puis retirez le disque. Assurez-vous de ne pas placer les doigts sous le bras de la lame ou de laisser la machine sans surveillance. Lorsque vous hachez du tissu, prenez le disque de montage et ajoutez immédiatement du fluide aux tranches sur le disque afin d’éviter un dessèchement excessif.

Ensuite, délogez soigneusement le tissu de la tranche du bas du disque à l’aide d’une aiguille en tungstène ou d’une pipette et pipetez-les dans une petite boîte de Pétri de milieu. Ensuite, séparez les coupes individuelles à l’aide d’une aiguille, puis sélectionnez les coupes de tissu contenant la zone d’intérêt au microscope stéréoscopique. Placez les tranches sélectionnées dans des plats de culture avec du frais, du moyen, préparez des grilles métalliques pour le système de culture en coupant des bandes mesurant quatre centimètres sur 1,5 centimètres à partir de feuilles d’acier inoxydable à armure toile.

Ensuite, percez un trou au centre à l’aide d’une perforatrice fixe standard et pliez les côtés de sorte que la grille s’adapte à plat sur le puits central et soit parallèle au fond du plat. Une fois que les grilles sont correctement formées, stérilisez-les dans un autoclave avant utilisation. Ensuite, préparez les plats de culture d’organes du puits central pour la culture en ajoutant deux millilitres d’eau d’autoclave dans le puits extérieur pour éviter la déshydratation.

Placez ensuite une grille métallique stérile au centre du plat. Coupez un morceau de membrane transparente en polyéthylène téréphtalate avec une taille de pores de 0,4 micromètre afin qu’il soit suffisamment grand pour couvrir le trou dans la grille. Placez ensuite la membrane découpée dans le plat avec une tranche de mandibule sélectionnée si vous souhaitez un traçage de lignée.

Préparez d’abord une aiguille capillaire en verre en tirant le verre avec un extracteur d’aiguille. Ensuite, cassez la pointe de l’aiguille et placez-la pointe vers le bas dans une solution de colorant lipophile telle que le dai eye ou le dai o, et aspirez une partie de la solution de colorant par capillarité. Après quelques minutes, placez l’aiguille remplie dans un support et fixez-la à un aspirateur buccal.

Positionnez la pointe de l’aiguille dans le milieu de culture de manière à ce qu’elle touche la zone à étiqueter, comme le follicule dentaire illustré ici. Ensuite, déplacez une petite quantité de colorant sur le tissu. Ensuite, transférez la tranche sur une platine de microscope fluorescent et vérifiez que la tranche est correctement étiquetée.

Une fois l’étiquette réussie, soulevez soigneusement la tranche sur le dessus de la membrane, puis transférez la membrane hors du milieu avec la tranche aplatie au centre. Placez ensuite le filtre sur le trou circulaire au centre de la grille à environ un millilitre de milieu de culture jusqu’au puits jusqu’à ce que le niveau de milieu soit au niveau de la membrane. À ce stade, ajoutez des protéines ou des inhibiteurs de petites molécules dans le milieu.

De plus, imagez la coupe pour un enregistrement de la morphologie au jour zéro à l’aide d’un microscope de dissection pour la meilleure photographie, visualisez les coupes avec une source de lumière par le dessous. Maintenez la vaisselle dans une atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius et changez le média tous les deux à trois jours à intervalles réguliers. Continuez à imager les cultures afin de suivre les progrès.

Voici une série d’images documentant le développement du premier follicule dentaire molaire, qui est marqué avec une coloration fluorescente pour les yeux. La tranche est une tranche frontale de 250 microns d’épaisseur disséquée à partir de la mandibule d’une souris en E 14,5. La dent, qui est délimitée par des points noirs, commence au stade de la coiffe au jour zéro.

Au quatrième jour, le germe de la dent a atteint le stade de la cloche et les cellules du follicule dentaire s’étendent en arc de cercle autour de l’émail externe en développement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures de l’embryon à la culture finale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser avec succès le développement des organes en culture.