Analyser la dynamique des protéines en utilisant l'hydrogène change spectrométrie de masse

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser la flexibilité de confirmation des protéines et les modifications de celle-ci en réponse à l’environnement, à la liaison des ligands ou aux interactions protéiques. Ceci est réalisé en pré-incubant la protéine d’intérêt dans différentes conditions qui sont suspectées d’influencer la confirmation de la protéine, telles que la liaison au ligand. Le mélange réactionnel est ensuite dilué dans de l’oxyde de deutérium, incubé pendant différents intervalles de temps, puis analysé par chromatographie en phase liquide par spectrométrie de masse pour déterminer le degré d’incorporation du deutéro dans le squelette peptidique.

Les groupes amides, parce que les aires protégées ont diminué l’incorporation de deutéros, la comparaison des spectres peptidiques de l’expérience en l’absence et la présence d’un partenaire de liaison révèle un décalage de l’OID des spectres en raison de la différence de poids entre le proton et le deutéron. Les régions qui présentent une protection importante après l’ajout d’un partenaire de liaison sont des sites de liaison potentiels. En fonction de la couverture de la séquence et de la disponibilité des peptides qui se chevauchent, les sites de liaison peuvent être réduits à quelques acides aminés.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du repliement des protéines et de la dynamique des protéines, telles que la façon dont les protéines se replient, comment elles se déplient, comment elles réagissent aux impacts physiques et chimiques comme l’augmentation de la température ou les métaux lourds. Comment la liaison assimilée et les interactions protéine-protéine peuvent influencer la confirmation d’une protéine. Il est également très important pour le développement de médicaments protéiques pour la vérification du bon repliement et pour le contrôle général de la qualité.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent rencontrer plusieurs difficultés. Si la protéine, par exemple, n’est pas bien digérée par la pepsine, la couverture de séquence sera faible. Si la protéine est très sujette à l’agrégation, elle peut s’agréger pendant l’incubation ou après l’ajout du tampon de trempe et entraînera de faibles intensités de signal dans le spectromètre de masse.

Dans cette démonstration, nous étudierons la liaison du chaperon moléculaire de levure, HP 90, à son cos-chaperon Sty one à l’aide de la spectrométrie de masse échangeuse d’hydrogène. Commencez cette procédure par la préparation des tampons, des échantillons et des billes comme indiqué dans le protocole de texte. Pour préparer les colonnes à l’échange d’hydrogène amide, dévissez un côté de la colonne de garde et retirez fermement le filtre.

Vissez l’entonnoir d’emballage sur l’extrémité ouverte de la colonne. Utilisez un adaptateur de 16e pouce pour fixer une seringue vide de cinq millilitres à la sortie inférieure de la colonne. Assurez-vous de le fixer hermétiquement au gaz à la colonne de garde.

Appliquez quelques gouttes de matériau de perle de boue sur le dessus de l’entonnoir. Tirez sur le piston de la seringue pour aspirer la boue à travers l’entonnoir dans la colonne de garde. Appliquez plus de matériau de perle de boue sur l’entonnoir et continuez la procédure jusqu’à ce que la colonne de garde soit complètement remplie de matériau de bille.

Retirez ensuite l’entonnoir avant de placer fermement le filtre et l’anneau filtrant sur l’extrémité ouverte. Vissez le capuchon de la colonne sur la colonne de protection et retirez la seringue de l’autre côté. Fermez les deux extrémités des colonnes de garde à l’aide de bouchons.

Pour éviter le dessèchement du matériau de la colonne, il faut mettre en place le système de spectrométrie de masse par échange d’hydrogène. Connectez d’abord la colonne de piège au système de chromatographie liquide haute performance ou HPLC. Équilibrez la colonne en réglant le débit de la pompe A à 0,4 millilitre par minute avec 0,1 % d’acide formique comme solvant.

Après avoir calibré le spectromètre de masse, connectez la sortie du HPLC à la source du spectromètre de masse. Pour déterminer d’abord les peptides peptiques, connectez la colonne Pepin, puis la colonne analytique au système. Configurez les paramètres de chromatographie et de spectrométrie de masse dans le logiciel de contrôle en choisissant le type de gradient et la méthode de spectrométrie de masse.

Choisissez un dégradé long pour assurer une bonne résolution chromatographique. Activez les spectres de masse en tandem sur le spectromètre de masse. Préparez 100 à 200 pomo de protéine de choc thermique 90 ou HSP 90 dans 100 microlitres de tampon H deux L.

Ajouter 100 microlitres de tampon de trempe et mélanger en pipetant de haut en bas. Injectez l’échantillon de 200 microlitres dans l’orifice d’injection de la soupape d’injection à l’aide d’une seringue Hamilton. Mettez la soupape d’injection en position d’injection et démarrez le programme de chromatographie.

Ensuite, identifiez les peptides peptiques de la protéine de choc thermique 90 en recherchant les peptides résultants dans une base de données. Réduisez la température du système à zéro degré Celsius en ajoutant de l’eau glacée. Répétez cette étape sans spectrométrie de masse en tandem et avec le gradient qui sera utilisé pour l’expérience d’échange d’hydrogène proprement dite.

