Name: Analyser la dynamique des protéines en utilisant lhydrogène change spectrométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T15:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez l'analyse de la flexibilité conformationnelle des protéines par spectrométrie de masse à échange d'hydrogène. Cette méthode permet d'identifier les sites de liaison et de caractériser les interactions protéine-ligand avec une haute résolution.

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Nous remercions M. Boysen des commentaires sur le manuscrit. Ce projet a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 et MA 1278/4-1 à MPM, et Cluster d&#39;excellence: CellNetworks EXC 81/1). MPM est enquêteur du Pôle d&#39;excellence: CellNetworks.

Une. Préparation de tampons et de protéines des échantillons <ol><li> Préparer H 2 O tampon. Utilisation Hsp90 tampon standard (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, glycerol à 10%) en tant que H 2 O tampon. Remarque: Si l&#39;échantillon a été dialysée avant l&#39;analyse, utiliser le tampon de dialyse H 2 O tampon. Il est essentiel que le tampon D O 2 se distingue de l&#39;H 2 O dans le tampon seul isotope de l&#39;hydrogène. Tampons volatils comme NH 4 CO 3 ou NH 4-acétate ou tampons composants ne sont pas adaptés! </li><li> Préparer D 2 O tampon par lyophilisation de tampon standard Hsp90 aide d&#39;un concentrateur sous vide. Après évaporation complète du H 2 O pur ajouter D 2 O pour le tube d&#39;atteindre le volume total initial (par exemple, 1 ml de tampon avec 15% de glycerol nécessite l&#39;addition de 850 ul de D 2 O). Répétez l&#39;évaporation complète de la mémoire tampon et dissoudre le tampon / sel comcomposants dans D 2 O 2x. </li><li> Préparer le tampon de trempe (0,4 M de KH 2 PO 4 / H 3 PO 4, pH 2,2). Remarque: Pour améliorer l&#39;efficacité de la digestion peptique de protéines très stables 4 M de chlorhydrate de guanidine et 0,5 M de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE-HCl) peuvent être ajoutés. </li><li> Préparer l&#39;échantillon de contrôle à 100% (6 M de chlorhydrate de guanidine, D 2 O). Ajouter le chlorhydrate de guanidine à une aliquote Hsp90 pour atteindre une concentration finale de 6 M. complètement évaporer H 2 O à partir de l&#39;échantillon et ajouter D 2 O pour le tube d&#39;atteindre le volume total initial (par exemple, 100 ul d&#39;échantillon avec 10% de glycerol nécessitent l&#39;addition 90 ul de D 2 O). Répétez l&#39;évaporation complète de la mémoire tampon et dissoudre les composants tampon / sel dans D 2 O. Remarque: 20-100 pmol de l&#39;échantillon sont nécessaires pour chaque injection. Préparer échantillon assez d&#39;avoir un contrôle à 100% pour chaque jour d&#39;expériences HX-MS. </li><li> Préparer 50 pmol Hsp90 dans 5 pl de tampon norme Hsp90. Note: Un montant de 20-100 pmol de l&#39;échantillon est nécessaire pour chaque point de données brutes. Le volume de l&#39;échantillon dans la réaction est de 1 à 5 pl idéalement. Ajuster la concentration pour s&#39;adapter à ces exigences. Tout tampon peut être utilisé tant qu&#39;il ne contient pas de détergents ou des composants volatils. </li></ol> 2. Préparation de la pepsine immobilisée sur aldéhyde Perles Activé <ol><li> Dissoudre 80 mg de pepsine frais dans mM de citrate de sodium à 2 ml 50 (pH 5). </li><li> Dissolvez 20 mg de cyanoborohydrure de sodium, manipuler avec soin (très toxique!) Dans 1 ml de 2 M Na 2 SO 4 et ajouter à la solution de pepsine. </li><li> Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante tout en agitant doucement (shaker par exemple les frais généraux). </li><li> Ajouter 600 mg de billes avec des groupes aldéhyde immobilisées au mélange et incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 2,2 ml de 2 M Na 2 SO4 (pH 5) en aliquotes de 100 pi toutes les 3 min plus d&#39;une heure de sel lentement la pepsine. Mélanger délicatement l&#39;échantillon entre les additions dans un agitateur vertical à température ambiante. </li><li> Incuber les perles de pepsine à 4 ° C pendant 14-16 h / pendant une nuit dans un agitateur de tête. