Name: Production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Découvrez la production et la purification de vecteurs dérivés d'adénovirus canins de type 2 (CAV2) pour la thérapie génique et la vaccination. Cette méthode permet d'obtenir des suspensions virales à haut titre pour des applications in vivo et in vitro.

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Ce travail a été soutenu financièrement par des subventions de l’INSERM, du CNRS, de la Fondation pour la Recherche Médicale et de l’Agence Nationale pour la Recherche (ANR-10-Blanc-1322) à D.G-D ; le septième programme-cadre de la Commission européenne à B.K. ; M.S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de la FRM (programme « Equipe FRM 2009 ») ; C.B. a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’UE, dans le cadre de la convention de subvention numéro 245266 (Orbivac).

1. Construction d’un plasmide du génome CAV2 non réplicatif
Remarque : tous les plasmides décrits dans ce protocole ont été décrits précédemment7 et sont disponibles sur demande.
<ol>
	<li>Clonez le GOI dans le plasmide pShuttle, à l’aide d’enzymes de restriction appropriées, pour générer le pShuttle-GOI (Figure 1A).</li>
	<li>Digestion de 2 μg de pShuttle-GOI par AscI/PacI. La digestion libère le fragment Shuttle-GOI (~2,9 kbp + séquence GOI ORF) du squelette plasmidique (2,8 kbp).</li>
	<li>Purifier le fragment Shuttle-GOI après électrophorèse sur gel d’agarose, à l’aide du gel NucleoSpin et du kit de nettoyage PCR.</li>
	<li>En parallèle, digérer 1 μg de plasmide génomique pCAV2 par SwaI. Le plasmide pCAV2 contient un site SwaI unique situé dans la région E1 (Figure 1B). Inactiver thermiquement cette enzyme de restriction à 65 °C pendant 20 min.</li>
	<li>Transformer des bactéries E. coli BJ5183 compétentes avec 500 ng de fragment Shuttle-GOI purifié et 100 ng de plasmide pCAV2 linéarisé pour une recombinaison homologue (Figure 1B). Étaler sur des plaques LB-Amp. Incuber les plaques à 37 °C pendant au moins 20 heures.</li>
	<li>Effectuer une analyse PCR directement sur des colonies bactériennes à l'aide du mélange maître EmeraldAmp avec des amorces avant (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') et inverses (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'), dans les conditions de cycle suivantes : 10 min à 95 °C (pour un cycle), 95 °C pendant 1 min ; 58 °C pendant 1 min ; 72 °C pendant 1 min/kbp (pour 39 cycles), et enfin 5 min à 72 °C. Un produit de 1 kbp + séquence ORF GOI est amplifié à partir de clones positifs pCAV-GOI, alors qu’aucun produit PCR ne peut être détecté avec des clones négatifs.</li>
	<li>Inoculer au moins deux colonies positives pendant la nuit, chacune dans un milieu de 5 ml LB-amp à 37 °C dans un agitateur (220 tr/min).</li>
	<li>Extrayez les ADN plasmidiques à l’aide du kit plasmidique Nucleospin. Transformez les bactéries E. coli DH5α compétentes avec une aliquote de chaque préparation d’ADN. Étaler la suspension bactérienne sur des plaques LB-Amp et incuber toute la nuit à 37 °C.</li>
	<li>Inoculer deux colonies de chaque clone positif pendant la nuit dans un milieu de 3 ml LB-amp à 37 °C dans un agitateur (220 tr/min). Extrayez l’ADN plasmidique à l’aide du kit plasmidique Nucleospin.</li>
	<li>Digérer l’ADN résultant et le plasmide parental pCAV2 (en tant que contrôle) avec NdeI. Le modèle de restriction du pCAV2 parental est de 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp et 1,6 kbp. La cassette d’expression du GOI est insérée dans le fragment de 7,9 kbp et contient au moins un site NdeI, c’est-à-dire un dans la cassette et les sites potentiels présents dans le GOI.</li>
	<li>Sélectionnez les constructions positives et passez à l’étape 2 avec au moins 2 clones indépendants.</li>
</ol>
2. Transfection du plasmide du génome recombinant CAV2 en cellules DK-E1
Remarque : Les vecteurs non réplicatifs dérivés de CAV2 sont des organismes génétiquement modifiés classés comme Biosafety Level 2 (BSL-2), tandis que leur utilisation sur des modèles animaux est classée comme BSL-1. Veuillez utiliser des mesures de confinement et de manipulation des déchets appropriées, y compris un équipement de protection individuelle, et travailler sous des hottes à flux laminaire BSL-2.
<ol>
	<li>Un jour avant la transfection, ensemencez les cellules DK-E1 sur une plaque à 6 puits. Cultivez des cellules à 37 °C et à 5 % de CO2, dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une teneur élevée en glucose, contenant 7 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 1 mM de pyruvate de sodium et 100 U/ml de pénicilline/100 μg/ml de streptomycine. Les cellules doivent être confluentes à 70-80 % pour la transfection.</li>
	<li>Digérer 2 μg de plasmide pCAV-GOI avec AscI, pour libérer la séquence non virale du plasmide. Vérifiez le schéma de restriction résultant par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8 %. La digestion doit produire un fragment de ~31 kbp contenant le génome recombinant et un fragment de 2 kbp correspondant au squelette plasmidique.</li>
	<li>Mélangez l’ADN digéré avec 200 μl de tampon Jet Prime en faisant un vortex pendant 10 sec. Ajoutez 4 μl de Jet Prime et mélangez en vortex pendant 10 sec. Faites tourner brièvement pour éliminer les gouttelettes et incubez pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte sur les cellules. Secouez doucement les assiettes pour répartir uniformément le mélange et incubez à 37 °C.</li>
</ol>
3. Propagation du CAV2 recombinant
<ol>
