Name: Production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Découvrez la production et la purification de vecteurs dérivés d'adénovirus canins de type 2 (CAV2) pour la thérapie génique et la vaccination. Cette méthode permet d'obtenir des suspensions virales à haut titre pour des applications in vivo et in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu financièrement par des subventions de l’INSERM, du CNRS, de la Fondation pour la Recherche Médicale et de l’Agence Nationale pour la Recherche (ANR-10-Blanc-1322) à D.G-D ; le septième programme-cadre de la Commission européenne à B.K. ; M.S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de la FRM (programme « Equipe FRM 2009 ») ; C.B. a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’UE, dans le cadre de la convention de subvention numéro 245266 (Orbivac).

1. Construction d’un plasmide du génome CAV2 non réplicatif
Remarque : tous les plasmides décrits dans ce protocole ont été décrits précédemment7 et sont disponibles sur demande.
<ol>
	<li>Clonez le GOI dans le plasmide pShuttle, à l’aide d’enzymes de restriction appropriées, pour générer le pShuttle-GOI (Figure 1A).</li>
	<li>Digestion de 2 μg de pShuttle-GOI par AscI/PacI. La digestion libère le fragment Shuttle-GOI (~2,9 kbp + séquence GOI ORF) du squelette plasmidique (2,8 kbp).</li>
	<li>Purifier le fragment Shuttle-GOI après électrophorèse sur gel d’agarose, à l’aide du gel NucleoSpin et du kit de nettoyage PCR.</li>
	<li>En parallèle, digérer 1 μg de plasmide génomique pCAV2 par SwaI. Le plasmide pCAV2 contient un site SwaI unique situé dans la région E1 (Figure 1B). Inactiver thermiquement cette enzyme de restriction à 65 °C pendant 20 min.</li>
	<li>Transformer des bactéries E. coli BJ5183 compétentes avec 500 ng de fragment Shuttle-GOI purifié et 100 ng de plasmide pCAV2 linéarisé pour une recombinaison homologue (Figure 1B). Étaler sur des plaques LB-Amp. Incuber les plaques à 37 °C pendant au moins 20 heures.</li>
	<li>Effectuer une analyse PCR directement sur des colonies bactériennes à l'aide du mélange maître EmeraldAmp avec des amorces avant (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') et inverses (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'), dans les conditions de cycle suivantes : 10 min à 95 °C (pour un cycle), 95 °C pendant 1 min ; 58 °C pendant 1 min ; 72 °C pendant 1 min/kbp (pour 39 cycles), et enfin 5 min à 72 °C. Un produit de 1 kbp + séquence ORF GOI est amplifié à partir de clones positifs pCAV-GOI, alors qu’aucun produit PCR ne peut être détecté avec des clones négatifs.</li>
	<li>Inoculer au moins deux colonies positives pendant la nuit, chacune dans un milieu de 5 ml LB-amp à 37 °C dans un agitateur (220 tr/min).</li>
	<li>Extrayez les ADN plasmidiques à l’aide du kit plasmidique Nucleospin. Transformez les bactéries E. coli DH5α compétentes avec une aliquote de chaque préparation d’ADN. Étaler la suspension bactérienne sur des plaques LB-Amp et incuber toute la nuit à 37 °C.</li>
	<li>Inoculer deux colonies de chaque clone positif pendant la nuit dans un milieu de 3 ml LB-amp à 37 °C dans un agitateur (220 tr/min). Extrayez l’ADN plasmidique à l’aide du kit plasmidique Nucleospin.</li>
	<li>Digérer l’ADN résultant et le plasmide parental pCAV2 (en tant que contrôle) avec NdeI. Le modèle de restriction du pCAV2 parental est de 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp et 1,6 kbp. La cassette d’expression du GOI est insérée dans le fragment de 7,9 kbp et contient au moins un site NdeI, c’est-à-dire un dans la cassette et les sites potentiels présents dans le GOI.</li>
	<li>Sélectionnez les constructions positives et passez à l’étape 2 avec au moins 2 clones indépendants.</li>
</ol>
2. Transfection du plasmide du génome recombinant CAV2 en cellules DK-E1
Remarque : Les vecteurs non réplicatifs dérivés de CAV2 sont des organismes génétiquement modifiés classés comme Biosafety Level 2 (BSL-2), tandis que leur utilisation sur des modèles animaux est classée comme BSL-1. Veuillez utiliser des mesures de confinement et de manipulation des déchets appropriées, y compris un équipement de protection individuelle, et travailler sous des hottes à flux laminaire BSL-2.
<ol>
	<li>Un jour avant la transfection, ensemencez les cellules DK-E1 sur une plaque à 6 puits. Cultivez des cellules à 37 °C et à 5 % de CO2, dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une teneur élevée en glucose, contenant 7 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 1 mM de pyruvate de sodium et 100 U/ml de pénicilline/100 μg/ml de streptomycine. Les cellules doivent être confluentes à 70-80 % pour la transfection.</li>
	<li>Digérer 2 μg de plasmide pCAV-GOI avec AscI, pour libérer la séquence non virale du plasmide. Vérifiez le schéma de restriction résultant par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8 %. La digestion doit produire un fragment de ~31 kbp contenant le génome recombinant et un fragment de 2 kbp correspondant au squelette plasmidique.</li>
	<li>Mélangez l’ADN digéré avec 200 μl de tampon Jet Prime en faisant un vortex pendant 10 sec. Ajoutez 4 μl de Jet Prime et mélangez en vortex pendant 10 sec. Faites tourner brièvement pour éliminer les gouttelettes et incubez pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte sur les cellules. Secouez doucement les assiettes pour répartir uniformément le mélange et incubez à 37 °C.</li>
</ol>
3. Propagation du CAV2 recombinant
<ol>
