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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Maintien et élevage de la drosophile

<em>Drosophila</em> Maintenance

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila Maintenance

3.3: An Introduction to Caenorhabditis elegans

3.13: Yeast Transformation and Cloning

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08:46 min

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April 30, 2023

Overview

Drosophila melanogaster, communément connu comme la mouche des fruits, est un organisme modèle fréquemment utilisé pour la recherche des sciences de la vie. Bien que commencer une collection de ces créatures peut sembler aussi simple que de laisser une peau de banane sur votre comptoir de cuisine pendant trop longtemps, une colonie productive dans le laboratoire nécessite un élevage et maintenance soignes.

Cette vidéo montre les étapes nécessaires pour maintenir en sante une souche de mouche. L’aperçu commence par la préparation et l’entreposage de la levure et de la nourriture contenant du sucre comme source d’alimentation pour les mouches. Ensuite, les contenants les plus couramment utilisés pour l’élevage de la drosophile sont présentés, ainsi que comment et quand changer les mouches dans différent logis. Finalement, la présentation comprend également des exemples de la façon dont les conditions de logement et d’alimentation sont manipulées pour des expériences biologiques.

Procedure

Le succès des recherches sur Drosophila melanogaster repose sur un excellent entretien et élevage de ce précieux organisme modèle. La vidéo suivante discutera des mesures nécessaires pour assurer une bonne nutrition, un bon logement, et les manipulations appropriées de la mouche.

Bien que communément connu comme la mouche “des fruits”, Drosophila melanogaster subsiste réellement sur des micro-organismes tels que les levures, qui poussent sur les fruits fermentés. Dans le laboratoire, l’alimentation de la mouche est modifiée pour des raisons pratiques.

Plusieurs recettes sont disponibles, et elles contiennent (tous) toutes les éléments essentiels: le sucre et les levures. La recette suivante est tirée de l’Université d’Indiana à Bloomington, célèbre pour sa grande variété de souches de mouches. Elle se compose de: l’eau stérile, levures, farine de soja, farine de maïs jaune, agar pour la texture, le sirop de maïs, et l’acide propionique pour inhiber la croissance des moisissures et des bactéries. Ces ingrédients sont réunis, chauffé, agité, puis distribués à l’aide d’une pompe dans des éprouvettes en plastiques qui servent d’habitacle. Après être remplies, les éprouvettes sont bouchés avec une boule de coton, enveloppé, et refroidis à 4 dégrée Celsius. Une fois solidifié, la nourriture est stérilisée par autoclavage.

Maintenant que nous en (s’avons) savons un peu plus sur ce que les mouches mangent, (nous allons jeter un coup d’œil à) regardons là où ils vivent et comment elles sont manipulées.

Une variété de contenants est utilisée pour loger les mouches. Les éprouvettes sont utilisées pour l’élevage de la mouche et contiennent de manière optimale 50 à 100 adultes. Les bouteilles sont utilisées pour les cultures plus grandes et contiennent de 300 à 600 mouches adultes. Les incubateurs régulent l’environnement et sont capables de contenir des centaines d’éprouvettes et de bouteilles. Les conditions normales d’élevage pour les mouches sont 25 dégrée Celsius et 60-65% d’humidité relative.

Lorsque l’on travaille avec des mouches, il est important de maintenir une identification et une documentation appropriées, et de maintenir un environnement propre afin de maintenir l’intégrité des souches de mouches et des différentes expériences. L’habitacle doit être changé lorsque près de la moitié des pupes ont éclos, ou ont abandonné le boîtier pupal. Les boîtiers apparaîtront clairs.

Pour votre information, le stade de pupe se produit entre les stades larvaire et adulte, et c’est le moment où les larves muent et se développe en un adulte. Pour clairement identifier les boitiers pupaux, maintenez le contenant devant une source de lumière et (d’inspecter) inspectez la pupe.

Les mouches sont transférés dans des éprouvettes avec de la nourriture fraiche via un processus appelé « retourner les mouches » Avant de retournes les mouches, il faut inspecter l’intégrité de la nourriture. Les mouches ne peuvent pas survivre sur la nourriture craqué par assèchement ou contaminés par des moisissures ou des bactéries.

Pour retourner les mouches, taper d’abord gentiment l’éprouvette sur le comptoir pour faire descendre les mouches au fond. Ensuite, retirez rapidement le bouchon, et inverser l’éprouvette contenant les mouches dans une nouvelle éprouvette. Ce processus se fait rapidement, pour éviter aux mouches de s’échapper ou d’être écrasé par le bouchon, et pour empêcher les mouches libres de pénétrer dans l’éprouvette lors du retournement.