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 1 ml d&#39;éthanolamine 1 M et une incubation à température ambiante pendant 2 h. </li><li> Centrifuger les billes dans un tube Falcon de 50 ml à 500 tours par minute, jeter le surnageant et remettre en suspension les billes dans de l&#39;acide formique à 0,1%. Répétez cette étape 2x. Après la dernière étape de centrifugation, éliminer le surnageant et le volume d&#39;estimation de billes. Ajouter un volume équivalent d&#39;acide formique à 0,1% et la stocker à 4 ° C. </li></ol> 3. Préparation des colonnes pour Amide hydrogène-échange <ol><li> Utilisez les colonnes de garde avec un diamètre intérieur de 1 mm pour le piégeage des colonnes et de 2 mm pour les colonnes de la pepsine. </li><li> Dévissez un côté de la colonne de garde et retirer le filtre. Vissez emballage funnel sur l&#39;extrémité ouverte de la colonne. Utiliser un adaptateur 1/16 de pouce et de tubes pour fixer une seringue vide (5 ml) à la sortie de fond de la colonne. Assurez-vous de fixer le gaz étanche à la colonne de garde. </li><li> Appliquer quelques gouttes de matière de tringle de suspension au-dessus de l&#39;entonnoir. Tirer le piston de la seringue pour aspirer la suspension à travers l&#39;entonnoir dans la colonne de garde. Appliquer plus de matière de tringle de suspension sur l&#39;entonnoir et poursuivre la procédure jusqu&#39;à ce que la colonne de garde est complètement remplie de matériau de la moulure. Retirez l&#39;entonnoir et placer le filtre et la bague de filtre sur l&#39;extrémité ouverte. Vissez le bouchon de colonne sur la colonne de garde et retirer la seringue de l&#39;autre côté. Fermez les deux extrémités des colonnes de garde avec des bouchons pour éviter le dessèchement du matériau de la colonne. </li></ol> 4. Configuration du système pour l&#39;hydrogène change spectrométrie de masse (HX-MS) <ol><li> Raccorder la colonne de piégeage avec le système HPLC (figure 1). Équilibrer la colonne en réglant la vitesse d&#39;écoulementUne pompe de 0,4 ml / min avec 0,1% d&#39;acide formique comme solvant. Ne branchez pas la colonne de pepsine, ni la colonne d&#39;analyse encore. </li><li> Calibrer le spectromètre de masse et connecter la sortie de l&#39;HPLC à la source du spectromètre de masse. </li></ol> 5. Détermination de la gamme dynamique de l&#39;échange <ol><li> Préparer ultrapure solvant A (acide formique à 0,1% dans l&#39;eau) et le solvant B ultrapure (acide formique à 0,1% dans de l&#39;acétonitrile); solvants mixtes préparés sont disponibles dans le commerce. Purger les pompes HPLC. Mettre en place la chromatographie et les méthodes de spectrométrie de masse dans le logiciel de commande par le choix d&#39;un programme avec un gradient par étape, après une courte étape de dessalage. Pour toute la longueur Hsp90 utiliser une étape de dessalage de 1-2 min, suivie par la commutation de la vanne 6 ports de dessaler / LOAD pour éluer et un gradient échelonné de 90% de solvant A/10% de solvant B à 5% de solvant A/95% de solvant B. Avant l&#39;injection réglé la soupape d&#39;injection de charge et la vanne 6 ports pour dessaler / position de chargement. Remarque: Ne pas utiliser un pepsine ou colonne d&#39;analyse au cours de cette expérience. </li><li> Préparer 100-200 pmol de Hsp90 dans 1-10 pi H 2 O tampon et incuber pendant 10 min à 30 ° C. Ajouter température ajustée D 2 O tampon pour amener le volume de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 100 pi et incuber exactement pour une période de temps définie (par exemple 10 s, 100 s, 1 000 s). Ajouter tampon de refroidissement de 100 pi et mélanger par pipetage de haut en bas. Injecter l&#39;échantillon de 200 ul dans l&#39;orifice d&#39;injection de la soupape d&#39;injection avec une seringue Hamilton. Démarrez le programme de chromatographie et de passer la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT à éluer. Répétez cette opération pour au moins trois points dans le temps. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.2 mais ajouter 2-3x plus de DIT1 à l&#39;échantillon Hsp90 avant l&#39;incubation pendant 10 min à 30 ° C. </li><li> Déterminer les masses de protéines de pleine longueur par la déconvolution des spectres dans le logiciel de spectrométrie de masse. Calculer le nombre de incorporanted deutérons en comparant le poids moléculaire de la protéine Hsp90 de longueur complète avec la masse observée après chaque passage (par exemple 10 s, 100 s, 1 000 s). </li><li> Tracer les deutons incorporés pour Hsp90 en absence et en présence de DIT1 (en ordonnée) en fonction du temps (axe des x). Déterminer le point de temps dans la plage dynamique où la différence entre les deux courbes est maximale. Utilisez cette valeur pour le temps d&#39;incubation dans D 2 O lors de l&#39;identification d&#39;interface et de la dynamique au niveau du peptide Hsp90-DIT1. </li></ol> 6. Détermination de gastroduodénal peptides utilisant MS / MS Spectra <ol><li> Raccorder la colonne de pepsine et de la colonne d&#39;analyse au système. </li><li> Configurer les paramètres de la chromatographie et de spectrométrie de masse dans le logiciel de commande, en choisissant le type et la méthode de gradient de spectrométrie de masse. Choisissez une longue pente (par exemple plus de 90 min) pour assurer une bonne résolution chromatographique. Activer spectres MS / MS sur le spectromètre de masse. Remarque: Bonne résolutiontion sur la HPLC et une grande précision de masse ont la plus haute priorité à cette étape. </li><li> Préparer 100-200 pmol de Hsp90 dans 100 ul de H 2 O tampon. Ajouter tampon de refroidissement de 100 pi et mélanger par pipetage de haut en bas. Injecter l&#39;échantillon de 200 ul dans l&#39;orifice d&#39;injection de la soupape d&#39;injection avec une seringue Hamilton. Démarrez le programme de chromatographie et de passer la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Remarque: Si plus d&#39;une protéine à analyser dans HX-MS (à savoir Les interfaces d&#39;interaction protéine-protéine), les peptides de chaque protéine doivent être déterminés individuellement. </li><li> Identifier des peptides peptiques de Hsp90 en recherchant une base de données (c.-à Mascot) pour les peptides résultants. Note: Il est possible d&#39;utiliser une base de données personnalisée que l&#39;objectif est de déterminer que de nombreux peptides peptiques que possible et l&#39;analyse se fait avec la protéine purifiée. Pureté échantillon have être pris en compte. </li><li> Répéter cette étape sans MS / MS et par le gradient qui sera utilisé pour l&#39;expérience de HX réelle. Pour Hsp90 et DIT1 utilisent un gradient de 10 min de 90% A/10 solvant% de solvant B à 45% de solvant A/55% de solvant B. Remarque: Les dégradés sont normalement entre 5-15 min et hautement tributaire de la complexité de l&#39;échantillon et les spécifications du système HX. </li><li> Déterminer les temps de rétention des peptides peptiques identifiés à la section 6.4 du gradient utilisé dans 6.5 et de créer une liste comprenant 1.) Séquence peptidique 2.) L&#39;état de charge de peptide et 3.) Temps de rétention. Ceci sera utilisé pour identifier chaque peptide après des expériences de HX. Note: Soyez conscient que les peptides avec petit m / z différences, l&#39;état de charge identique et temps de rétention identique peuvent être une source d&#39;ambiguïté. </li></ol> 7. Identification des interfaces d&#39;interaction protéine-protéine <ol><li> Mettre en place le gradient et la méthode de spectrométrie de masse dans le softwar de contrôlee. Utilisez un gradient linéaire de 10 min de 90% A/10 solvant% de solvant B à 45% de solvant A/55% B. solvant Charger une méthode de spectrométrie de masse qui est optimisé pour la détection de masses entre 300-1,500 m / z, bien que la plupart des les peptides seront en dessous de 1000 m / z. Réglez la soupape d&#39;injection en position de charge, la vanne 6 ports en CHARGEMENT / DESSALAGE position. Régler la vitesse de la pompe de chargement à 0,4 ml / min. Remarque: La longueur et le type de gradient sont échantillon dépendant et peut être optimisé. Gradients plus d&#39;améliorer la résolution de la chromatographie mais diminuent l&#39;incorporation de deutons en protéines dues à dos-échange. Les méthodes choisies doivent être les mêmes pour toutes les expériences à comparer. </li><li> Pour la référence de préparer non échangée de 20 à 100 pmol de Hsp90 dans 100 ul de H 2 O tampon. Ajouter 100 pi de tampon de refroidissement refroidi à la glace, une pipette de haut en bas et deux fois injecter l&#39;échantillon dans la