	<li>Une semaine après la transfection, prélever les cellules et le milieu de culture dans un tube en polypropylène de 15 ml. Perturber les cellules par trois cycles de congélation-décongélation (-80 °C/37 °C) et éliminer le lysat par centrifugation pendant 10 min à 1 800 x g.</li>
	<li>Prélever le surnageant et le conserver à -20 °C pour la propagation ultérieure du virus.</li>
	<li>Infecter une monocouche confluente de 80 à 90 % de cellules DK-E1 cultivées dans un puits de plaque à 6 puits avec 0,5 ml du surnageant contenant le virus. Incuber à 37 °C pendant 1 h, sous une légère agitation. Retirer l’inoculum et le remplacer par 1,5 ml de DMEM complet contenant 5 % de SCA inactivé par la chaleur.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C pendant 3-4 jours. Les cellules doivent être surveillées quotidiennement pour détecter l’apparition d’un effet cytopathique (CPE, figures 2A-B). Si aucune EPC claire n’est visible, prélever les cellules après 4 jours de culture et répéter les étapes 3.1 à 3.4.</li>
	<li>Lorsqu’une EPC claire affecte la majorité des cellules, généralement après 2 à 4 cycles d’amplification virale, prélevez les cellules avec un milieu de culture et congelez-décongelez 3 fois comme décrit ci-dessus. Infecter 80 à 90 % de cellules DK-E1 confluentes cultivées dans trois boîtes de culture tissulaire de 10 cm de diamètre, en utilisant à chaque fois 0,5 ml de surnageant contenant le virus.</li>
	<li>Après 3 à 4 jours (lorsque l’EPC est terminée), prélever les cellules de ces boîtes de 10 cm, les perturber à nouveau par trois cycles de congélation-décongélation, éliminer le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 1 800 x g, recueillir le surnageant et les stocker à -20 °C pour une amplification CAV2 à grande échelle.</li>
</ol>
4. Purification CAV2 à grande échelle
<ol>
	<li>Infectez 80 à 90 % de monocouches confluentes de cellules DK-E1 cultivées dans quarante boîtes de culture tissulaire de 10 cm de diamètre. Pour chaque plat, utilisez 0,1 ml de surnageant contenant un virus dilué dans 1 ml de DMEM complet sans SCA. Incuber les cellules à 37 °C pendant 3 à 4 heures sous une légère agitation. Ajouter 5 ml de DMEM complet complété par 5 % de FCS.</li>
	<li>Incuber pendant 3 jours. Récoltez les cellules infectées dans les quarante boîtes de 10 cm dans des tubes en polypropylène de 50 ml. Cellules de granulés à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C et remises en suspension dans 15 ml de milieu DMEM.</li>
	<li>Perturbez les cellules par trois cycles de congélation-décongélation (-80 °C/37 °C). Éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 1 800 x g pendant 10 min et stocker le surnageant à -20 °C avant de purifier les particules virales.</li>
	<li>Préparez un gradient discontinu de CsCl dans un tube Ultra-Clear de 14 ml. Versez d’abord 2 ml de solution de CsCl (1,40 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate) au fond du tube. Ensuite, ajoutez lentement 2 ml de solution de CsCl (1,25 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate) sur la première solution.</li>
	<li>Chargez soigneusement le surnageant viral au-dessus du gradient CsCl. Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à 2-3 mm du haut. Centrifugeuse pendant 1,5 heure à 130 000 x g et 18 °C dans un rotor SW40 oscillant.</li>
	<li>Après centrifugation, deux bandes blanches sont clairement visibles à l’interface entre les couches de solution de 2 CsCl (Figure 2C). À l’aide d’une aiguille de 21 G et d’une seringue, prélever par perforation latérale la bande inférieure contenant les particules matures de CAV2. Essayez autant que possible d’éviter de collecter la bande supérieure, qui correspond à des particules virales vides.</li>
	<li>Préparez un gradient continu de CsCl dans un tube transparent de 14 ml en mélangeant les particules virales collectées avec une solution de CsCl (1,34 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate). Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à 2-3 mm du haut. Centrifugeuse pendant 18 heures à 130 000 x g et 18 °C dans un rotor SW40 oscillant.</li>
	<li>Après la centrifugation, prélever la bande blanche contenant le CAV2 par ponction latérale avec une seringue comme décrit ci-dessus. Encore une fois, essayez d’éviter de collecter la bande supérieure restante. Cela devrait être plus facile dans cette pente continue, qui sépare mieux les deux bandes. Le volume total de la suspension recueillie ne doit pas dépasser 2 ml.</li>
	<li>Équilibrez une colonne Sephadex G-25-10 avec 30 ml de PBS.</li>
	<li>Chargez la suspension virale et jetez l’eau courante.</li>
	<li>Eluté avec des fractions de 500 μl de PBS. Collectez les fractions 5 à 7, qui contiennent généralement les particules CAV2 dessalées. Les fractions contenant le virus peuvent être facilement identifiées car elles sont opalescentes. Ajouter 150 μl de glycérol dans les 1,5 ml de suspension de CAV2 et stocker dans des aliquotes à -80 °C.</li>
</ol>
5. Titrage du CAV2 par dilution finale
<ol>
	<li>Décongelez une aliquote de virus purifié sur de la glace et effectuez des dilutions en série de 10 fois (allant de 10-2-10-12) dans du DMEM sans sérum.</li>
	<li>Ajouter 50 μl de chaque dilution virale dans 5 puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 1,5 x 104 cellules DK-E1 dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 jours.</li>
	<li>Au jour 5 post-infection, surveiller l’apparition des CPE par observation microscopique (figures 2A-B). Les titres infectieux sont déterminés en doses infectieuses médianes de culture tissulaire (DTID50), à l’aide de la méthode statistique de Reed et Muench13.</li>
</ol>

