Name: Tests de polymérisation FtsZ : protocoles et considérations simples (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Apprenez les protocoles de polymérisation de FtsZ pour la biologie cellulaire bactérienne. Ces méthodes simples permettent d'étudier la division cellulaire et d'explorer de nouvelles stratégies antibactériennes.

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Le travail dans notre laboratoire est financé par une subvention VIDI de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (à DJS). 
Nous remercions Marc Stuart et le Département de microscopie électronique de notre université pour leur aide et leur accès au microscope électronique à transmission.

<ol><li>Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division%3A+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+in+bacterial+cytokinesis%3A+cytoskeleton+and+force+generator+all+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).</li>
<li>Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+SepF+binds+to+the+C-terminus+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ.</a> PLoS One. 7 (8), e43293(2012).</li>
<li>Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SepF+increases+the+assembly+and+bundling+of+FtsZ+polymers+and+stabilizes+FtsZ+protofilaments+by+binding+along+its+length%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length.</a> J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).</li>
<li>Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+ring+polymers+align+FtsZ+polymers+for+normal+septum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation.</a> EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).</li>
<li>Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pH+dependence+of+polymerization+and+bundling+by+the+essential+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ.</a> PLoS One. 6 (6), e19369(2011).</li>
<li>Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+model+for+ionic+%28K%28%2B%29%2FNa%28%2B%29%29+and+pH+dependence+of+GTPase+activity+and+polymerization+of+FtsZ%2C+the+prokaryotic+ortholog+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin.</a> J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).</li>
<li>Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Escherichia+coli+cell+division+protein+FtsZ+by+a+low-affinity+interaction+with+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations.</a> FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).</li>
<li>Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+MinC+on+FtsZ+polymerization+is+pH+dependent+and+can+be+counteracted+by+ZapA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA.</a> FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+assembly+dynamics+and+subunit+turnover+of+FtsZ+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).</li>
<li>Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Caulobacter+crescentus+FtsZ+protein+using+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering.</a> J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+assembly+of+FtsZ+regulated+by+GTP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis.</a> EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).</li>
<li>Ray, S., Kumar, A., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+regulates+the+interaction+between+MciZ+and+FtsZ%3A+a+possible+role+of+MciZ+in+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division.</a> Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).</li>
<li>Rivas, G., Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium-induced+linear+self-association+of+the+FtsZ+bacterial+cell+division+protein+monomer.+The+primary+steps+for+FtsZ+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly.</a> J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+FtsZ+protofilament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into FtsZ protofilament formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Lowe, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li>
<li>Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+SOS+cell+division+inhibitor+SulA+and+in+complex+with+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).</li>
<li>Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).</li>
<li>White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+polymerization+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+conformational+variability+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the conformational variability of FtsZ.</a> J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Buske, P. J., Levin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+C+terminus+of+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ+plays+fundamental+role+in+assembly+independent+of+modulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins.</a> J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Nous décrivons un ensemble de méthodes qui permettent une analyse rapide de l’activité de FtsZ et de son interaction avec d’autres protéines. La diffusion de la lumière, la sédimentation et les dosages de GTPase ainsi que la microscopie électronique ont été largement utilisés pour étudier la polymérisation de FtsZ. Nous avons apporté quelques améliorations aux protocoles existants, nous avons montré l’influence de différentes conditions sur l’assemblage des FtsZ, et nous proposons des contrôles qui devraient être inclus dans les études FtsZ.
Nous introduisons la centrifugation à basse vitesse pour distinguer les grandes structures formées par l’association entre FtsZ et ses protéines en interaction des polymères FtsZ. Cette méthode présente deux avantages par rapport à l’essai de sédimentation standard. Tout d’abord, aucun fond n’est formé par les polymères FtsZ dans la fraction de granulés, car ils ne sont pas filés à 24 600 x g. Deuxièmement, la quantité de FtsZ présente dans la structure formée par une protéine en interaction peut être calculée à partir du gel. Deux étapes critiques de cette méthode sont le temps d’incubation et la concentration de GTP. Il est important de centrifuger la grande structure protéique lorsqu’elle est complète, mais avant qu’elle ne se désassemble lorsque tout le GTP est hydrolysé. Le meilleur contrôle pour cette étude est la polymérisation de FtsZ avec GDP. Il y a une limite potentielle du test. FtsZ forme un complexe stable avec SepF, qui peut facilement être filé à 24 600 x g. Si la sédimentation avec un autre activateur ou un médicament qui regroupe des polymères FtsZ est effectuée, il peut être nécessaire d’adapter le dosage. Cela peut se faire en modifiant le temps d’incubation ou en augmentant la vitesse de centrifugation.