soupape d&#39;injection de l&#39;HPLC. Démarrer immédiatement le programme de chromatographie et swdémanger la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Faites cela pour Hsp90 et DIT1 individuellement et pour le mélange de protéines. </li><li> Préparer 20 à 100 pmol de Hsp90 dans un volume de 1 à 5 pl. Ajouter température réglée D 2 O tampon pour porter le volume de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 100 pi et incuber exactement pour une période de temps définie (par exemple 30 secondes, pour dynamique conformationnelle voir la note). Ajouter 100 ul de tampon de refroidissement refroidi à la glace, une pipette de haut en bas et deux fois rapidement injecter les 200 pi dans la soupape d&#39;injection de l&#39;HPLC. Démarrer immédiatement le programme de chromatographie et de passer la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Pour ce faire, pour chaque protéine individuellement, afin de déterminer l&#39;incorporation de deutérium dans chaque peptide en l&#39;absence de la protéine d&#39;interaction. Remarque: Lors de l&#39;étude de la dynamique de conformationmational changements, répéter l&#39;expérience avec différents temps d&#39;incubation de Hsp90 dans D 2 O tampon. Essayez de couvrir une large échelle de temps en choisissant des temps d&#39;incubation de façon logarithmique (par exemple, 10 sec, 30 sec, 100 sec, 300 sec, sec 1000, etc.) O tampon D 2 de tampon et l&#39;échantillon doit être exactement identiques, sauf pour l&#39;isotope de l&#39;hydrogène. </li><li> Préparer une quantité égale de l&#39;échantillon de contrôle à 100% (20 à 100 pmol) et ajouter D 2 O tampon pour amener le volume de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 100 pi. Ajouter 100 ul de tampon de refroidissement refroidi à la glace, une pipette de haut en bas et deux fois rapidement injecter les 200 pi dans la soupape d&#39;injection de l&#39;HPLC. Démarrer immédiatement le programme de chromatographie et de passer la soupape d&#39;injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. </li><li> Pour déterminer la surface d&#39;interaction mélanger Hsp90 avec un excès d&#39;au moins 2 fois de DIT1 de déplacer l&#39;équilibre à l&#39;état consolidé (voir la note) et incuberà la température désirée jusqu&#39;à ce que la formation du complexe est à l&#39;équilibre. Ajouter température ajustée D 2 O tampon pour amener le volume de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 100 pi et incuber exactement pour une période de temps définie (par exemple 30 secondes). Ajouter deux fois rapidement et injecter dans la soupape d&#39;injection de la HPLC 100 ul de tampon de refroidissement par de la glace, une pipette de haut en bas. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Répétez cette expérience avec 20-100 pmol de DIT1 et l&#39;excès de Hsp90. Remarque: les concentrations absolues dépendent de la constante d&#39;équilibre de dissociation de l&#39;interaction. Idéalement, après dilution dans du D 2 O à la concentration de la protéine ajoutée en excès doit être d&#39;au moins 10 fois le K D (soit&gt; 85% de la protéine concentrée inférieur lié). </li><li> Analyser les données acquises avec un logiciel adapté et en utilisant les temps de rétention déterminés dans l&#39;étape 6.5 pour trouver chaque peptide dans l&#39;analyse. Calculte du centroïde de la distribution de l&#39;isotope pour la protéine non échangée (étape 7.2) et pour les expériences de HX (étape 7.3). Remarque: Bien que les modèles isotopiques de peptides échangés semblent différents de leurs homologues non échangées, à la fois les connaissances sur l&#39;état du peptide de charge et la précision de la masse élevée du spectromètre de masse permet de déterminer facilement les centres de gravité. </li><li> Comparer incorporation de deutons de protéine cible seul et avec plus de partenaire de liaison. Cela peut être fait automatiquement avec le logiciel commercial ou manuellement à l&#39;aide d&#39;un tableur. Les valeurs de l&#39;échantillon de contrôle de 100% indiquent l&#39;échange maximal pour chaque peptide et peuvent être utilisées pour déterminer la quantité de D 2 O étiquette perdue lors de l&#39;expérience à cause de l&#39;échange en arrière. </li></ol>