<ol><li>Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+chimeras+for+gene+therapy%2C+vaccination%2C+and+oncolysis%3A+adenoviruses+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond.</a> Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).</li>
<li>Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).</li>
<li>Zak, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merck+Ad5%2FHIV+induces+broad+innate+immune+activation+that+predicts+CD8%28%2B%29+T-cell+responses+but+is+attenuated+by+preexisting+Ad5+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).</li>
<li>Paillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+non-human+adenoviruses+versus+human+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses.</a> Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).</li>
<li>Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+dissemination+in+the+mouse+nervous+system%2C+using+a+green+fluorescent+protein-expressing+Borna+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector.</a> J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).</li>
<li>Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+canine+adenovirus+type+2+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An update on canine adenovirus type 2 and its vectors.</a> Viruses. 2, 2134-2153 (2010).</li>
<li>Bouet-Cararo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenoviruses+elicit+both+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+against+rabies+following+immunisation+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep.</a> Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).</li>
<li>Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+transduction+of+neurons+throughout+the+rat+CNS+using+novel+helper-dependent+CAV-2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors.</a> FASEB J. 18, 391-393 (2004).</li>
<li>Deinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52, 293-305 (2006).</li>
<li>Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+neurons+by+canine+adenovirus+vectors+and+their+efficient+retrograde+transport+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo.</a> FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).</li>
<li>Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotropism+and+retrograde+axonal+transport+of+a+canine+adenoviral+vector%3A+a+tool+for+targeting+key+structures+undergoing+neurodegenerative+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes.</a> Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).</li>
<li>Chartier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli.</a> J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatography+purification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatography purification of canine adenoviral vectors.</a> Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).</li>
<li>Segura, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors.</a> Journal of virological. 163, 129-136 (2010).</li>
<li>Fernandes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+development+for+canine+adenovirus+type+2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors.</a> Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).</li>
<li>Huang, B., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+silencing+of+huntingtin+expression+by+shRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA.</a> Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).</li>
<li>Tordo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenovirus+based+rabies+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Canine adenovirus based rabies vaccines.</a> Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode simple décrite ici, adaptée de la technologie Ad5 bien documentée, permet la production efficace de vecteurs CAV2 non réplicatifs avec une capacité de clonage typique de ~4,2 kbp. En ce qui concerne les considérations de temps, un génome recombinant du CAV2 est généralement généré en deux semaines, alors qu’il faudra 5 semaines supplémentaires pour amplifier, purifier et titrer les suspensions virales.
Bien que la production du premier lot de vecteurs dérivés du CAV2 puisse sembler ...