Une bonne préparation de l’échantillon est la plus importante pour les expériences de diffusion de la lumière. Les protéines doivent être pré-nettoyées par filage et tous les tampons doivent être filtrés avant utilisation. Si des agrégats sont présents dans l’échantillon, ils perturberont un signal stable obtenu à partir de polymères FtsZ. Pour l’analyse des structures FtsZ par microscopie électronique, la préparation d’une grille est l’étape principale. Le temps d’incubation de l’échantillon sur la grille aura pour effet de produire des polymères plus ou moins compactés. Pour les faisceaux de FtsZB, le temps d’incubation doit être plus court que pour les FtsZEc et FtsZB à forte concentration en KCl. Nous avons utilisé une concentration de 12 μM pour chaque échantillon afin de pouvoir comparer les résultats. Cependant, pour les FtsZBs à 50 mM KCl, une concentration FtsZ plus faible doit être utilisée, car 12 μM a entraîné une saturation complète de la grille. Cela rend les polymères très compacts et difficiles à détecter. Les polymères moins compactés sont mieux détectés sur EM.
Le dosage de la GTPase est la seule expérience utilisée pour étudier l’activité plutôt que les structures de FtsZ. Mg2+ est nécessaire pour le renouvellement de la GTP dans les polymères FtsZ. Ainsi, en l’absence de Mg2+, FtsZ n’hydrolyse pas le GTP. Par conséquent, un échantillon sans Mg2+ est le bon contrôle dans ce dosage, mais des cations de Mg sont présents dans le tampon de stockage FtsZ. Ils peuvent être éliminés par l’ajout de 1 mM d’EDTA à l’échantillon de contrôle. L’étape critique de ce test est le temps d’incubation. Il est important d’arrêter l’activité FtsZ après un certain temps. Ceci est réalisé en transférant l’échantillon FtsZ dans une solution de vert de malachite dans une plaque à 96 puits. Cependant, le développement de la couleur vert malachite est un processus continu. Ainsi, les mesures doivent être prises en même temps pour chaque échantillon. En utilisant un protocole d’addition GTP bien planifié avec des mesures prises toutes les 30 secondes d’intervalle dans un ordre établi, il est possible d’obtenir le même temps d’incubation et de manipulation des échantillons pour chaque point temporel. Une autre étape critique consiste à choisir la concentration de la protéine pour l’expérience. Dans l’expérience, nous avons utilisé deux concentrations différentes pour FtsZEc et FtsZBs. L’hydrolyse des GTP est beaucoup plus rapide pour lesFtsZ Ec par rapport aux FtsZBs. L’activité GTPase de FtsZEc dans les conditions choisies et à 12 μM n’est linéaire que pendant un maximum de 5 min et après cette période, le taux d’hydrolyse se stabilise. Ainsi, il est difficile d’interpréter les données de l’expérience lorsqu’elle est réalisée dans ces conditions. Dans ce cas, FtsZEc doit être utilisé à une concentration inférieure à celle de FtsZBs pour pouvoir comparer les activités des deux protéines. L’activité GTPase des FtsZ provenant de différentes sources peut varier. Ainsi, la bonne concentration doit être choisie. La concentration pour la polymérisation FtsZ doit être bien supérieure à la concentration critique (en général de 2,5 à 10 μM). La dynamique de l’assemblage et du démontage FtsZ est également importante. Certaines protéines présentent un retard significatif de polymérisation après l’ajout de GTP, comme le montrent les FtsZBs à 50 mM KCl. Il est utile d’effectuer l’essai de diffusion de la lumière avant l’essai GTPase pour estimer le moment de l’assemblage et du désassemblage des polymères FtsZ. Après cela, le moment de l’incubation et la concentration des protéines peuvent être choisis. Étant donné que les conditions choisies pour la polymérisation FtsZ sont cruciales, il est important d’utiliser le bon pH et la bonne concentration de KCl dans chaque méthode. Dans ce travail, nous avons étudié 9 tampons différents avec des pH allant de 6,5 à 7,5 et des concentrations en KCl de 0 M à 300 mM. Nous avons remarqué que la meilleure condition pour analyser les FtsZ de B. subtilis et E.coli et leur activité biologique est à un pH proche du niveau physiologique (7,5) associé à une concentration élevée de KCl. À une concentration élevée de