Pour la protéine de choc thermique 90 et STI un, utilisez un gradient de 10 minutes de 90 % de solvant, un de 10 % de solvant B à 45 % de solvant, A 55 % de solvant B, déterminez les temps de rétention des peptides peptiques identifiés dans le gradient utilisé et créez une liste comprenant la séquence peptidique, la charge peptidique, l’état et le temps de rétention. Celui-ci sera utilisé pour identifier chaque peptide après des expériences d’échange d’hydrogène. Pour identifier les interfaces d’interaction protéine-protéine, il faut d’abord mettre en place la méthode de spectrométrie de gradient et de masse.

Dans le logiciel de contrôle, utilisez un gradient linéaire de 10 minutes allant de 90 % de solvant, de 10 % de solvant B à 45 % de solvant. Une charge de solvant B à 55 % est une méthode de spectrométrie de masse optimisée pour la détection entre 300 et 1 500 rapports masse/charge, bien que la plupart des peptides soient inférieurs au rapport masse/charge de 1000. Réglez la vanne d’injection en position de charge et la vanne à six orifices.

En position de dessalage de chargement, réglez le débit de la pompe de chargement à 0,4 millilitre par minute. Après avoir analysé la référence inchangée et l’échantillon de contrôle à 100 % comme décrit dans le protocole de texte, préparer 20 à 100 pimo de protéine de choc thermique 90 dans un volume de un à cinq microlitres. Ajoutez un tampon d’oxyde de deutérium ajusté à la température pour porter le volume de l’échantillon jusqu’à 100 microlitres à incuber pendant la période de temps exacte précédemment définie comme décrit dans le protocole de texte.

Lors de la détermination de la plage dynamique d’échange, ajoutez ensuite 100 microlitres de glace froide, tampon de trempe et pipette de haut en bas deux fois, injectez rapidement les 200 microlitres dans la vanne d’injection de la HPLC. Mettez la soupape d’injection en position d’injection et démarrez immédiatement le programme de chromatographie. Après deux minutes, basculez la vanne à six orifices de la position de chargement du dessalage à la position d’éluation.

Faites-le pour chaque protéine individuellement afin de déterminer l’incorporation de deutérons dans chaque peptide en l’absence de la protéine en interaction afin de déterminer la surface d’interaction mélanger la protéine de choc thermique 90 avec un excès d’au moins deux fois de STI un pour déplacer l’équilibre à l’état lié, incuber la température souhaitée jusqu’à ce que la formation complexe soit à l’équilibre. Après l’incubation, ajoutez un tampon d’oxyde de deutérium ajusté à la température pour porter le volume de l’échantillon à 100 microlitres et incubez pendant une période de temps définie. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon de trempe glacé et pipetez deux fois de haut en bas, injectez rapidement la protéine et exécutez comme précédemment.

Analysez les données acquises à l’aide d’un logiciel approprié et utilisez les temps de conservation déterminés pour trouver chaque peptide dans l’analyse. Calculez l’OID de la distribution isotopique pour la protéine inchangée et pour les expériences d’échange d’hydrogène, comparez l’incorporation des deutéros de la protéine cible seule et avec l’excès de partenaire de liaison. Cela peut être fait automatiquement avec un logiciel commercial ou manuellement avec le tableur M, l’interaction directe protéique entre HS P 90 et STI one a été testée en comparant les spectres peptidiques STI one en l’absence et en présence de HS P 90 suite au marquage à l’oxyde de deutérium.

Le graphique des différences qui en résulte révèle que la plupart des peptides de TPR deux A et TPR deux B présentent une forte protection en présence de HS P 90, indiquant que ces régions interagissent avec HS P 90. La protection dans le TPR deux A peut facilement être rationalisée à partir de la structure cristalline de STY un TPR deux A TPR deux B en complexe avec un peptide HS P 90, qui est coloré en fonction du nombre de protons amyloïdes protégés de l’incorporation de DEUTERO. Une telle protection claire dans les interactions protéine-protéine n’est pas toujours observée.

La protection dans HSP 90 en présence d’une IST n’est pas aussi prononcée et moins localisée que dans une IST un. Tous les peptides présentent une protection légèrement accrue grâce à l’incorporation deutéro. Voici une représentation graphique de la levure HS P 90 colorée en fonction du nombre de protons amli protégés de l’incorporation de deutéron, STY one stabilise HS P 90 globalement car aucune région de la protéine ne montre plus de flexibilité en sa présence.

Il n’est pas clair si cette incorporation réduite de deutérons provient d’une interaction directe avec l’orgelet un ou d’effets allostériques. Lors de la confirmation du marquage continu de HSP 90, l’échange d’hydrogène, la spectrométrie de masse a été utilisée pour étudier la dynamique de différentes régions protéiques. Voici les spectres des peptides 43 à 62 à partir du domaine de liaison nucléotidique de HSP 90.

En présence et en l’absence d’IST un, les spectres peptidiques montrent une incorporation de deutérium dépendante du temps qui augmente avec l’incubation plus longue. Le degré de protection change tout au long de la période d’incubation, montrant une plus grande différence aux périodes d’incubation plus courtes et des taux de change presque similaires au point de temps le plus long. Cela suggère un degré plus faible de stabilisation ou une région d’interactions dynamiques avec une dissociation et une association fréquentes.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir méticuleusement les conditions constantes et d’avoir tout prêt avant de commencer la réaction d’échange. Suite à cette procédure, d’autres méthodes peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’emplacement des sites d’interaction dans les complexes protéiques.