Au cours des dernières décennies, les vecteurs dérivés d’adénovirus (Ads) ont prouvé leur efficacité pour la thérapie génique et la vaccination, ainsi que pour la virothérapie oncolytique 1. Les publicités sont des virus icosaédriques non enveloppés de la famille des Adenoviridae, qui ont été isolés chez des mammifères, des oiseaux, des reptiles, des amphibiens et des poissons. Depuis leur découverte en 1953, les AD ont été étudiés intensivement en tant que modèles pour étudier les interactions virus/cellules et, plus récemment, en tant que systèmes de distribution de gènes basés sur des vecteurs 2. En effet, les vecteurs basés sur les publicités offrent de nombreux avantages, tels que leur large gamme d’hôtes et leur biologie bien caractérisée, ainsi que la facilité avec laquelle ils peuvent être manipulés génétiquement et amplifiés pour une production à grande échelle.
Afin de surmonter les difficultés cliniques liées à l’immunité préexistante dans les populations humaines envers les vecteurs dérivés de l’Ads 3 humain, nous et d’autres avons commencé à dériver des vecteurs de l’Ads 4 non humain. De plus, les vecteurs adénoviraux non humains semblent être plus adaptés à la vaccination de masse en médecine vétérinaire que l’adénovirus de type 5 (Ad5) classiquement utilisé, car ils devraient être plus conformes aux exigences de sûreté et de sécurité lors de l’évaluation des risques par les autorités réglementaires nationales. À la fin des années 1990, nous avons décrit le premier CAV2 recombinant comme une alternative non humaine aux vecteurs dérivés de Ad5 5. Depuis lors, de nombreuses études ont confirmé le potentiel des vecteurs CAV2 pour le transfert de gènes thérapeutiques ou antigéniques (pour les revues 6,7). Comme les autres publicités, les vecteurs dérivés du CAV2 sont stables et peuvent être produits à des titres élevés, ce qui facilite leur utilisation in vivo. Ils sont également sûrs, car ils ne sont pas intégratifs, bien qu’ils permettent une expression transgénique in vivo (>1 an) de longue durée8. Remarquablement, et mieux que les sérotypes Ads humains, les vecteurs CAV2 se sont révélés être hautement neurotropes, avec un transport rétrograde très efficace dans les axones 9,10. Cette propriété intrinsèque a donné l’idée d’utiliser des vecteurs CAV2 recombinants pour transduire les neurones de zones cérébrales spécifiques qui sont difficilement accessibles aux vecteurs lentiviraux, jusqu’à présent couramment utilisés pour le transfert de gènes dans le système nerveux central 11.
Ici, nous décrivons un protocole simple et classique pour construire, produire et purifier des vecteurs CAV2 non répliquatifs dérivés de la souche Manhattan. Les génomes recombinants du CAV2 sont construits en clonant le gène d’intérêt (GOI) souhaité dans une cassette en aval du promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV), qui fournit une expression ubiquitaire. Les vecteurs CAV2 ont une capacité de clonage de ~4,2 kbp, ce qui permet d’exprimer de grands ADNc. Dans un second temps, cette cassette d’expression est insérée par recombinaison homologue à la place de la région E1 du génome du CAV2, conduisant à un virus non réplicatif (dlE1), tel que décrit initialement par Chartier et al. 12 Enfin, des particules virales sont produites lors de la transfection du plasmide génomique dans une lignée de cellules rénales canines exprimant CAV2-E1 (DK-E1) et sont amplifiées en série avant la concentration et la purification des stocks viraux. La méthode décrite ici utilise une ultracentrifugation en deux étapes dans des gradients de chlorure de césium (CsCl), qui permet l’enrichissement des particules infectieuses avec un titre final élevé (généralement supérieur à 1010 particules infectieuses par ml). La suspension virale est ensuite dessalée par chromatographie à travers des colonnes jetables Sephadex G-25 afin qu’elle soit finalement suffisamment pure pour être directement utilisée in vivo.

