Un modèle expérimental pour étudier la tuberculose-paludisme co-infection à transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis Et Plasmodium berghei

L’objectif général de cette procédure est d’établir un modèle de souris expérimental qui peut être utilisé pour étudier les ramifications de l’infection concomitante par la tuberculose et le paludisme in vivo. Ceci est accompli d’abord en exposant les animaux de laboratoire à em. Tuberculose contenant des gouttelettes d’aérosol infectieuses à l’aide d’un système d’exposition par inhalation.

Dans un deuxième temps, l’absorption du nombre souhaité de M tuberculosis est vérifiée par l’analyse CFU du tissu pulmonaire. Un jour après l’infection par aérosol, 40 jours plus tard, les souris sont exposées à des moustiques infectieux pour la transmission naturelle des sporozoïtes de plasmodium, qui se déposent sous toute la peau pendant le repas de sang. Dans la dernière étape, le développement du parasite du paludisme au stade sanguin est surveillé par l’analyse des taches de giemsa, des frottis sanguins.

En fin de compte, le fardeau de la tuberculose dans les poumons et le nombre de parasites dans le sang des animaux co-infectés peuvent être dénombrés pour déterminer l’évolution de la tuberculose et du paludisme respectivement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la co-infection tuberculose-paludisme, telles que : Comment la co-infection avec le parasite du paludisme influence-t-elle la pathogenèse et le contrôle de l’infection à Mycobacterium tuberculosis ? Ce protocole a été développé pour étudier l’impact de la co-infection par Odium buri sur la phase chronique de la tuberculose microbienne, une souris immunocompétente C 57 PL six.

Il peut également être appliqué à d’autres souches de souris, y compris les souris knock-out, ou utilisé avec d’autres espèces de mycobactéries ou d’odium. Commencez par réchauffer mycobacterium tuberculosis. Actions d’un titre CFU connu.

Lorsque les cellules sont décongelées, utilisez une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 27 pour mélanger soigneusement la suspension cinq fois afin de disperser les amas bactériens, en évitant la production d’aérosols, en fonction de la dose d’infection souhaitée, transférez le volume requis du stock mycobactérien dans un tube de 50 millilitres contenant du PBS stérile jusqu’à un volume final de six millilitres. Ensuite, placez les animaux de laboratoire individuellement dans des paniers en maille compartimentés. Placez les paniers dans la chambre d’aérosol circulaire et fermez le couvercle de la chambre.

Fixez l’unité de nébulisation Venturi aux trois joints à douille en acier inoxydable. Aspirez la suspension mycobactérienne dans une seringue de 10 millilitres, équipée d’une aiguille émoussée de calibre 18 et transportez la seringue jusqu’à la chambre d’aérosol dans une boîte de transport fermée. Retirez maintenant le capuchon à vis du nébuliseur et injectez soigneusement la suspension de mycobactéries dans l’appareil.

Prendre soin d’éviter la génération d’aérosols. Jetez la seringue dans un récipient pour objets tranchants contenant 2 % de Burton, puis fermez le nébuliseur. Faites fonctionner l’appareil d’inhalation lorsque le cycle est terminé.

Confirmez que la suspension de mycobactéries a été complètement nébulisée avant d’ouvrir la chambre d’aérosol. Mettez un casque respiratoire à épuration d’air motorisé, puis retournez les animaux dans leurs cages, stérilisez les paniers du nébuliseur et à l’intérieur de la chambre à aérosol un jour après l’infection par aérosol, placez les animaux témoins euthanasiés désignés sur du papier absorbant sur une planche de dissection dans une enceinte de biosécurité de classe deux, et désinfectez les souris avec de l’éthanol à 70 % pour chaque souris. Tout d’abord, faites une petite incision au milieu de l’abdomen, puis rétractez la peau sur la tête de l’animal.