	<li>Une semaine après la transfection, prélever les cellules et le milieu de culture dans un tube en polypropylène de 15 ml. Perturber les cellules par trois cycles de congélation-décongélation (-80 °C/37 °C) et éliminer le lysat par centrifugation pendant 10 min à 1 800 x g.</li>
	<li>Prélever le surnageant et le conserver à -20 °C pour la propagation ultérieure du virus.</li>
	<li>Infecter une monocouche confluente de 80 à 90 % de cellules DK-E1 cultivées dans un puits de plaque à 6 puits avec 0,5 ml du surnageant contenant le virus. Incuber à 37 °C pendant 1 h, sous une légère agitation. Retirer l’inoculum et le remplacer par 1,5 ml de DMEM complet contenant 5 % de SCA inactivé par la chaleur.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C pendant 3-4 jours. Les cellules doivent être surveillées quotidiennement pour détecter l’apparition d’un effet cytopathique (CPE, figures 2A-B). Si aucune EPC claire n’est visible, prélever les cellules après 4 jours de culture et répéter les étapes 3.1 à 3.4.</li>
	<li>Lorsqu’une EPC claire affecte la majorité des cellules, généralement après 2 à 4 cycles d’amplification virale, prélevez les cellules avec un milieu de culture et congelez-décongelez 3 fois comme décrit ci-dessus. Infecter 80 à 90 % de cellules DK-E1 confluentes cultivées dans trois boîtes de culture tissulaire de 10 cm de diamètre, en utilisant à chaque fois 0,5 ml de surnageant contenant le virus.</li>
	<li>Après 3 à 4 jours (lorsque l’EPC est terminée), prélever les cellules de ces boîtes de 10 cm, les perturber à nouveau par trois cycles de congélation-décongélation, éliminer le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 1 800 x g, recueillir le surnageant et les stocker à -20 °C pour une amplification CAV2 à grande échelle.</li>
</ol>
4. Purification CAV2 à grande échelle
<ol>
	<li>Infectez 80 à 90 % de monocouches confluentes de cellules DK-E1 cultivées dans quarante boîtes de culture tissulaire de 10 cm de diamètre. Pour chaque plat, utilisez 0,1 ml de surnageant contenant un virus dilué dans 1 ml de DMEM complet sans SCA. Incuber les cellules à 37 °C pendant 3 à 4 heures sous une légère agitation. Ajouter 5 ml de DMEM complet complété par 5 % de FCS.</li>
	<li>Incuber pendant 3 jours. Récoltez les cellules infectées dans les quarante boîtes de 10 cm dans des tubes en polypropylène de 50 ml. Cellules de granulés à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C et remises en suspension dans 15 ml de milieu DMEM.</li>
	<li>Perturbez les cellules par trois cycles de congélation-décongélation (-80 °C/37 °C). Éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 1 800 x g pendant 10 min et stocker le surnageant à -20 °C avant de purifier les particules virales.</li>
	<li>Préparez un gradient discontinu de CsCl dans un tube Ultra-Clear de 14 ml. Versez d’abord 2 ml de solution de CsCl (1,40 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate) au fond du tube. Ensuite, ajoutez lentement 2 ml de solution de CsCl (1,25 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate) sur la première solution.</li>
	<li>Chargez soigneusement le surnageant viral au-dessus du gradient CsCl. Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à 2-3 mm du haut. Centrifugeuse pendant 1,5 heure à 130 000 x g et 18 °C dans un rotor SW40 oscillant.</li>
	<li>Après centrifugation, deux bandes blanches sont clairement visibles à l’interface entre les couches de solution de 2 CsCl (Figure 2C). À l’aide d’une aiguille de 21 G et d’une seringue, prélever par perforation latérale la bande inférieure contenant les particules matures de CAV2. Essayez autant que possible d’éviter de collecter la bande supérieure, qui correspond à des particules virales vides.</li>
	<li>Préparez un gradient continu de CsCl dans un tube transparent de 14 ml en mélangeant les particules virales collectées avec une solution de CsCl (1,34 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate). Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à 2-3 mm du haut. Centrifugeuse pendant 18 heures à 130 000 x g et 18 °C dans un rotor SW40 oscillant.</li>
	<li>Après la centrifugation, prélever la bande blanche contenant le CAV2 par ponction latérale avec une seringue comme décrit ci-dessus. Encore une fois, essayez d’éviter de collecter la bande supérieure restante. Cela devrait être plus facile dans cette pente continue, qui sépare mieux les deux bandes. Le volume total de la suspension recueillie ne doit pas dépasser 2 ml.</li>
	<li>Équilibrez une colonne Sephadex G-25-10 avec 30 ml de PBS.</li>
	<li>Chargez la suspension virale et jetez l’eau courante.</li>
	<li>Eluté avec des fractions de 500 μl de PBS. Collectez les fractions 5 à 7, qui contiennent généralement les particules CAV2 dessalées. Les fractions contenant le virus peuvent être facilement identifiées car elles sont opalescentes. Ajouter 150 μl de glycérol dans les 1,5 ml de suspension de CAV2 et stocker dans des aliquotes à -80 °C.</li>
</ol>
5. Titrage du CAV2 par dilution finale
<ol>
	<li>Décongelez une aliquote de virus purifié sur de la glace et effectuez des dilutions en série de 10 fois (allant de 10-2-10-12) dans du DMEM sans sérum.</li>
	<li>Ajouter 50 μl de chaque dilution virale dans 5 puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 1,5 x 104 cellules DK-E1 dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 jours.</li>
	<li>Au jour 5 post-infection, surveiller l’apparition des CPE par observation microscopique (figures 2A-B). Les titres infectieux sont déterminés en doses infectieuses médianes de culture tissulaire (DTID50), à l’aide de la méthode statistique de Reed et Muench13.</li>
</ol>

