Utilisation de Caenorhabditis elegans comme système modèle pour étudier l’homéostasie des protéines dans un organisme multicellulaire

L’objectif global des expériences suivantes dans le métazoaire génétiquement traitable CENO R elegance est de surveiller le mauvais repliement des protéines à trois niveaux, l’organisme, les cellules et les protéines. Les phénotypes comportementaux tels que la motilité ou la résistance thermique, fonctionnent comme des lectures des changements dans l’homéostasie des protéines au niveau de l’organisme, sensibles à la température ou naturels. Les protéines méta-stables sont utilisées pour suivre la mauvaise localisation des protéines, qui peut être associée à un mauvais repliement des protéines.

Un test de digestion partielle ex vivo surveille directement la stabilité des protéines. Les résultats peuvent montrer des changements dans la capacité de protéostasie à différentes températures de culture en fonction du test de résistance thermique, de la microscopie d’immunofluorescence et de l’analyse sanguine occidentale. Ces procédures seront démontrées par des étudiants des cycles supérieurs dans mon laboratoire.

Le test comportemental sera démontré par ish ido et Shai démontrera l’immunocoloration et l’échec de l’ANA et le sheron démontrera la digestion partielle. Ce protocole de mesure de tolérance à la température s’accompagne d’étapes préparatoires à la synchronisation des animaux et d’un test de mouvement. Les deux sont décrits dans le protocole texte : commencez par collecter des répétitions contenant au moins 20 animaux synchronisés.

En 24, des puits bien joués contenant 450 microlitres de tampon de choc thermique. Complétez chaque puits avec neuf microlitres de cytoxine. Transférez maintenant la plaque dans un bain chauffé.

Le choc thermique, la température et la durée dépendent fortement des conditions de croissance. En particulier, la température de culture permet d’évaluer la survie de l’animal en surveillant son absorption de dég. À l’aide d’un stéréoscope fluorescent avec un filtre TXR, les animaux qui prennent la matrice sont morts.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le kine, la tolérance par scoring manuel est l’utilisation de la lecture visuelle de la mortalité animale, ce qui rend cet essai beaucoup plus rapide et reproductible. Au stade requis, transférez au moins 30 animaux dans un microtube à centrifuger contenant un tampon M neuf. Lavez les animaux plusieurs fois avec M neuf en effectuant des étapes de centrifugation courtes et à basse vitesse et en les suspendant en M neuf.

Placez ensuite les tubes sur de la glace pendant quelques minutes pour qu’ils refroidissent. Une fois refroidis, retirez l’excès de liquide et incubez les tubes. Dans 500 microlitres de glacé, 4 % d’aldéhyde PARAFORM.

Le temps d’incubation doit être calibré pour chaque protéine examinée et doit être d’environ cinq à 30 minutes à température ambiante. Maintenant, lavez les animaux fixés trois fois avec du PBS tween à pH 7,2 par centrifugation. Les centrifugations sont toujours effectuées à 3000 tr/min pendant une ou deux minutes, sauf indication contraire.

Dans la hotte, retirez la majeure partie du surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de solution de mercaptoéthanol. Ensuite, incubez les animaux à 37 degrés Celsius pendant la nuit, avec un léger balancement le lendemain dans le capot. Laver les animaux trois fois avec du PBST par centrifugation et Resus.

Terminez le lavage avec 50 à 100 microlitres de PBST et retirez la majeure partie de ce PBST après une autre centrifugation. Ensuite, ajoutez 100 à 150 microlitres de solution de collagénase et incubez les animaux à 37 degrés Celsius avec une forte agitation. Utilisez un mélangeur thermique ou un incubateur à agitation.

Après cinq minutes, commencez à faire des vérifications périodiques au microscope stéréoscopique. Lorsqu’un cinquième des animaux sont brisés, arrêtez la réaction en plaçant le tube sur de la glace. Cette étape est très délicate.

La durée du traitement dépend des conditions de fixation et peut varier considérablement d’une souche à l’autre. Une incubation prolongée pourrait entraîner la dégradation complète des animaux. Les conditions doivent être calibrées avant chaque lot d’enzymes et la dégradation doit être surveillée attentivement.

Ensuite, lavez les animaux deux fois avec PBST. Recueillir les animaux par centrifugation et enlever la majeure partie du PBST. Ajoutez ensuite un millilitre d’une solution BA suivie d’une incubation avec un balancement doux pendant une heure à température ambiante, récupérez les animaux par centrifugation et mettez-les en suspension dans 200 microlitres de a b, A.Ajoutez maintenant l’anticorps primaire et commencez une incubation d’une nuit avec un balancement doux à température ambiante.

Ces paramètres doivent être calibrés. Ensuite, lavez les animaux par centrifugation. Remettez-les en suspension dans un millilitre de a b, A et incubez-les en mélangeant doucement pendant 15 minutes à une heure à température ambiante.