Ensuite, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir l’abdomen et la cage thoracique. Retirez la paroi thoracique pour que les poumons soient accessibles, puis retirez-les. Transférez les poumons dans un tube de 15 millilitres avec deux millilitres de tampon d’homogénéisation, puis utilisez le piston d’une seringue de cinq millilitres pour filtrer le tissu à travers des tamis de 100 micromètres dans une petite boîte de Pétri

À l’aide d’une pipette d’un millilitre équipée d’un embout barrière, rincez le tamis plusieurs fois, puis répartissez environ 250 microlitres d’homogénat pulmonaire sur huit plaques de gélose. Utilisez des écarteurs jetables pour plaquer soigneusement les échantillons lorsque les plaques sont sèches. Sceller chaque assiette avec du perfil.

Enveloppez-les dans du papier d’aluminium et incubez-les debout à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre semaines. Pour infecter des souris naïves ou infectées par des mycobactéries avec le paludisme par des piqûres de moustiques, placez les animaux anesthésiés sur la moustiquaire des cages à moustiques, permettant aux moustiques infectieux de se nourrir à travers la membrane pour assurer une transmission réussie du sporozoïte. Laissez les souris sur les cages pendant 10 à 15 minutes.

Transférez les souris dans leurs cages sur une serviette en papier et couvrez-les d’une serviette en papier pour les garder au chaud jusqu’à ce qu’elles se réveillent de l’anesthésie. Tuez les moustiques en les vaporisant avec de l’éthanol à 70 % ou d’autres désinfectants à travers le filet de la cage et stérilisez les cages en les autoclavage. Pour surveiller le para, utilisez une aiguille pour percer l’extrémité de la veine de chaque animal infecté et prélever une goutte de sang.

À chaque extrémité d’une lame de verre, utilisez une autre lame pour tirer une goutte de sang sur la moitié de la longueur de la lame inférieure. Retournez ensuite la glissière d’étalement et utilisez l’autre bord pour le deuxième frottis. Placez les lames dans un support de coloration.

Fixez brièvement les frottis sanguins dans du méthanol absolu, puis séchez à l’air. Les diapositives ensuite, plongez les frottis dans Gizeh. Après 10 minutes, trempez les lames dans et hors des vees de teinture remplies d’eau déminéralisée à quelques reprises pour rincer l’excès de tache.

Enfin, faites sécher les lames à l’air libre en position verticale. L’infection induite par les sporozoïtes des animaux de laboratoire par les piqûres de moustiques entraîne un taux d’infection de 100 %, comme le confirme la présence de parasites sanguins quatre à cinq jours plus tard. Comme l’illustre le tableau, l’infection de souris naïves et infectées par la tuberculose par des piqûres de moustiques entraîne une infection cohérente et reproductible de tous les animaux d’un groupe expérimental.

En comparant les souris témoins précurseurs et naïves avec celles et les animaux co-infectés par Mycobacterium tuberculosis, on peut observer que la préperité est légèrement retardée. Chez les souris qui ont été pré-infectées par Mycobacterium tuberculosis chez les souris atteintes de Mycobacterium tuberculosis par l’utilisation d’un système d’exposition par inhalation, il en résulte un dépôt réussi de bactéries dans les poumons de l’animal avec une variabilité relativement faible entre les souris individuelles. Les charges mycobactériennes dans les poumons des souris infectées C 57 black six sont augmentées en présence de p burga.

En revanche, les souris co-infectées ont une paraémie réduite par rapport aux souris infectées par plasmodium. À la suite de cette procédure, des méthodes telles que la cytométrie en flux, la PCR Eliza ou des techniques histologiques peuvent être effectuées sur les tissus ou les fluides corporels d’intérêt pour disséquer les réponses immunitaires simultanément provoquées contre les parasites mal et les tubercules basi et leurs interactions chez l’hôte co-infecté. N’oubliez pas que travailler avec l’agent pathogène humain Microbacterium tuberculosis peut être extrêmement dangereux et que des mesures doivent être prises pour éviter l’exposition à des aérosols infectieux en tout temps.

Tous les travaux expérimentaux impliquant Microbacterium tuberculosis doivent être effectués dans des installations appropriées de niveau de biosécurité trois.