KCl, FtsZ a une activité GTPase plus élevée et produit des polymères qui sont mieux détectables par microscopie électronique. Nous avons également confirmé que le pH physiologique et une concentration élevée de KCl sont meilleurs pour l’étude de l’interaction entre FtsZ et les protéines régulatrices que tout autre tampon principalement utilisé pour étudier l’assemblage de FtsZ. FtsZBs montre une activité similaire à celle de FtsZEc lorsqu’il est étudié à haute concentration de KCl. De plus, à une faible concentration en sel, l’influence du pH est plus visible que dans les tampons à forte concentration en sel. FtsZ précipite parfois lors de l’utilisation de tampons sans KCl, par conséquent, les tampons sans sel doivent être évités. La sédimentation des polymères FtsZ est faible lors de l’utilisation de tampons à forte concentration de KCl. Cela peut être un avantage lors de l’étude des interactions entre FtsZ et les protéines qui assemblent les filaments FtsZ telles que SepF et ZapA, car ces structures d’ordre supérieur sont faciles à détecter avec la centrifugation. Dans toutes nos expériences, nous avons utilisé du MgCl2 à une concentration de 10 mM. Il a été démontré qu’une concentration relativement élevée de Mg2+ stabilise les polymères FtsZ et réduit l’activité GTPase de FtsZ. Le tableau 2 résume les résultats de diverses études, en décrivant la polymérisation de FtsZ et l’activité de la GTPase à différentes concentrations de Mg2+ en utilisant des conditions tampons par ailleurs identiques 27. La concentration mesurée de Mg2+ cytoplasmique libre est de 0,9 mM3. Il est à noter que le GTP va chélater une quantité équivalente de Mg2+. Ainsi, la concentration optimale de Mg2+ pour les expériences de GTPase est d’environ 2-2,5 mM, ce qui est proche du niveau physiologique3. Cependant, dans nos expériences, nous avons utilisé du MgCl2 à une concentration de 10 mM pour obtenir un signal de diffusion de la lumière facilement détectable et pour stabiliser les polymères FtsZ pendant l’essai de sédimentation.
Bien que nous ayons appliqué nos protocoles aux FtsZ des organismes modèles E. coli et B. subtilis, ils peuvent être adaptés aux FtsZ de n’importe quel autre organisme. Il convient de noter que le pH physiologique et les concentrations de cations monovalents et divalents diffèrent d’un organisme à l’autre. Ainsi, les conditions optimales pour la polymérisation FtsZ peuvent varier. Les différences dans le temps de doublement et les conditions de croissance des différentes bactéries peuvent entraîner une cinétique d’assemblage différente de FtsZ et des conditions optimales des expériences. Cependant, notre protocole fournit un bon point de départ pour les expériences avec des FtsZ d’autres organismes. Les protocoles devraient être utiles pour l’étude de FtsZ avec des protéines régulatrices ou l’étude des effets de petits composés et de médicaments sur FtsZ.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Source</td>
			<td>Polymérisation [ % de FtsZ sédimentés]</td>
			<td>GTPase [Pi/FtsZ/min]</td>
			<td>Concentration en mg2+ [mM]</td>
			<td>Concentration FtsZ [μM]</td>
			<td>Références</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZEc</td>
			<td>~ 28 %</td>
			<td>~ 2,1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>Ce travail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 50 %</td>
			<td>~ 2,4</td>
			<td>10</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 43 %</td>
			<td>~ 3,5</td>
			<td>5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 27 %</td>
			<td>~ 4,6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ND</td>
			<td>~ 5,4</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZBs</td>
			<td>~ 30 %</td>
			<td>~ 0,8</td>
			<td></td>
			<td>12</td>
			<td>Ce travail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 52 % (avec DEAE dextran)</td>
			<td>~ 0,5</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ND</td>
			<td>~ 2,25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2. Effet sur le Mg2+ sur la polymérisation FtsZ et la GTPase. Résultats de ce travail comparés aux données publiées. Toutes les expériences ont été réalisées dans 50 mM MES/NaOH, pH=6,5, 50 mM KCl.