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<li>Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+conformations+can+be+probed+in+top-down+HDX+MS+experiments+utilizing+electron+transfer+dissociation+of+protein+ions+without+hydrogen+scrambling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Liaison d&#39;un partenaire d&#39;interaction d&#39;une protéine entraîne inévitablement des changements dans l&#39;accessibilité au solvant sur le site de liaison. En outre, de nombreuses protéines subissent des changements conformationnels dynamiques lors de la liaison, qui touchent d&#39;autres régions que l&#39;interface de liaison réelle. HX-MS est une méthode robuste pour surveiller ces changements et est même capable de révéler des changements conformationnels de protéines sur des échelles de temps que d&#39;autr...

Le nombre de structures cristallines des protéines et complexes de protéines a augmenté rapidement ces dernières années. Ils présentent des instantanés précieux de l'organisation structurelle de ces protéines et fournissent une base pour l'analyse structure-fonction. Cependant, la dynamique des protéines et les changements de conformation, qui sont essentielles pour leurs fonctions, sont rarement révélées par cristallographie aux rayons X. Cryo-microscopie électronique, d'autre part, est capable de capturer des complexes de protéines et des protéines dans des conformations différentes, mais en général ne peut pas résoudre les changements conformationnels jusqu'au niveau de la structure secondaire 1. Dynamique conformationnelle des protéines en solution à des détails atomiques ne peuvent être résolus par RMN, mais cette méthode reste limitée aux protéines de taille relativement petite (généralement ≤ 30 kDa) et les besoins des concentrations élevées de protéines (≥ 100 de pM), qui entrave expériences avec oligomérisation ou d'agrégation des protéines sujettes 2. Une méthode quiest capable de combler entre haute résolution cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique, et qui n'est pas limitée par la taille de la protéine ou de la concentration de l'hydrogène est l'amide-1 H / 2 H-échange (HX) en combinaison avec la spectrométrie de masse (MS). Ces dernières années, ce procédé a mis au point un outil d'analyse utile pour l'analyse de la dynamique des protéines, le repliement des protéines, la stabilité des protéines et des changements de conformation 3-5. La base moléculaire de cette méthode est la nature labile du squelette hydrogènes d'amide dans les protéines, qui vont échanger avec des atomes de deutérium lorsque la protéine est placé dans une solution de D 2 O. L'augmentation subséquente de la masse de la protéine au cours du temps est mesurée avec MS à haute résolution. En bref peptides non structurés ne HX dépend de la température, la concentration en catalyseur (OH -, H 3 O + ie pH, voir la figure 3) et des chaînes latérales d'acides aminés des résidus adjacents dues à inductive, chateffets alytic et stériques. Ces effets sur la valeur intrinsèque du taux de change chimique k ch ont été élégamment quantifiée par Bai et al. 6 et un programme est disponible (avec la permission Z. Zhang), qui calcule k ch pour chaque acide aminé dans un polypeptide dépend du pH et de la température. A pH neutre, et des températures ambiantes ch k est de l'ordre de 10 1 à 10 3 s -1. Dans les protéines pliées HX peut être 2-9 ordres de grandeur plus lentes principalement due à la liaison hydrogène dans la structure secondaire et à un degré moindre en raison de l'accès restreint de hydratés ions OH - à l'intérieur d'une protéine étroitement replié. HX en protéines natives implique donc déroulement, l'échange chimique partielle ou globale et repliement à l'état natif selon l'équation (1) et les taux de change observés k obs dépendent du taux d'ouverture k op, les taux de clôture k cl et l'échange chimique intrinsèque rate ch k selon l'équation (2). <img alt="Équations 1-2" src="/files/ftp_upload/50839/50839eq1-2.jpg"> Dans des conditions natives de l'Etat k op est beaucoup plus petit que k ch et peut être négligée dans le dénominateur. Il existe deux régimes de change extrêmes appelés EX1 et EX2. Si la cl k est beaucoup plus petit que k ch (EX1) du taux observé est pratiquement égale à la vitesse d'ouverture et de HX permet l'observation immédiate du déploiement d'un élément de structure. Un tel régime de change, où tout protons amide échange à la fois lors de l'ouverture de l'élément structurel, est facilement observable dans MS par une distribution bimodale des pics isotopiques 7. Si k cl est beaucoup plus grand que k ch (EX2) du taux observé est proportionnel à k ch lequel la constante de proportionnalité est égal aux équilibres de pliage-dépliage constante K = k u op cl. Dans ces conditions, beaucoup d'ouverture et de clôture des événements sont nécessaires avant tout échange de protons amide pour deutons, conduisant à une augmentation graduelle de la masse moyenne, tandis que la distribution isotopique reste à peu près le même. Le régime de EX2 permet la détermination de l'énergie libre de dépliement Ag u et donc la stabilité d'un élément de structure. Sous la condition native de l'Etat du régime de EX2 est la plus courante. Augmentation du pH et l'ajout d'agents chaotropiques peut changer le mécanisme de change pour EX1. Par conséquent, HX-MS peut être utilisée pour explorer thermodynamique ainsi que des paramètres cinétiques de repliement des protéines et des changements conformationnels. Comme mentionné ci-dessus HX est intrinsèquement dépendante du pH et de la température et de l'échange de demi-vie d'un proton complètement exposé au solvant du groupe amide du squelette est comprise entre 5 à 400 msec à pH physiologique (pH 7,6) et 30 ° C, mais à 10 min&gt; 15 h avec une moyenne de&gt; 2 h à pH 2,9 et à 0 °C (sauf pour le proton de la première épine dorsale liaison amide d'un polypeptide, qui échange avec une demi-vie de ca. 1-2 min). Dans ces conditions, l'échange lent, il est possible de digérer l'échantillon en utilisant des protéases (par exemple la pepsine) qui sont actives dans ces conditions, avec les perdre toutes les informations contenues dans les deutons incorporés. Depuis l'introduction de la digestion gastro-duodénal dans des conditions échanger lents, non seulement la cinétique de HX ensemble de protéines de pleine longueur peuvent être analysés mais HX peuvent être localisés à des régions spécifiques 8,9. La résolution spatiale est limitée à la taille des fragments peptiques générés, ce qui est en général comprise entre 10-30 résidus. Cependant, les fragments chevauchants créés en raison de la nature non spécifique de clivage par la pepsine pourraient conduire à une augmentation de la résolution spatiale. En outre, plusieurs autres proteases se sont révélés être actifs dans des conditions de trempe, cependant, beaucoup moins efficaces que la pepsine 10. En outre augsoi de la résolution spatiale peut être atteint par la fragmentation de peptides en phase de gaz par des méthodes qui ont préservé le modèle de deutération comme la capture d'électrons dissociation (DPE), transfert d'électrons dissociation (ETD) et infrarouge dissociation multiphotonique (IRMPD) 11-13. Ces techniques empêchent la perte de résolution spatiale due à la migration intramoléculaire de proton ("brouillage"), qui est observée par dissociation induite par collision (CID) de la technique de fragmentation le plus couramment utilisé. Cependant, ces méthodes nécessitent l'optimisation pour chaque peptide individuel et est donc encore assez difficile. HX-MS a été utilisé pour analyser les interactions protéine-ligand et la protéine-protéine, y compris l'assemblage de la capside virale 14-17. Protéines de repliage et dépliage ainsi que la température des changements conformationnels induits ont été étudiés 7,18,19. Phosphorylation et unique de conformation liée à la mutation d'acides aminés et modifie 16,20 nucleotchangements ide-induits ont été analysés 21,22. Par conséquent, cette méthode semble parfaitement adapté pour analyser l'assemblage et la dynamique des machines moléculaires. Un candidat intéressant, dont le mécanisme est d'un grand intérêt général, est le complexe chaperon Hsp90.