Bien que retourné les mouches est la méthode préférée pour le transfert en large quantité de la drosophile, l’anesthésie est nécessaire pour le tri des mouches. Deux méthodes d’anesthésie seront discutés ici: le refroidissement, et (en utilisant) l’utilisation du dioxyde de carbone. Pour refroidir les mouches placer l’éprouvette dans un congélateur a -20 dégrée Celsius pendant 8-12 minutes. Ensuite placer les mouches sur une surface réfrigérée, pour la sélection. Les mouches peuvent aussi être anesthésiées par le froid en les refroidissant directement sur une surface gelée.

Le dioxyde de carbone est une méthode pratique pour l’anesthésie, car il ne provoque pas de mortalité chez les mouches et n’est pas dangereux pour le chercheur. Le système de distribution de CO2 se compose: d’une bonbonne de CO2, un tube relié à une aiguille, pour anesthésier les mouches dans des éprouvettes et bouteilles, et un tube relié à une plaque de CO2 pour l’analyse au microscope.

Pour anesthésier les mouches, insérer l’aiguille de CO2 à travers le bouchon. Sinon, tapez l’éprouvette sur le comptoir, enlever le bouchon, et inverser rapidement l’éprouvette sur une plaque de CO2, en gardant l’éprouvette fermé jusqu’à ce que les mouches soient immobiles. Avec un pinceau ou une pince, déplacez doucement les mouches dans le nouveau contenant.

Pour se débarrasser des mouches indésirables, laisser les tombe dans une morgue à mouche, composée d’une grande bouteille remplie d’isopropanol ou d’éthanol et d’huile minérale surmontée d’un entonnoir.

Maintenant que nous avons vu comment les mouches sont entretenues et manipulées dans le laboratoire, nous allons (jeter un coup d’œil à) regarder la façon dont les conditions de logement et d’alimentation sont modifiés pour différentes expériences.

Certaines expériences nécessitent une solution de logement alternative afin de contenir une plus grande quantité de mouches.

Dans cette expérience, le chercheur utilise une cage pour une population de mouche afin de recueillir une grande quantité d’embryons. Une cage pour une population est une boîte en plastique transparent pouvant contenir des milliers de mouches. Le chercheur relâche les mouches appropriées de plusieurs bouteilles dans la cage, puis place des plaques d’agar dans la cage pour recueillir les embryons.

Certaines expériences exigent de changer l’alimentation des mouches.

Dans cette expérience, le chercheur veut observer la fuite de mouches transgéniques qui expriment un canal ionique activé par la lumière dans les neurones qui régulent chez la mouche la réponse de fuite. Le régime alimentaire de la drosophile est enrichi en «tout-trans-rétinal», qui est un cofacteur pour ce canal et qui lui permet de fonctionner. Ceci est fait en chauffant la nourriture et en ajoutant le supplément. La mouche est ensuite exposée à la lumière bleue qui active le canal et induit la réaction de fuite, et le temps pris pour s’envoler est mesuré.

Une variété de conditions de logement et de manipulations peuvent être changées pour l’expérimentation.

Dans cette expérience, une “tour élévatrice” élaborée est créé pour étudier les effets de l’exercice sur la drosophile. La tour élévatrice est une machine qui (continuellement) monte et descend continuellement, elle profite de la réponse naturelle de la mouche à se déplacer vers le haut, contre la gravité, qui est connu comme “géotaxie négative.”

La performance des mouches exercées dans la tour élévatrice est mesurée en utilisant un test rapide, itératif de géotaxie négative, appelé « RING » sous l’acronyme anglais. Les mouches dans les éprouvettes vides sont placées en face d’une caméra. Les flacons sont tapés, et les distances parcourues sont enregistrées. Cette expérience montre que, par rapport à un groupe témoin, l’exercice a eu un impact positif sur l’activité au fil du temps.

Cette vidéo de JoVE a couvert l’entretien et (de) l’élevage de Drosophila melanogaster. Après avoir vu cette vidéo, vous devriez être en mesure de préparer des milieux alimentaires pour les mouches, identifier correctement un logement approprié, retourner les mouches, et réaliser des expériences simples. Merci (pour) d’avoir regarde!

Transcript

Successful Drosophila melanogaster research hinges upon correct maintenance and husbandry of this valuable model organism. The following video will discuss the necessary steps required to provide proper nutrition, housing, and handling of the fly.