La protéine bactérienne essentielle FtsZ est la protéine la mieux caractérisée de la machinerie de division cellulaire bactérienne. FtsZ est l’homologue procaryote de la tubuline et polymérise in vitro de manière dépendante du GTP. FtsZ est une cible très attrayante pour les nouveaux antibiotiques en raison de sa nature préservée et de son caractère unique par rapport aux bactéries1,2. Au début de la division cellulaire, FtsZ forme un anneau cytocinétique au milieu de la cellule, qui sert d’échafaudage pour l’assemblage d’autres protéines de division cellulaire. La formation de l’anneau Z est cruciale pour la localisation correcte du plan de division. La dynamique d’assemblage de FtsZ est régulée par plusieurs protéines accessoires, telles que (selon l’espèce bactérienne) MinC, SepF, ZapA, UgtP et EzrA2. La polymérisation FtsZ a été étudiée de manière intensive in vitro et de nombreuses structures différentes, y compris des protofilaments droits, des protofilaments courbes, des feuilles de filaments, des faisceaux de filaments et des tubes de filaments, ont été décrites en fonction du tampon d’assemblage, du nucléotide et des protéines supplémentaires incluses dans le test3. L’architecture des protofilaments FtsZ in vivo n’est pas encore entièrement comprise, bien que des expériences de cryotomographie électronique chez Caulobacter crescentus suggèrent que l’anneau Z est assemblé à partir de protofilaments uniques relativement courts et non continus, sans regroupement étendu4.
In vitro, les propriétés de polymérisation de FtsZ et l’interaction de FtsZ avec les protéines régulatrices sont sensibles à la composition du tampon réactionnel. Par exemple, nous avons récemment décrit le site d’interaction de SepF sur le C-terminal FtsZ et montré qu’une troncade C-terminale FtsZBs∆16 ne se lie plus à SepF5. Dans une étude précédente sur l’interaction SepF-FtsZBs, un tronc similaire de FtsZBs∆16 cosédimentait toujours avec SepF, ce qui suggérait que SepF se lie à un site secondaire sur FtsZ6. La différence entre ces études était la composition des tampons réactionnels - à pH 7,5, il n’y avait pas de cosédimentation de SepF avec le tronc FtsZ, tandis qu’à pH 6,5, il y avait cosédimentation. Gündoğdu et al. a noté que SepF n’est pas fonctionnel et précipite à pH 6,57, montrant que la cosédimentation observée à pH 6,5 est probablement causée par la précipitation de SepF plutôt que par l’interaction avec le tronc C-terminal FtsZBs∆16. L’influence du pH et de la concentration en KCl sur la polymérisation de FtsZ a déjà été examinée. Les polymères d’E. coli FtsZ (FtsZEc) à pH 6,5 sont plus longs et plus abondants que ceux formés à pH neutre8,9. Tadros et al. ont étudié la polymérisation de FtsZEc en présence de cations monovalents, notant que la liaison K+ est liée à la polymérisation de FtsZEc et est cruciale pour l’activitéFtsZ 10. Le pH est plus critique lorsque l’on étudie l’interaction de FtsZ avec d’autres protéines, comme le montre l’exemple précédent de SepF, et la dépendance du pH de l’effet inhibiteur de MinC sur FtsZ11. Étant donné que le pH et la concentration en sel peuvent influencer l’interaction de FtsZ avec d’autres protéines, il est important de choisir les bonnes conditions et les bons contrôles pour les études de polymérisation FtsZ.
Nous décrivons ici des protocoles pour étudier la polymérisation FtsZ et l’activité de la GTPase par diffusion de la lumière, microscopie électronique, sédimentation et tests de GTPase. La diffusion de la lumière à angle droit est une méthode standard pour étudier la polymérisation FtsZ en temps réel12. Nous avons apporté quelques améliorations à la sédimentation et à l’analyse de la GTPase. Nous présentons en détail comment préparer des échantillons pour la diffusion de la lumière et la microscopie électronique. Plusieurs tampons utilisés dans la littérature pour étudier la polymérisation FtsZ ont été testés et nous décrivons les meilleures conditions pour chaque expérience. Nous montrons également quels contrôles doivent être mis en place pour obtenir les meilleures données.
