Production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2

L’objectif global de cette procédure est de construire, de produire et de purifier des vecteurs dérivés de l’adénovirus canin de type deux. Ceci est accompli en clonant d’abord le gène d’intérêt dans un plasmide de navette. La deuxième étape consiste à obtenir un plasmide génomique recombinant par recombinaison homologue.

Ensuite, le veau recombinant défectueux, deux virus produits et amplifiés dans une lignée cellulaire trans complémentaire. La dernière étape consiste à purifier et à concentrer le virus recombinant résultant pour diverses applications in vivo et in vitro. En fin de compte, la microscopie confocale par immunofluorescence est utilisée pour montrer des exemples de transduction virale dans le cerveau des rongeurs.

Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes telles que les vecteurs dérivés de la névrose humaine est qu’il n’y a pas d’immunité préexistante contre le veau deux dans les populations humaines. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la vaccination ou de la thérapie génique, comme l’évaluation du rôle des protéines exprimées dans des zones cérébrales spécifiques. Ainsi, May KY et Corin Bergeron feront la démonstration de cette procédure.

Deux chercheurs postdoctoraux de nos laboratoires se préparent à cette procédure un jour avant la transfection en ensemenceant une cellule DKE sur une plaque à six puits de croissance des cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 dans du DMEM avec un taux élevé de glucose contenant 7 % de chaleur, un veau fœtal inactivé, du sodium sérique, du pyruvate, de la pénicilline et de la streptomycine. Le lendemain, les cellules doivent être confluentes à 70 à 80 % pour la transfection digérer deux microgrammes de pcal GOI le plasmide génomique recombinant cav deux avec ASC un pour libérer la séquence non virale du plasmide, vérifier le modèle de restriction résultant de 0,8 % La digestion par électrophorèse sur agro gel doit produire un fragment de paire d’environ 31 kilobases contenant le génome recombinant et un fragment de paire de deux kilobases correspondant au squelette plasmidique. Mélangez l’ADN digéré avec 200 microlitres de tampon d’amorçage de jet et de vortex pendant 10 secondes.

Ajoutez quatre microlitres de jet prime et mélangez en vortex pendant 10 secondes. Tournez brièvement pour éliminer les gouttelettes et incubez pendant 10 minutes. À température ambiante, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte sur les cellules DKE one.

Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément le mélange et incubez à 37 degrés Celsius. Une semaine après la transfection, prélever les cellules et le milieu de culture dans un tube en polypropylène de 15 millilitres. Perturbez les cellules par trois cycles de pensée de gel.

Éliminer le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 1 800 fois G.Collecter le surnageant et le stocker à moins 20 pour la propagation ultérieure du virus pour propager le virus infecter une monocouche confluente de 80 à 90 % de DKE une cellule cultivée dans un puits d’une plaque à six puits avec 0,5 millilitres du virus contenant du surnageant. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure sous une légère agitation Après une heure. Retirez l’inoculum et remplacez-le par 1,5 millilitre de DMEM complet contenant 5 % de cellules d’incubation FCS inactivées par la chaleur à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre jours.

Les cellules doivent être surveillées quotidiennement pour détecter l’apparition d’un effet cytopathique ou EPC. Si aucun CPE clair n’est visible. Récoltez les cellules après quatre jours de culture et répétez l’amplification virale lorsqu’une EPC claire affecte la majorité des cellules.

Habituellement, après deux à quatre cycles d’amplification virale, prélevez des cellules avec un milieu de culture et congelez-les et décongelez-les trois fois, comme démontré précédemment. Infecter 80 à 90 % confluent. DKE : une cellule cultivée dans trois boîtes de culture tissulaire de 10 centimètres de diamètre en utilisant 1,5 millilitre de surnageant contenant le virus par boîte après trois à quatre jours lorsque l’EPC est terminée.

Récoltez les cellules de ces plats de 10 centimètres de diamètre, perturbez-les par trois cycles de freestyle et éliminez le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 1 800 fois. G : collecter le surnageant et le stocker à moins 20 pour une amplification à grande échelle du Cav deux pour commencer la procédure de mise à l’échelle, infecter 80 à 90 % de monocouches confluentes de DKE one, des cellules cultivées dans 40 boîtes de culture tissulaire de 10 centimètres de diamètre pour chaque boîte, utiliser 0,1 millilitre de virus contenant du surnageant dilué dans un millilitre de DMEM complet sans FCS, incuber des cellules à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures sous une légère agitation. Après trois à quatre heures, ajoutez cinq millilitres de DMEM complet complété par 5 % de FCS et incubez pendant trois jours.

Après trois jours, récoltez les cellules infectées dans les 40 boîtes de 10 centimètres dans des tubes en polypropylène de 50 millilitres, des cellules de granulés à 1, 200 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Resus les suspend dans 15 millilitres de milieu DMEM pour perturber les cellules par trois cycles de congélation-décongélation. Éliminer les débris cellulaires en centrifugeant à 1 800 fois G pendant 10 minutes.

Stocker le surnageant à moins 20 avant la purification des particules virales pour la purification des particules virales. Préparez un gradient discontinu de chlorure de césium dans un tube UltraClear de 14 millilitres. Tout d’abord, versez deux millilitres de la solution de chlorure de césium de densité supérieure dans le fond du tube.