<table><tbody><tr><td>Enzymes de restriction</td><td>New England Biolabs</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Jet Prime kit de transfection</td><td>Polyplus</td><td>114-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BJ5183</td><td>bactéries Agilent</td><td>200154</td><td></td></tr><tr><td>-10 colonne de dessalage</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>EmeraldAmp polymérase</td><td>Takara</td><td>RR320A</td><td></td></tr><tr><td>Kit plasmide Nucleospin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740558.250</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel et PCR Nettoyage</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 14 ml, Ultra Clear</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td></td></tr></tbody></table>

production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Les vecteurs dérivés d’adénovirus (Ad) ont été largement utilisés pour le transfert de gènes à court ou à long terme, à la fois pour la thérapie génique et les applications vaccinales. En raison de l’immunité préexistante fréquente contre l’adénovirus humain de type 5 classiquement utilisé, l’adénovirus canin de type 2 (CAV2) a été proposé comme vecteur alternatif pour le transfert de gènes humains. La biologie bien caractérisée du CAV2, ainsi que sa facilité de manipulation génétique, offrent des avantages majeurs, notamment pour le transfert de gènes dans le système nerveux central, ou pour induire un large éventail de réponses immunitaires protectrices, de l’immunité humorale à l’immunité cellulaire. De nos jours, le CAV2 représente l’un des adénovirus non humains les plus attrayants pour une utilisation comme vecteur vaccinal. Ce protocole décrit une méthode simple pour construire, produire et titrer des vecteurs CAV2 recombinants. Après clonage de la cassette d’expression du gène d’intérêt dans un plasmide navette, le plasmide génomique recombinant est obtenu par recombinaison homologue dans la souche bactérienne E. coli BJ5183. Le plasmide génomique résultant est ensuite transfecté dans des cellules rénales canines exprimant les gènes CAV2-E1 complémentaires (DK-E1). Une amplification virale permet la production d’un stock viral important, qui est purifié par ultracentrifugation à travers des gradients de chlorure de césium et dessalé par dialyse. La suspension virale résultante a régulièrement un titre de plus de 10à 10 particules infectieuses par ml et peut être administrée directement in vivo.