Ces méthodes permettent une étude rapide de la polymérisation, de l’activité et de l’interaction de FtsZ avec d’autres protéines à l’aide de méthodes et d’équipements simples disponibles dans la plupart des laboratoires. Des méthodes plus sophistiquées pour étudier la polymérisation du FtsZ existent, mais nécessitent souvent l’accès à un équipement plus spécialisé et/ou la modification du FtsZ avec des marqueurs fluorescents8,13,14. Les méthodes simples décrites dans cet article sont illustrées à l’aide de FtsZ de B. subtilis et E. coli, les organismes modèles Gram+ et Gram- les plus courants. Les protocoles peuvent être adaptés à n’importe quelle autre protéine FtsZ. D’après les essais préliminaires effectués avec ces nouveaux FtsZ, de légers changements concernant le temps, la zone tampon ou la température d’incubation peuvent être nécessaires pour obtenir un résultat optimal. Les expériences décrites ici devraient aider à trouver ces conditions optimales.

<table><tbody><tr><td>GTP</td><td>Roche 10106399001</td><td></td><td>Partie 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7</td></tr><tr><td>Tubes en polycarbonate à paroi épaisse</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>Partie 2</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Optima MAX-XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td>Partie 2, 3</td></tr><tr><td>Tube polyallomère avec capuchon encliquetable</td><td>Beckman Coulter</td><td>357448</td><td>Partie 3</td></tr><tr><td>AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL</td><td>Raytest Isotopenmessger&auml ; te GmbH</td><td>15000001</td><td>Partie 4</td></tr><tr><td>Analyseur d’images de luminescence LAS-4000</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Partie 4</td></tr><tr><td>Spectromètre thermo-spectronique AMINCO-Bowman</td><td>Instruments spectroniques</td><td>Partie 5</td>Cellule <td></td></tr> de <tr><td>fluorescence</td><td>Hellma Analytics</td><td>105-250-15-40</td><td>Partie 5</td></tr><tr><td>Carré 400 Mesh, cuivre, 100/flacon</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>G400-Cu</td><td>Partie 6</td></tr><tr><td>CM120 Microscope électronique fonctionnant à 120 kV</td><td>Philips</td><td></td><td>Partie 6</td></tr><tr><td>96 ml x 0,2 ml Plaque</td><td>BIOplastiques</td><td>B70501</td><td>Partie 7</td></tr><tr><td>Kit de dosage de phosphate vert de malachite</td><td>Système de dosage BioAssay</td><td>POMG-25H</td><td>Partie 7</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre de microplaques PowerWave HT</td><td>BioTek</td><td></td><td>Partie 7</td></tr></tbody></table>

tests de polymérisation ftsz : protocoles et considérations simples

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

Lors de la division cellulaire bactérienne, la protéine essentielle FtsZ s’assemble au milieu de la cellule pour former ce que l’on appelle l’anneau Z. FtsZ polymérise en longs filaments en présence de GTP in vitro, et la polymérisation est régulée par plusieurs protéines accessoires. La polymérisation FtsZ a été étudiée de manière approfondie in vitro à l’aide de méthodes de base, notamment la diffusion de la lumière, la sédimentation, les tests d’hydrolyse GTP et la microscopie électronique. Les conditions tampons influencent à la fois les propriétés de polymérisation de FtsZ et la capacité de FtsZ à interagir avec les protéines régulatrices. Ici, nous décrivons des protocoles pour les études de polymérisation FtsZ et validons les conditions et les contrôles en utilisant Escherichia coli et Bacillus subtilis FtsZ comme protéines modèles. Un test de sédimentation à basse vitesse est introduit qui permet d’étudier l’interaction de FtsZ avec des protéines qui regroupent ou tubulent les polymères FtsZ. Un protocole amélioré de dosage de la GTPase est décrit qui permet de tester l’hydrolyse de la GTP au fil du temps en utilisant diverses conditions dans une configuration de plaque à 96 puits, avec des temps d’incubation standardisés qui abolissent la variation du développement de la couleur dans la réaction de détection du phosphate. La préparation d’échantillons pour les études de diffusion de la lumière et la microscopie électronique est décrite. Plusieurs tampons sont utilisés pour établir le pH du tampon et la concentration en sel appropriés pour les études de polymérisation FtsZ. Une forte concentration de KCl est la meilleure pour la plupart des expériences. Nos méthodes fournissent un point de départ pour la caractérisation in vitro de FtsZ, non seulement à partir d’E. coli et de B. subtilis, mais à partir de toute autre bactérie. En tant que telles, les méthodes peuvent être utilisées pour des études de l’interaction de FtsZ avec des protéines régulatrices ou pour tester des médicaments antibactériens susceptibles d’affecter la polymérisation de FtsZ.