Though commonly know as the fruit fly, Drosophila melanogaster actually subsists on the microorganisms, such as yeast, that grow on fermenting fruit. In the lab, the fly’s diet is modified for practical purposes. Several recipes are available, and all contain the essential components: sugar and yeast. The following recipe is from the University of Indiana in Bloomington, famous for its vast variety of fly stocks. It consists of: sterile water, yeast, soy flour, yellow cornmeal, agar for texture, corn syrup, and propionic acid to inhibit mold and bacterial growth. These ingredients are combined, heated, stirred, and then distributed into plastic housing vials using a pump. After they are filled, the vials are plugged with a cotton top, wrapped, and cooled at 4 °C. Once solidified, food is sterilized via autoclaving.

Now that we’ve learned a bit about what flies eat, let’s have a look at where they live and how they’re handled.

A variety of containers are used for housing flies. Vials are used for fly maintenance and optimally contain 50-100 adults. Bottles are used for larger cultures and house 300-600 adult flies. Incubators control the environment and are capable of holding hundreds of vials and bottles. The normal storage conditions for flies are 25 °C and 60-65% relative humidity.

When working with flies, it is important to practice proper labeling and documentation, and to keep a clean environment to maintain the integrity of fly lines and experiments. A container must be changed when about half of the pupae have eclosed, or left the pupal casing. The casings will appear clear.

FYI, the pupal stage occurs between the larval and adult stages, and is the time when the larvae incubate and develop into an adult. To identify pupal casings as clear, hold the container up to a light source and inspect the pupa.

Flies are transferred to vials with fresh media — a fancy name for fly food — via a process known as “flipping flies.” Before flipping flies, inspect the media for integrity. Flies cannot survive on food cracked with dryness or contaminated with mold or bacteria.

To flip flies, first, tap the fly vial gently on the counter to knock flies off the sides of the vial. Then quickly remove the stopper, and invert the flies from the old container rapidly into a new one. This process is done rapidly, to prevent flies from escaping or being crushed by the stopper, and to prevent loose flies from entering the vial during flipping.

While flipping flies is the preferred method for the bulk transfer of Drosophila, anesthetization is required for sorting flies. Two methods of anesthetization will be discussed here: chilling, and using carbon dioxide. To chill flies place the culture in a -20 °C freezer for 8-12 minutes. Then place flies onto a chilled, flat workspace for selection. Flies can also be anesthetized using cold by chilling them directly on a frozen surface.

Carbon dioxide is a preferred method for anesthetization because it does not cause acute mortality in flies or danger to the researcher. The CO2 delivery system is made up: of a CO2 tank; a tube connected to a needle, to anesthetize flies in vials and bottles; and a tube connected to a CO2 plate for analysis under the microscope.

To anesthetize flies, insert the CO2 needle through the stopper. Alternatively, tap the container on a surface, remove the stop, and quickly invert the flies onto a CO2 plate, keeping a closed seal until the flies are immobile. Using a brush or forceps, gently move the flies into the new container.

To discard unwanted flies, dump them into a fly morgue, which consists of a large bottle filled with isopropanol or ethanol and mineral oil topped with a funnel.

Now that we’ve seen how flies are maintained and handled in the laboratory, let’s have a look at how housing and feeding conditions are modified for different experiments.

Some experiments require alternative housing in order to contain a greater amount of flies.

In this experiment, the researcher uses a fly population cage to collect a large quantity of embryos. A fly population cage is clear, plastic box capable of holding thousands of flies. The researcher releases the desired flies from several bottles into the fly population cage, then places agar plates into the cage to collect embryos.

Some experiments demand the manipulation of the fly diet.

In this experiment, the researcher wants to observe the escape response of transgenic flies that express a light-activated ion channel in neurons that regulate the flies’ escape response. The Drosophila diet is supplemented with “all-trans-retinal”, which is a cofactor for this channel and allows it to function. This is done by melting the food and adding the reagent. The fly is then exposed to blue light that activates the channel and induces the escape response, and the time taken to fly measured.

A variety of housing and handling conditions can be manipulated for experimentation.

In this experiment, an elaborate “power tower” is created to study the effects of exercise on Drosophila. The power tower is a machine that continually rises and drops, taking advantage of the fly’s natural response to move upward, against gravity, which is known as “negative geotaxis.”

The performance of the flies exercised in the power tower is measured using a Rapid Iterative Negative Geotaxis assay, or RING assay for short. Flies in empty vials are placed in front of a camera. The vials are tapped, and the distances climbed are recorded. This experiment shows that compared to a control group exercise had a positive impact on activity over time.

This JoVE video has covered the maintenance and husbandry of Drosophila melanogaster. After watching this video you should be able to prepare fly food media, properly identify appropriate housing, flip flies, and perform simple experiments. Thanks for watching!