<table><tbody><tr><td>maXis QTOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nanoAcquity UPLC</td><td>Waters Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu 10AD-VP</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vanne 6 ports EPC6W avec actionneur microélectrique</td><td>Valco</td><td>#EPC6W</td><td></td></tr><tr><td>Vanne d’injection (manuel)</td><td>Rheodyne</td><td>#7725</td><td></td></tr><tr><td>Poros AL20</td><td>media Applied Biosystems</td><td>#1-6029-06</td><td></td></tr><tr><td>Poros R2</td><td>Applied Biosystems</td><td>#1-1118-02</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>#P6887</td><td>utiliser de la pepsine fraîche</td></tr><tr><td>Microbore (1 mm)</td><td>IDEX</td><td>#C-128</td><td></td></tr><tr><td>Microbore (2 mm)</td><td>IDEX</td><td>#C-130B</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C8</td><td>Column Waters Corp.</td><td>#186002876</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixeur</td><td>Eppendorf</td><td>#5355000.011</td><td></td></tr><tr><td>Tubes (différents diamètres)</td><td>Raccords IDEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>IDEX</td><td>#PK-110 avec PK-100</td><td></td></tr></tbody></table>

analyser la dynamique des protéines en utilisant l&#39;hydrogène change spectrométrie de masse