La purification de FtsZ à partir de différentes sources bactériennes a été décrite dans la littérature et est résumée dans le tableau 1.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Source</td>
			<td>Méthode</td>
			<td>Modification</td>
			<td>Rendement obtenu [mg/L de culture]&gt;</td>
			<td>Références</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis</td>
			<td>1) Précipitation au sulfate d'ammonium/chromatographie d'échange d'ions</td>
			<td>non</td>
			<td>40</td>
			<td>Ce travail, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Chromatographie d'affinité</td>
			<td>Marqueur His</td>
			<td>ND</td>
			<td>17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>1) Précipitation au sulfate d'ammonium/chromatographie d'échange d'ions</td>
			<td>non</td>
			<td>35</td>
			<td>Ce travail, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Précipitation au calcium, chromatographie d'échange d'ions</td>
			<td>non</td>
			<td>40</td>
			<td>18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanococcus jannaschii</td>
			<td>1) Chromatographie d'affinité en conditions dénaturantes/repliement/ précipitation au sulfate d'ammonium/chromatographie d'exclusion par taille</td>
			<td>Marqueur His</td>
			<td>1,3</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Chromatographie d'affinité/ chromatographie d'exclusion par taille</td>
			<td>Marqueur His</td>
			<td>ND</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima</td>
			<td>Chromatographie d'échange d'ions/chromatographie d'exclusion par taille</td>
			<td>non</td>
			<td>6,7</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>Chromatographie d'affinité/chromatographie d'exclusion par taille</td>
			<td>Marqueur Strep, marqueur His</td>
			<td>ND</td>
			<td>21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td>1) Chromatographie d'affinité/d'échange d'ions</td>
			<td>non</td>
			<td>ND</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Chromatographie d'affinité/ chromatographie d'exclusion par taille</td>
			<td>non</td>
			<td>30</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquifex aeolicus</td>
			<td>Chromatographie d'affinité/chromatographie d'exclusion par taille</td>
			<td>Marqueur His, troncature C-terminale (331-367)</td>
			<td>ND</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caulobacter crescentus</td>
			<td>Chromatographie d'échange d'ions/précipitation au sulfate d'ammonium/chromatographie d'exclusion par taille</td>
			<td>non</td>
			<td>ND</td>
			<td>25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1. Protocoles de purification de FtsZ décrits. ND : non déterminé.
Sédimentation des polymères de FtsZ
Au départ, nous avons utilisé deux vitesses différentes pour centrifuger les polymères de FtsZ. Nous avons constaté que seule une vitesse de 350 000 × g permet de précipiter des polymères individuels de FtsZEc (Figure 1), tandis qu'à 190 000 × g, seuls des faisceaux de FtsZBs sont présents dans le culot (données non montrées). Par conséquent, la vitesse de 350 000 × g a été utilisée dans nos expériences ultérieures. Le pourcentage de FtsZEc et de FtsZBs polymérisé est similaire à 50 mM de KCl, bien que les expériences de diffusion de la lumière aient révélé un signal de diffusion nettement plus élevé pour FtsZBs. Ceci est dû aux faisceaux formés par FtsZBs, qui diffusent davantage la lumière que les polymères individuels de FtsZEc. Il n'a pas été possible d'obtenir une quantité importante de polymères de FtsZ dans le culot dans l'expérience réalisée avec 300 mM de KCl, aussi bien pour FtsZEc que pour FtsZBs (Figure 1). Nous attribuons cela à une combinaison de désassemblage rapide des structures de FtsZ et de réduction de l'agrégation des filaments.