La production de vecteurs viraux recombinants de CAV2 repose sur des techniques fondamentales mais essentielles de biologie moléculaire. Avant la production des vecteurs viraux, il est en effet nécessaire de construire un génome recombinant de CAV2 portant une cassette d'expression pour le transgène. Cette construction comporte deux étapes : premièrement, le gène d'intérêt (GOI) est cloné dans un plasmide intermédiaire sous forme de cassette d'expression (i.e. avec promoteur et signal de polyadénylation). Cet él...

Ces 15 dernières années, les vecteurs dérivés de l’adénovirus canin de type 2 (CAV2) ont prouvé leur efficacité à transduire des cellules in vitro et in vivo et sont largement utilisés pour la vaccination et la thérapie génique. Nous décrivons ici une procédure de construction, de production et de purification des vecteurs CAV2, donnant lieu à des suspensions virales à titre élevé.

Production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

L’objectif global de cette procédure est de construire, de produire et de purifier des vecteurs dérivés de l’adénovirus canin de type deux. Ceci est accompli en clonant d’abord le gène d’intérêt dans un plasmide de navette. La deuxième étape consiste à obtenir un plasmide génomique recombinant par recombinaison homologue.Ensuite, le veau recombinant défectueux, deux virus produits et amplifiés dans une lignée cellulaire trans complémentaire. La dernière étape consiste à purifier et à concentrer le virus recombinant résultant pour diverses applications in vivo et in vitro. En fin de compte, la microscopie confocale par immunofluorescence est utilisée pour montrer des exemples de transduction virale dans le cerveau des rongeurs.Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes telles que les vecteurs dérivés de la névrose humaine est qu’il n’y a pas d’immunité préexistante contre le veau deux dans les populations humaines. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la vaccination ou de la thérapie génique, comme l’évaluation du rôle des protéines exprimées dans des zones cérébrales spécifiques. Ainsi, May KY et Corin Bergeron feront la démonstration de cette procédure.Deux chercheurs postdoctoraux de nos laboratoires se préparent à cette procédure un jour avant la transfection en ensemenceant une cellule DKE sur une plaque à six puits de croissance des cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 dans du DMEM avec un taux élevé de glucose contenant 7 % de chaleur, un veau fœtal inactivé, du sodium sérique, du pyruvate, de la pénicilline et de la streptomycine. Le lendemain, les cellules doivent être confluentes à 70 à 80 % pour la transfection digérer deux microgrammes de pcal GOI le plasmide génomique recombinant cav deux avec ASC un pour libérer la séquence non virale du plasmide, vérifier le modèle de restriction résultant de 0,8 % La digestion par électrophorèse sur agro gel doit produire un fragment de paire d’environ 31 kilobases contenant le génome recombinant et un fragment de paire de deux kilobases correspondant au squelette plasmidique. Mélangez l’ADN digéré avec 200 microlitres de tampon d’amorçage de jet et de vortex pendant 10 secondes.Ajoutez quatre microlitres de jet prime et mélangez en vortex pendant 10 secondes. Tournez brièvement pour éliminer les gouttelettes et incubez pendant 10 minutes. À température ambiante, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte sur les cellules DKE one.Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément le mélange et incubez à 37 degrés Celsius. Une semaine après la transfection, prélever les cellules et le milieu de culture dans un tube en polypropylène de 15 millilitres. Perturbez les cellules par trois cycles de pensée de gel.Éliminer le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 1 800 fois G.Collecter le surnageant et le stocker à moins 20 pour la propagation ultérieure du virus pour propager le virus infecter une monocouche confluente de 80 à 90 % de DKE une cellule cultivée dans un puits d’une plaque à six puits avec 0,5 millilitres du virus contenant du surnageant. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure sous une légère agitation Après une heure. Retirez l’inoculum et remplacez-le par 1,5 millilitre de DMEM complet contenant 5 % de cellules d’incubation FCS inactivées par la chaleur à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre jours.Les cellules doivent être surveillées quotidiennement pour détecter l’apparition d’un effet cytopathique ou EPC. Si aucun CPE clair n’est visible. Récoltez les cellules après quatre jours de culture et répétez l’amplification virale lorsqu’une EPC claire affecte la majorité des cellules.Habituellement, après deux à quatre cycles d’amplification virale, prélevez des cellules avec un milieu de culture et congelez-les et décongelez-les trois fois, comme démontré précédemment. Infecter 80 à 90 % confluent. DKE : une cellule cultivée dans trois boîtes de culture tissulaire de 10 centimètres de diamètre en utilisant 1,5 millilitre de surnageant contenant le virus par boîte après trois à quatre jours lorsque l’EPC est terminée.Récoltez les cellules de ces plats de 10 centimètres de diamètre, perturbez-les par trois cycles de freestyle et éliminez le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 1 800 fois. G : collecter le surnageant et le stocker à moins 20 pour une amplification à grande échelle du Cav deux pour commencer la procédure de mise à l’échelle, infecter 80 à 90 % de monocouches confluentes de DKE one, des cellules cultivées dans 40 boîtes de culture tissulaire de 10 centimètres de diamètre pour chaque boîte, utiliser 0,1 millilitre de virus contenant du surnageant dilué dans un millilitre de DMEM complet sans FCS, incuber des cellules à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures sous une légère agitation. Après trois à quatre heures, ajoutez cinq millilitres de DMEM complet complété par 5 % de FCS et incubez pendant trois jours.Après trois jours, récoltez les cellules infectées dans les 40 boîtes de 10 centimètres dans des tubes en polypropylène de 50 millilitres, des cellules de granulés à 1, 200 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Resus les suspend dans 15 millilitres de milieu DMEM pour perturber les cellules par trois cycles de congélation-décongélation. Éliminer les débris cellulaires en centrifugeant à 1 800 fois G pendant 10 minutes.Stocker le surnageant à moins 20 avant la purification des particules virales pour la purification des particules virales. Préparez un gradient discontinu de chlorure de césium dans un tube UltraClear de 14 millilitres. Tout d’abord, versez deux millilitres de la solution de chlorure de césium de densité supérieure dans le fond du tube.Ajoutez ensuite lentement deux millilitres de la solution de chlorure de césium de faible densité sur la première solution. Chargez soigneusement le surnageant viral sur le gradient de chlorure de césium. Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à deux à trois millimètres de la centrifugeuse supérieure dans un rotor SW 40 oscillant pendant une heure et 30 minutes à 130 000 fois g et 18 degrés Celsius après centrifugation.Deux bandes blanches sont clairement visibles à l’interface entre les deux couches de solution de chlorure de césium. À l’aide d’une aiguille de calibre 21 et d’une seringue, prélever par perforation latérale la bande inférieure contenant les deux particules matures de cav. Essayez autant que possible d’éviter de collecter la bande supérieure qui correspond aux particules virales vides.Préparez un gradient continu de chlorure de césium dans un tube transparent de 14 millilitres en mélangeant les particules virales collectives avec une solution de chlorure de césium. Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à deux à trois millimètres de la centrifugeuse supérieure dans un rotor SW 40 oscillant pendant 18 heures à 130 000 fois G et 18 degrés. Après la centrifugation, prélever le veau blanc contenant la bande par ponction latérale avec une seringue comme démontré précédemment.Encore une fois, essayez d’éviter de collecter la bande supérieure restante. Cela devrait être plus facile dans cette pente continue qui sépare mieux les deux bandes. Le volume total de suspension collecté ne doit pas dépasser deux millilitres.Ensuite, équilibrez une colonne cidex G 25 10 avec 30 millilitres de PBS. Chargez la suspension virale sur la colonne et jetez le flux à travers l’élué avec des fractions de 500 microlitres de PBS collectant des fractions cinq à sept, qui contiennent généralement les deux particules de cav dessalées. Le virus contenant des fractions peut être facilement identifié car il y a des parfums bénis.Enfin, ajoutez 150 microlitres de glycérol aux 1,5 millilitres de suspension de CAV deux et stockez-les dans Eloqua à moins 80 degrés Celsius pour titrer le CAV deux par dilution finale, décongelez une aliquote de virus purifié sur de la glace et effectuez une dilution en série décuplée allant de 10 à moins deux à 10 à moins 12 dans du DMEM sans sérum. Ajoutez 50 microlitres de chaque dilution virale dans cinq puits d’une plaque de 96 puits, ajoutez 1,5 fois 10 à la quatrième DKE, une cellule pour chaque