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Tous les processus cellulaires dépendent de la fonctionnalité des protéines. Bien que la fonctionnalité d&#39;une protéine donnée est la conséquence directe de la séquence d&#39;acides aminés unique, il ne se matérialise que par le repliement de la chaîne polypeptidique en une seule disposition tridimensionnelle définie ou plus couramment en un ensemble de conformations interconversion. Enquête sur le lien entre la conformation de la protéine et sa fonction est donc essentiel pour une compréhension complète de la façon dont les protéines sont en mesure de remplir leur grande variété de tâches. Une possibilité d&#39;étudier des changements de conformation d&#39;une protéine subit tout en progressant au travers de son cycle de fonctionnement est de l&#39;hydrogène H-1/2 H-échange, en combinaison avec la spectrométrie de masse à haute résolution (HX-MS). HX-MS est une méthode souple et robuste qui ajoute une nouvelle dimension à l&#39;information structurale obtenue par cristallographie par exemple. Il est utilisé pour étudier le repliement des protéines et le déploiement, la liaison de petit molecule ligands, les interactions protéine-protéine, des changements conformationnels liés à la catalyse enzymatique, et allostery. En outre, HX-MS est souvent utilisé lorsque la quantité de protéine est très limitée ou la cristallisation de la protéine n&#39;est pas réalisable. Ici, nous fournissons un protocole général pour étudier la dynamique des protéines avec HX-MS et décrivons comme un exemple pour révéler l&#39;interface d&#39;interaction des deux protéines dans un complexe.

Hsp90 est un chaperon moléculaire dans la levure et de la famille de Hsp90 chaperone. En passant par un cycle du complexe ATPase il assiste fin des étapes de pliage d'un grand nombre de protéines clients. Pliage efficace nécessite un transfert de clients de Hsp70 et de l'interaction de la Sti1/Hop co-chaperon. STI1 se lie directement à Hsp90 et facilite la liaison par inhibition de l'activité d'ATPase de la protéine Hsp90 client. Interaction de Hsp90 avec DIT1 a récemment été étudiée en utilisant HX-MS 23. Ic...

conformation des protéines et la dynamique sont essentielles pour comprendre la relation entre la structure et la fonction des protéines. l&#39;échange d&#39;hydrogène couplé à haute résolution spectrométrie de masse est une méthode polyvalente pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines ainsi que la caractérisation de la protéine-ligand et des interactions protéine-protéine, y compris les interfaces de contact et des effets allostériques.