Sédimentation des tubules FtsZ-SepF
Pour analyser l'interaction de FtsZ avec certains activateurs, des essais de sédimentation peuvent être réalisés à des vitesses de centrifugation plus faibles. À cette vitesse, seules les structures de grande taille de FtsZ peuvent être centrifugées, par exemple les longs tubules formés par les anneaux de SepF et les filaments de FtsZBs5, ou les faisceaux formés par FtsZ et ZapA. Nous avons utilisé une centrifugation à basse vitesse (24 600 × g) afin de démontrer la faisabilité de cette approche pour les tubules formés par FtsZ et SepF. FtsZ a été récupéré dans le culot au-dessus des niveaux de fond uniquement lorsque SepF et le GTP étaient tous deux présents dans l'échantillon (Figure 2), et la présence de SepF n'influence pas l'activité GTPase de FtsZ7, ce qui montre que FtsZ est pleinement actif en présence de SepF. La sédimentation spécifique de SepF et de FtsZ représente environ 45 % du SepF total et 15 % du FtsZ total (par rapport au matériel sédimenté en présence de GDP). Cela indique que les tubules SepF-FtsZ contiennent plus de SepF que de FtsZ. Cette observation peut s'expliquer par le fait que de nombreux anneaux de SepF organisent les tubules FtsZ-SepF5,7. La stœchiométrie exacte de SepF-FtsZ dans ces tubules n'est pas connue, mais nos résultats suggèrent qu'il y a plus de SepF que de FtsZ.
Propriétés de polymérisation et d'agrégation de FtsZEc et de FtsZBs
Afin de caractériser l'efficacité de polymérisation de FtsZBs et de FtsZEc dans différents tampons, nous avons analysé les deux protéines par diffusion de la lumière à un angle de 90°. À 50 mM de KCl, FtsZBs produit un signal de diffusion de la lumière 20 à 40 fois plus élevé que FtsZEc, selon le pH du tampon (Figures 3A et 3B), confirmant les résultats de Buske et al.26. L'augmentation de la concentration de KCl dans le tampon n'a pas influencé de manière significative le signal de diffusion de la lumière de FtsZEc (Figure 3D), mais le signal de FtsZBs a diminué d'environ 80 fois à pH 7,5, d'environ 30 fois à pH 6,8 et d'environ 45 fois à pH 6,5 en présence de 300 mM de KCl (Figure 3C), comparé aux tampons contenant 50 mM de KCl (Figure 3A). La désassemblage des polymères de FtsZ est plus rapide à plus forte concentration de KCl pour les deux protéines (Figures 3C et 3D). Des études de Pacheco-Gómez et al. montrent que la polymérisation et l'agrégation de FtsZ chez E. coli dépendent du pH. Ces auteurs ont observé qu'avec un tampon contenant 50 mM de KCl, le signal de diffusion de la lumière dû à la polymérisation de FtsZ était plus élevé et que la désassemblage de FtsZ était plus lente à pH 6,0 par rapport à pH 7,0 8. Ces résultats ne concordent pas avec nos données concernant la polymérisation de FtsZEc à 50 mM de KCl (Figure 3B), mais il convient de noter que nous avons utilisé trois tampons différents (HEPES, MES et PIPES), alors que Pacheco-Gómez et al. n'ont utilisé que le MES. Ainsi, ce n'est pas seulement le pH, mais aussi la composition du tampon (force ionique) qui affecte la cinétique des polymères de FtsZ à 50 mM de KCl. Toutefois, à 300 mM de KCl, ni la composition du tampon ni le pH n'ont influencé de manière détectable l'assemblage de FtsZEc.
Une expérience de diffusion de la lumière de FtsZBs dans des tampons sans KCl n'a pas été possible en raison de la précipitation de la protéine dans ces conditions. Lorsque la concentration de FtsZBs a été abaissée à 3 µM, aucune précipitation n'a eu lieu. Toutefois, 3 µM n'est pas la concentration physiologique de FtsZ dans la cellule. Dans des cuvettes en plastique, FtsZBs ne précipitait pas à 12 µM à pH 7,5, mais à pH 6,8 et 6,5, FtsZ précipitait encore en l'absence de KCl.