<ol><li>Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+chimeras+for+gene+therapy%2C+vaccination%2C+and+oncolysis%3A+adenoviruses+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond.</a> Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).</li>
<li>Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).</li>
<li>Zak, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merck+Ad5%2FHIV+induces+broad+innate+immune+activation+that+predicts+CD8%28%2B%29+T-cell+responses+but+is+attenuated+by+preexisting+Ad5+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).</li>
<li>Paillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+non-human+adenoviruses+versus+human+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses.</a> Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).</li>
<li>Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+dissemination+in+the+mouse+nervous+system%2C+using+a+green+fluorescent+protein-expressing+Borna+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector.</a> J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).</li>
<li>Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+canine+adenovirus+type+2+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An update on canine adenovirus type 2 and its vectors.</a> Viruses. 2, 2134-2153 (2010).</li>
<li>Bouet-Cararo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenoviruses+elicit+both+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+against+rabies+following+immunisation+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep.</a> Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).</li>
<li>Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+transduction+of+neurons+throughout+the+rat+CNS+using+novel+helper-dependent+CAV-2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors.</a> FASEB J. 18, 391-393 (2004).</li>
<li>Deinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52, 293-305 (2006).</li>
<li>Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+neurons+by+canine+adenovirus+vectors+and+their+efficient+retrograde+transport+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo.</a> FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).</li>
<li>Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotropism+and+retrograde+axonal+transport+of+a+canine+adenoviral+vector%3A+a+tool+for+targeting+key+structures+undergoing+neurodegenerative+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes.</a> Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).</li>
<li>Chartier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli.</a> J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatography+purification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatography purification of canine adenoviral vectors.</a> Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).</li>
<li>Segura, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors.</a> Journal of virological. 163, 129-136 (2010).</li>
<li>Fernandes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+development+for+canine+adenovirus+type+2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors.</a> Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).</li>
<li>Huang, B., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+silencing+of+huntingtin+expression+by+shRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA.</a> Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).</li>
<li>Tordo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenovirus+based+rabies+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Canine adenovirus based rabies vaccines.</a> Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode simple décrite ici, adaptée de la technologie Ad5 bien documentée, permet la production efficace de vecteurs CAV2 non réplicatifs avec une capacité de clonage typique de ~4,2 kbp. En ce qui concerne les considérations de temps, un génome recombinant du CAV2 est généralement généré en deux semaines, alors qu’il faudra 5 semaines supplémentaires pour amplifier, purifier et titrer les suspensions virales.
Bien que la production du premier lot de vecteurs dérivés du CAV2 puisse sembler ...