Ajoutez ensuite lentement deux millilitres de la solution de chlorure de césium de faible densité sur la première solution. Chargez soigneusement le surnageant viral sur le gradient de chlorure de césium. Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à deux à trois millimètres de la centrifugeuse supérieure dans un rotor SW 40 oscillant pendant une heure et 30 minutes à 130 000 fois g et 18 degrés Celsius après centrifugation.

Deux bandes blanches sont clairement visibles à l’interface entre les deux couches de solution de chlorure de césium. À l’aide d’une aiguille de calibre 21 et d’une seringue, prélever par perforation latérale la bande inférieure contenant les deux particules matures de cav. Essayez autant que possible d’éviter de collecter la bande supérieure qui correspond aux particules virales vides.

Préparez un gradient continu de chlorure de césium dans un tube transparent de 14 millilitres en mélangeant les particules virales collectives avec une solution de chlorure de césium. Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à deux à trois millimètres de la centrifugeuse supérieure dans un rotor SW 40 oscillant pendant 18 heures à 130 000 fois G et 18 degrés. Après la centrifugation, prélever le veau blanc contenant la bande par ponction latérale avec une seringue comme démontré précédemment.

Encore une fois, essayez d’éviter de collecter la bande supérieure restante. Cela devrait être plus facile dans cette pente continue qui sépare mieux les deux bandes. Le volume total de suspension collecté ne doit pas dépasser deux millilitres.

Ensuite, équilibrez une colonne cidex G 25 10 avec 30 millilitres de PBS. Chargez la suspension virale sur la colonne et jetez le flux à travers l’élué avec des fractions de 500 microlitres de PBS collectant des fractions cinq à sept, qui contiennent généralement les deux particules de cav dessalées. Le virus contenant des fractions peut être facilement identifié car il y a des parfums bénis.

Enfin, ajoutez 150 microlitres de glycérol aux 1,5 millilitres de suspension de CAV deux et stockez-les dans Eloqua à moins 80 degrés Celsius pour titrer le CAV deux par dilution finale, décongelez une aliquote de virus purifié sur de la glace et effectuez une dilution en série décuplée allant de 10 à moins deux à 10 à moins 12 dans du DMEM sans sérum. Ajoutez 50 microlitres de chaque dilution virale dans cinq puits d’une plaque de 96 puits, ajoutez 1,5 fois 10 à la quatrième DKE, une cellule pour chaque puits, incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant cinq jours au cinquième jour. Moniteur post-infection : apparition de l’EPC par observation microscopique.

Les titres infectieux sont déterminés en tant que doses infectieuses médianes de culture tissulaire à l’aide de la méthode statistique Read et Men avant la production de vecteurs viraux. Un génome recombinant CAV deux portant une cassette d’expression pour le transgène est construit à l’aide de techniques de biologie moléculaire standard. Tout d’abord, le gène d’intérêt est cloné dans un plasmide navette sous la forme d’une cassette d’expression avec un promoteur précoce du cytomégalovirus et un signal de polyadénylation flanqué de deux séquences génomiques dérivées de deux CAV représentant les séquences cibles de recombinaison en amont et en aval.

Dans un deuxième temps, la cassette d’expression est insérée à partir du plasmide de la navette dans le génome du CAV deux par recombinaison homologue. L’insertion de la cassette d’expression GOI conduira à la délétion de l’EA et d’une partie du gène E un B dans le génome recombinant. Une fois le plasmide génomique recombinant obtenu, des particules virales sont produites à l’aide de cellules CAV deux E un complétant DKE one.

Un effet cytopathique clair dû à la grande quantité de particules virales produites dans les cellules infectées peut être facilement visualisé par la microscopie à fond clair ou par l’expression transgénique. Cet exemple est celui d’une GFP exprimant le vecteur CAV deux. Après plusieurs cycles d’amplification virale à l’aide de cellules DKE fraîches, les particules virales sont purifiées par ultracentrifugation sur des gradients de chlorure de césium.

Les particules virales concentrées apparaissent sous la forme de deux bandes opalescentes dans le gradient de césium. La bande inférieure correspond au cav recombinant mature deux qui doit être collecté. Alors que la bande supérieure contient des particules vides non infectieuses qui doivent être évitées.

Le vecteur, le vecteur, peut être utilisé pour transduire presque tous les types de cellules chez une grande variété d’espèces, in vitro ou in vivo. Voici un exemple d’application dans lequel la GFP exprimant le CAV deux a été injectée par des taxii stéréoscopiques dans différentes zones du système nerveux central de la souris. Étant donné que ce protocole produit un titre élevé et des stocks viraux purs et purs, l’injection d’aussi peu qu’un microlitre de GFP diluée par PBS exprimant le vecteur CAV deux dans le gyrus denté ou DG conduit à une transduction neuronale de 40 à 50 %.

De plus, en raison de la capacité de C two à être rétrograde transporté dans les axones, l’injection de deux microlitres de GFP diluée PBS exprimant le vecteur CAV deux dans le striatum permet la transduction de près de 80 % des neurones NIGRO stri AAL dans les sous-marins, nigra pars compacta Après ses développements. Ces techniques ouvrent la voie aux chercheurs dans les domaines de la vaccinologie ou des neurosciences pour explorer de nouveaux antigènes et la fonction des gènes dans le cerveau dans de nombreux modèles animaux divers. N’oubliez donc pas que travailler avec des vecteurs dérivés de deux CAF peut être extrêmement dangereux et que des mesures de précaution, telles que des mesures de confinement et de manipulation des déchets appropriées, y compris l’équipement de protection individuelle et le travail dans des hottes à flux laminaire dans les deux laboratoires BSL doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.