Analyser la dynamique des protéines en utilisant l&#39;hydrogène change spectrométrie de masse

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser la flexibilité de confirmation des protéines et les modifications de celle-ci en réponse à l’environnement, à la liaison des ligands ou aux interactions protéiques. Ceci est réalisé en pré-incubant la protéine d’intérêt dans différentes conditions qui sont suspectées d’influencer la confirmation de la protéine, telles que la liaison au ligand. Le mélange réactionnel est ensuite dilué dans de l’oxyde de deutérium, incubé pendant différents intervalles de temps, puis analysé par chromatographie en phase liquide par spectrométrie de masse pour déterminer le degré d’incorporation du deutéro dans le squelette peptidique.Les groupes amides, parce que les aires protégées ont diminué l’incorporation de deutéros, la comparaison des spectres peptidiques de l’expérience en l’absence et la présence d’un partenaire de liaison révèle un décalage de l’OID des spectres en raison de la différence de poids entre le proton et le deutéron. Les régions qui présentent une protection importante après l’ajout d’un partenaire de liaison sont des sites de liaison potentiels. En fonction de la couverture de la séquence et de la disponibilité des pept

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MALDI-TOF spectrométrie de masse a été utilisé avec succès pour contrôler l'amide d'hydrogène / deutérium de change dans la protéine kinase PAK2 activation.

Amide hydrogène / deutérium Analyse Bourse &amp; MALDI-TOF spectrométrie de masse de PAK2 activation

Ici, nous présentons des protocoles détaillés pour la spectrométrie de masse par échange d’hydrogène/deutérium amide à l’état solide (ssHDX-MS) et la spectrométrie de masse de marquage photolytique à l’état solide (ssPL-MS) pour les protéines dans les poudres solides. Les méthodes fournissent des informations à haute résolution sur la conformation et les interactions des protéines à l’état solide amorphe, ce qui peut être utile dans la conception de formulations.

Spectrométrie de masse approches pour étudier la structure des protéines et interactions dans lyophilisées Poudres

flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l'utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l'échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Une des conditions de stress plus difficiles que les organismes se rencontrent au cours de leur vie implique l’accumulation d’oxydants. Au cours du stress oxydatif, cellules s’appuient fortement sur chaperons moléculaires. Nous présentons ici les méthodes utilisées pour enquêter sur l’oxydo-réduction-anti-agrégation activité réglementée, aussi bien quant à surveiller les changements structurels régissant la fonction d’accompagnateur à l’aide de HDX-MS.

Définition d’activité réglementée Redox chaperon de Hsp33 et de cartographie des changements conformationnels sur Hsp33 à l’aide de la spectrométrie de masse d’hydrogène deutérium Exchange

Les synthetases de lanthipeptide catalysent les réactions en plusieurs étapes pendant la biosynthèse des produits naturels peptidiques. Ici, nous décrivons un flux de travail continu, ascendant, de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) qui peut être employé pour étudier la dynamique conformationnelle des synthetases de lanthipeptide, aussi bien que d’autres enzymes semblables impliquées dans la biosynthèse de produit naturel de peptide.

Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

Présenté ici est un protocole pour une approche d’échange hydrogène/deutérium (HDX) basée sur l’électrophorèse capillaire couplée à une spectrométrie de masse descendante. Cette approche caractérise la différence dans les structures d’ordre supérieur entre différentes espèces de protéines, y compris les protéines dans différents états et différentes protéoformes, en effectuant une séparation différentielle simultanée HDX et électrophorétique.

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L’ensemble structurel de l’alpha-synucléine monomérique affecte sa fonction physiologique et ses propriétés physico-chimiques. Le présent protocole décrit comment effectuer une spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde et des analyses de données ultérieures pour déterminer des informations conformationnelles sur le monomère de cette protéine intrinsèquement désordonnée dans des conditions physiologiques.

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Un protocole permettant de caractériser la composition chimique de l’air expiré en temps réel en utilisant l’ionisation secondaire SPECTROMETRIE couplé à haute résolution, spectrométrie de masse est démontrée.

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Un protocole est décrit pour la synthèse manuelle des oligo-peptoids suivie par le séquençage par spectrométrie de masse.

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Spectrométrie de masse (MS) est devenue un outil important pour l’enquête de structure et la dynamique des assemblages macromoléculaires. Ici, nous intégrons les approches axées sur les MS pour interroger la formation de complexes protéiques et de liaison du ligand.

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Découvrez l'analyse de la flexibilité conformationnelle des protéines par spectrométrie de masse à échange d'hydrogène. Cette méthode permet d'identifier les sites de liaison et de caractériser les interactions protéine-ligand avec une haute résolution.

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