Au cours des dernières décennies, les vecteurs dérivés d’adénovirus (Ads) ont prouvé leur efficacité pour la thérapie génique et la vaccination, ainsi que pour la virothérapie oncolytique 1. Les publicités sont des virus icosaédriques non enveloppés de la famille des Adenoviridae, qui ont été isolés chez des mammifères, des oiseaux, des reptiles, des amphibiens et des poissons. Depuis leur découverte en 1953, les AD ont été étudiés intensivement en tant que modèles pour étudier les interactions virus/cellules et, plus récemment, en tant que systèmes de distribution de gènes basés sur des vecteurs 2. En effet, les vecteurs basés sur les publicités offrent de nombreux avantages, tels que leur large gamme d’hôtes et leur biologie bien caractérisée, ainsi que la facilité avec laquelle ils peuvent être manipulés génétiquement et amplifiés pour une production à grande échelle.
Afin de surmonter les difficultés cliniques liées à l’immunité préexistante dans les populations humaines envers les vecteurs dérivés de l’Ads 3 humain, nous et d’autres avons commencé à dériver des vecteurs de l’Ads 4 non humain. De plus, les vecteurs adénoviraux non humains semblent être plus adaptés à la vaccination de masse en médecine vétérinaire que l’adénovirus de type 5 (Ad5) classiquement utilisé, car ils devraient être plus conformes aux exigences de sûreté et de sécurité lors de l’évaluation des risques par les autorités réglementaires nationales. À la fin des années 1990, nous avons décrit le premier CAV2 recombinant comme une alternative non humaine aux vecteurs dérivés de Ad5 5. Depuis lors, de nombreuses études ont confirmé le potentiel des vecteurs CAV2 pour le transfert de gènes thérapeutiques ou antigéniques (pour les revues 6,7). Comme les autres publicités, les vecteurs dérivés du CAV2 sont stables et peuvent être produits à des titres élevés, ce qui facilite leur utilisation in vivo. Ils sont également sûrs, car ils ne sont pas intégratifs, bien qu’ils permettent une expression transgénique in vivo (>1 an) de longue durée8. Remarquablement, et mieux que les sérotypes Ads humains, les vecteurs CAV2 se sont révélés être hautement neurotropes, avec un transport rétrograde très efficace dans les axones 9,10. Cette propriété intrinsèque a donné l’idée d’utiliser des vecteurs CAV2 recombinants pour transduire les neurones de zones cérébrales spécifiques qui sont difficilement accessibles aux vecteurs lentiviraux, jusqu’à présent couramment utilisés pour le transfert de gènes dans le système nerveux central 11.
Ici, nous décrivons un protocole simple et classique pour construire, produire et purifier des vecteurs CAV2 non répliquatifs dérivés de la souche Manhattan. Les génomes recombinants du CAV2 sont construits en clonant le gène d’intérêt (GOI) souhaité dans une cassette en aval du promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV), qui fournit une expression ubiquitaire. Les vecteurs CAV2 ont une capacité de clonage de ~4,2 kbp, ce qui permet d’exprimer de grands ADNc. Dans un second temps, cette cassette d’expression est insérée par recombinaison homologue à la place de la région E1 du génome du CAV2, conduisant à un virus non réplicatif (dlE1), tel que décrit initialement par Chartier et al. 12 Enfin, des particules virales sont produites lors de la transfection du plasmide génomique dans une lignée de cellules rénales canines exprimant CAV2-E1 (DK-E1) et sont amplifiées en série avant la concentration et la purification des stocks viraux. La méthode décrite ici utilise une ultracentrifugation en deux étapes dans des gradients de chlorure de césium (CsCl), qui permet l’enrichissement des particules infectieuses avec un titre final élevé (généralement supérieur à 1010 particules infectieuses par ml). La suspension virale est ensuite dessalée par chromatographie à travers des colonnes jetables Sephadex G-25 afin qu’elle soit finalement suffisamment pure pour être directement utilisée in vivo.