puits, incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant cinq jours au cinquième jour. Moniteur post-infection : apparition de l’EPC par observation microscopique.Les titres infectieux sont déterminés en tant que doses infectieuses médianes de culture tissulaire à l’aide de la méthode statistique Read et Men avant la production de vecteurs viraux. Un génome recombinant CAV deux portant une cassette d’expression pour le transgène est construit à l’aide de techniques de biologie moléculaire standard. Tout d’abord, le gène d’intérêt est cloné dans un plasmide navette sous la forme d’une cassette d’expression avec un promoteur précoce du cytomégalovirus et un signal de polyadénylation flanqué de deux séquences génomiques dérivées de deux CAV représentant les séquences cibles de recombinaison en amont et en aval.Dans un deuxième temps, la cassette d’expression est insérée à partir du plasmide de la navette dans le génome du CAV deux par recombinaison homologue. L’insertion de la cassette d’expression GOI conduira à la délétion de l’EA et d’une partie du gène E un B dans le génome recombinant. Une fois le plasmide génomique recombinant obtenu, des particules virales sont produites à l’aide de cellules CAV deux E un complétant DKE one.Un effet cytopathique clair dû à la grande quantité de particules virales produites dans les cellules infectées peut être facilement visualisé par la microscopie à fond clair ou par l’expression transgénique. Cet exemple est celui d’une GFP exprimant le vecteur CAV deux. Après plusieurs cycles d’amplification virale à l’aide de cellules DKE fraîches, les particules virales sont purifiées par ultracentrifugation sur des gradients de chlorure de césium.Les particules virales concentrées apparaissent sous la forme de deux bandes opalescentes dans le gradient de césium. La bande inférieure correspond au cav recombinant mature deux qui doit être collecté. Alors que la bande supérieure contient des particules vides non infectieuses qui doivent être évitées.Le vecteur, le vecteur, peut être utilisé pour transduire presque tous les types de cellules chez une grande variété d’espèces, in vitro ou in vivo. Voici un exemple d’application dans lequel la GFP exprimant le CAV deux a été injectée par des taxii stéréoscopiques dans différentes zones du système nerveux central de la souris. Étant donné que ce protocole produit un titre élevé et des stocks viraux purs et purs, l’injection d’aussi peu qu’un microlitre de GFP diluée par PBS exprimant le vecteur CAV deux dans le gyrus denté ou DG conduit à une transduction neuronale de 40 à 50 %.De plus, en raison de la capacité de C two à être rétrograde transporté dans les axones, l’injection de deux microlitres de GFP diluée PBS exprimant le vecteur CAV deux dans le striatum permet la transduction de près de 80 % des neurones NIGRO stri AAL dans les sous-marins, nigra pars compacta Après ses développements. Ces techniques ouvrent la voie aux chercheurs dans les domaines de la vaccinologie ou des neurosciences pour explorer de nouveaux antigènes et la fonction des gènes dans le cerveau dans de nombreux modèles animaux divers. N’oubliez donc pas que travailler avec des vecteurs dérivés de deux CAF peut être extrêmement dangereux et que des mesures de précaution, telles que des mesures de confinement et de manipulation des déchets appropriées, y compris l’équipement de protection individuelle et le travail dans des hottes à flux laminaire dans les deux laboratoires BSL doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Immunology and Infection

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Une méthode efficace pour la production d’adénovirus

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production à grande échelle de vecteurs AAV de qualité recherche en utilisant des cellules HEK 293 adhérentes cultivées dans des piles de cellules et la purification par chromatographie d’affinité. Ce protocole donne systématiquement &gt;1 x 1013 génomes vectoriels/mL, fournissant des quantités vectorielles appropriées pour les études sur les grands animaux.

Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.

Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production, la purification et la quantification du virus recombinant à haut titre de la maladie de Newcastle. Ce protocole donne systématiquement &gt; 6 × 109 unités formant de la plaque / mL, fournissant des quantités de virus appropriées pour les études animales in vivo . Des tests de contrôle de la qualité supplémentaires pour assurer la sécurité in vivo sont décrits.

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