À ce stade, un ajout facultatif de colorant fluorescent peut être ajouté. Ensuite, répétez le lavage d’un tampon BA trois fois de plus et terminez les lavages en suspendant Resus dans 100 microlitres d’un BA avec l’anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence à une dilution de un à 100. Incuber les échantillons à bascule pendant plusieurs heures à température ambiante à l’abri de la lumière pour dégager le secondaire.

Effectuez trois lavages avec a, b, a. Ensuite, montez les animaux sur des lames par Resus, en les suspendant dans 10 microlitres de a, b, a, puis à l’aide d’une pipette à large calibre, transférez un ou deux microlitres de l’échantillon sur chaque lame, ajoutez un volume égal de support de montage et couvrez la lame. Scellez délicatement la lame avec du vernis à ongles.

Les lames peuvent être stockées à moins 20 degrés Celsius pendant de longues périodes. En général, les personnes qui ne connaissent pas ce protocole auront du mal car le protocole est long et comprend de nombreuses étapes qui peuvent affecter son efficacité, ce qui rend le dépannage difficile. Commencez par collecter les animaux à partir de plaques d’environ 1560 millimètres dans un ou deux millilitres de tampon M neuf.

Les animaux ne doivent pas être surpeuplés. Lavez les animaux plusieurs fois avec un tampon M nine en les centrifugant et en les réanimant en suspension. Après l’essorage final, les animaux sont suspendus dans 100 microlitres de tampon M neuf.

Ensuite, congelez les animaux et, à l’aide d’un pilon et d’une perceuse réfrigérés, broyez l’échantillon sur de la glace. S’arrêtant fréquemment pour vérifier si les animaux sont suffisamment broyés. Une fois les animaux complètement écrasés, estimez le volume de l’extrait de vers.

Ajoutez ensuite un volume égal de solution de lyse de deux vers et incubez l’échantillon sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, retirez les débris par un cycle de centrifugation refroidi et transférez le surnageant dans un tube de micro-fuge propre. Après un test Bradford, diluez l’échantillon à 3 à 3,5 milligrammes de protéines par millilitre.

Ajoutez ensuite une solution de trypsine de camouflage réfrigérée fraîchement préparée dans un rapport de un à 1200. À ce stade, réglez l’échantillon pour qu’il soit incubé pendant une heure. Pendant l’incubation, prélever périodiquement 20 microlitres d’aliquotes et les mélanger immédiatement avec un tampon SDS, suivi de cinq minutes à 96 degrés Celsius.

Analysez les échantillons et effectuez une analyse de sang Western pour déterminer la stabilité relative de la protéine. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas ajouter de cocktail d’inhibiteurs de protéase à l’échantillon de digestion et au lieu de cela, nous allons rapidement et garder les échantillons sur de la glace. La mutation E 781 K ts dans le chaperon musculaire sur 45 affecte fortement le repliement et l’assemblage de la myosine et affecte donc la motilité animale.

Lorsque ces mutants ont été cultivés à des températures supérieures à 20 degrés Celsius, ils étaient complètement paralysés, mais pas à 15 degrés Celsius. Lorsque des animaux sauvages élevés à 25 degrés Celsius ont été soumis à un choc thermique prolongé, la plupart ont survécu. Alors que seulement 30 % ont survécu s’ils étaient élevés à 15 ou 20 degrés Celsius pour surveiller les modificateurs efficaces de la réponse au choc thermique, les conditions de stress de contrôle étaient élevées à un taux de survie de 70 % pour les animaux de type sauvage.

Les animaux ont été exposés à un choc thermique de 37 degrés Celsius pendant six heures. Le premier jour de l’âge adulte, la survie a été mesurée par le test d’absorption de l’orange cyt. Les animaux morts sont indiqués par des flèches blanches et les animaux vivants par des flèches jaunes.

La localisation de plusieurs protéines méta-stables a été visualisée à l’aide d’anticorps spécifiques. Par exemple, les paramètres sont localisés dans des assemblages polycristallins au lieu de sarcomère musculaire dans des conditions restrictives. De même, la myosine TS forme des filaments désorganisés au lieu des structures filamenteuses hautement ordonnées à la température restrictive.

Animaux exprimant diverses protéines mutantes TS co-exprimées avec myo trois. La GFP a montré une détérioration rapide de l’organisation des filaments myo, comme détecté par la surveillance de la GFP, les changements dans la confirmation de la myosine peuvent refléter des changements dans la capacité de repliement des cellules musculaires. Le profil de fragmentation protéolytique de la chaîne lourde de la myosine, co-exprimé avec UNC 45 Ts, présente des caractéristiques distinctes par rapport au profil de digestion de la myosine provenant d’animaux de type sauvage, soutenant l’affirmation selon laquelle le repliement de la myosine est affecté par UNC 45.

Perte de fonction. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation de la protéostasie dans l’élégance marine, elle peut également être appliquée dans d’autres systèmes tels que différents organismes modèles.