<table><tbody><tr><td>Enzymes de restriction</td><td>New England Biolabs</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Jet Prime kit de transfection</td><td>Polyplus</td><td>114-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BJ5183</td><td>bactéries Agilent</td><td>200154</td><td></td></tr><tr><td>-10 colonne de dessalage</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>EmeraldAmp polymérase</td><td>Takara</td><td>RR320A</td><td></td></tr><tr><td>Kit plasmide Nucleospin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740558.250</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel et PCR Nettoyage</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 14 ml, Ultra Clear</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td></td></tr></tbody></table>

production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Les vecteurs dérivés d’adénovirus (Ad) ont été largement utilisés pour le transfert de gènes à court ou à long terme, à la fois pour la thérapie génique et les applications vaccinales. En raison de l’immunité préexistante fréquente contre l’adénovirus humain de type 5 classiquement utilisé, l’adénovirus canin de type 2 (CAV2) a été proposé comme vecteur alternatif pour le transfert de gènes humains. La biologie bien caractérisée du CAV2, ainsi que sa facilité de manipulation génétique, offrent des avantages majeurs, notamment pour le transfert de gènes dans le système nerveux central, ou pour induire un large éventail de réponses immunitaires protectrices, de l’immunité humorale à l’immunité cellulaire. De nos jours, le CAV2 représente l’un des adénovirus non humains les plus attrayants pour une utilisation comme vecteur vaccinal. Ce protocole décrit une méthode simple pour construire, produire et titrer des vecteurs CAV2 recombinants. Après clonage de la cassette d’expression du gène d’intérêt dans un plasmide navette, le plasmide génomique recombinant est obtenu par recombinaison homologue dans la souche bactérienne E. coli BJ5183. Le plasmide génomique résultant est ensuite transfecté dans des cellules rénales canines exprimant les gènes CAV2-E1 complémentaires (DK-E1). Une amplification virale permet la production d’un stock viral important, qui est purifié par ultracentrifugation à travers des gradients de chlorure de césium et dessalé par dialyse. La suspension virale résultante a régulièrement un titre de plus de 10à 10 particules infectieuses par ml et peut être administrée directement in vivo.

La production de vecteurs viraux recombinants de CAV2 repose sur des techniques fondamentales mais essentielles de biologie moléculaire. Avant la production des vecteurs viraux, il est en effet nécessaire de construire un génome recombinant de CAV2 portant une cassette d'expression pour le transgène. Cette construction comporte deux étapes : premièrement, le gène d'intérêt (GOI) est cloné dans un plasmide intermédiaire sous forme de cassette d'expression (i.e. avec promoteur et signal de polyadénylation). Cet él...

Ces 15 dernières années, les vecteurs dérivés de l’adénovirus canin de type 2 (CAV2) ont prouvé leur efficacité à transduire des cellules in vitro et in vivo et sont largement utilisés pour la vaccination et la thérapie génique. Nous décrivons ici une procédure de construction, de production et de purification des vecteurs CAV2, donnant lieu à des suspensions virales à titre élevé.

Production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

L’objectif global de cette procédure est de construire, de produire et de purifier des vecteurs dérivés de l’adénovirus canin de type deux. Ceci est accompli en clonant d’abord le gène d’intérêt dans un plasmide de navette. La deuxième étape consiste à obtenir un plasmide génomique recombinant par recombinaison homologue.Ensuite, le veau recombinant défectueux, deux virus produits et amplifiés dans une lignée cellulaire trans complémentaire. La dernière étape consiste à purifier et à concentrer le virus recombinant résultant pour diverses applications in vivo et in vitro. En fin de compte, la microscopie confocale par immunofluorescence est utilisée pour montrer des exemples de transduction virale dans le cerveau des rongeurs.Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes telles que les vecteurs dérivés de la névrose humaine est qu’il n’y a pas d’immunité préexistante contre le veau deux dans les populations humaines. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la vaccination ou de la thérapie génique, comme l’évaluation du rôle des protéines exprimées dans des zones cérébrales spécifiques. Ainsi, May KY et Corin B

production-purification-non-replicative-canine-adenovirus-type-2

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons ici un protocole basé uniquement sur l'infection des cellules, ce qui améliore l'efficacité de la production parvovirus recombinant de plus de 100 fois par rapport à d'autres protocoles en cours d'utilisation. Ce protocole basé sur l'utilisation d'un adénovirus 5 nouvelle base auxiliaire contenant l'unité de transcription parvovirus VP (Ad-VP).

Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l&#39;aide d&#39;adénovirus dérivés Systems

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Un protocole de génération de vecteurs adénoviraux de grande capacité dépourvus de toutes séquences codantes virales est présenté. Le clonage des transgènes contenus dans le génome du vecteur est basé sur des endonucléases à tête chercheuse. L’amplification virale dans les cellules productrices cultivées en tant que cellules adhérentes et en suspension repose sur un virus auxiliaire fournissant des gènes viraux chez trans.

Clonage et Production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux Basé sur le type adénovirus humain 5

Nous décrivons ici une stratégie efficace et reproductible pour produire, titre et contrôle de la qualité des lots de vecteurs de virus adeno-associé. Il permet à l’utilisateur d’obtenir une préparation de vecteur avec haut-titre (≥1 x 1013 vecteur génomes/mL) et une grande pureté, prêt à être utilisé in vitro ou in vivo .

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Ici, nous présentons un protocole pour la production d’adénovirus en utilisant le système pAdEasy. La technologie comprend la recombinaison des plasmides pAdTrack et pAdEasy-1, l’emballage et l’amplification des adénovirus, la purification des particules adénoviraux du lysat cellulaire et du milieu de culture, le titrage viral et le test fonctionnel de l’adénovirus.

Une méthode efficace pour la production d’adénovirus

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production à grande échelle de vecteurs AAV de qualité recherche en utilisant des cellules HEK 293 adhérentes cultivées dans des piles de cellules et la purification par chromatographie d’affinité. Ce protocole donne systématiquement &gt;1 x 1013 génomes vectoriels/mL, fournissant des quantités vectorielles appropriées pour les études sur les grands animaux.

Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.

Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production, la purification et la quantification du virus recombinant à haut titre de la maladie de Newcastle. Ce protocole donne systématiquement &gt; 6 × 109 unités formant de la plaque / mL, fournissant des quantités de virus appropriées pour les études animales in vivo . Des tests de contrôle de la qualité supplémentaires pour assurer la sécurité in vivo sont décrits.

Production du virus recombinant de la maladie de Newcastle à haut titre à partir du liquide allantoïque

Ici, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est présenté, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs à l’aide de composants disponibles à des fins de recherche auprès de fournisseurs commerciaux.

Production de lots de vecteurs associés à l’adénographie à haut rendement à l’aide de cellules en suspension HEK293

Alors que le domaine de la thérapie génique continue d’évoluer, il existe un besoin croissant de méthodes innovantes capables de relever ces défis. Ici, une méthode unique est présentée, qui rationalise le processus de génération de vecteurs AAV à haut rendement et de haute pureté à l’aide d’une plate-forme d’usine de cellules, répondant aux normes de qualité des études in vivo .

Une procédure rationalisée et standardisée pour générer des vecteurs viraux adéno-associés de haute qualité et à forte teneur en titres à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire

Découvrez la production et la purification de vecteurs dérivés d'adénovirus canins de type 2 (CAV2) pour la thérapie génique et la vaccination. Cette méthode permet d'obtenir des suspensions virales à haut titre pour des applications in vivo et in vitro.

Production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2

Explorer plus de vidéos