Morphologies des structures de FtsZ provenant d'E. coli et de B. subtilis
Les structures formées par FtsZ ont été examinées par microscopie électronique en transmission (MET). FtsZBs s'est assemblé en des polymères fortement compactés qui recouvraient entièrement la grille dans tous les tampons à faible concentration saline (Figures 4A-C). FtsZEc a formé des filaments longs, des câbles et des faisceaux dans tous les tampons à faible concentration saline (Figures 4D-F). Toutefois, la quantité observable de polymères formés par FtsZEc était inférieure à celle formée par FtsZBs. Dans les tampons à forte concentration saline, FtsZBs a formé des protofilaments unistrandés plus longs qui ne s'associaient pas en faisceaux (Figures 4G-I). Alors que la structure des protofilaments de FtsZBs changeait à plus forte concentration saline, FtsZEc formait des structures indistinguables de celles observées dans le tampon à faible concentration saline (Figures 4J-L). Aucun effet observable du pH sur la polymérisation de FtsZEc n'a été détecté, mais FtsZBs forme davantage de faisceaux à pH 6,5, visibles sous forme de polymères fortement compactés et de feuillets (Figure 4B). Ces résultats sont en accord avec nos expériences de diffusion de la lumière et des travaux antérieurs publiés utilisant la MET8,11,26.
L'activité GTPase de FtsZ à des concentrations élevées et faibles de KCl
L'activité d'hydrolyse du GTP de FtsZ a été mesurée dans différentes conditions à l'aide d'un dosage colorimétrique du phosphate libre. Comme indiqué précédemment15, l'activité GTPase de FtsZ augmentait avec la concentration croissante de KCl : selon le tampon utilisé, FtsZBs présentait un accroissement de 3 à 7 fois, et FtsZEc un accroissement de 1,5 à 2,5 fois de son activité GTPase à 300 mM de KCl par rapport à 50 mM de KCl. La réduction de l'activité GTPase à 50 mM de KCl est due au regroupement des filaments de FtsZBs. À 50 mM de KCl, FtsZEc présentait une activité GTPase 3 à 6 fois supérieure à celle de FtsZBs, en raison d'un désassemblage plus rapide des polymères de FtsZEc. La différence d'activité d'hydrolyse du GTP entre FtsZBs et FtsZEc était réduite à 300 mM de KCl, probablement en raison d'un regroupement moindre des filaments de FtsZBs (Figure 5).
<img alt="Polymérisation de FtsZ, analyse du pourcentage de culot, graphique en barres, électrophorèse sur gel, comparaison de l'effet du GTP/GDP." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Quantification de la polymérisation de FtsZ par sédimentation. (A) 12 µM de FtsZ ont été polymérisés en présence de 2 mM de GTP ou de GDP à pH 7,5 (barres noires), 6,8 (barres grises) ou 6,5 (barres blanches). La quantité de protéine mise en culot a été déterminée par analyse densitométrique de gels colorés au Coomassie. Le GDP a servi de contrôle pour une sédimentation spécifique, et le pourcentage de FtsZ sédimenté en présence de GDP a été soustrait du pourcentage de FtsZ sédimenté en présence de GTP afin d'obtenir les valeurs représentées sur le graphique. À gauche : FtsZ sédimenté à 50 mM de KCl ; à droite : FtsZ sédimenté à 300 mM de KCl. (B) Résultats représentatifs obtenus à partir de gels colorés au Coomassie. Polymérisation de FtsZBs (gel supérieur) et de FtsZEc (gel inférieur) à 50 mM de KCl. (S) fractions du surnageant, (P) fractions du culot issues de l'expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Graphique d'interaction entre FtsZ et SepF et gel montrant l'influence du GTP/GDP sur le pourcentage de protéines dans le culot." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Sédimentation des tubules SepF/FtsZ à basse vitesse. (A) 12 µM de FtsZBs ont été polymérisés avec 2 mM de GDP (barres blanches) ou de GTP (barres noires). La quantité de protéine dans le culot a été déterminée par analyse densitométrique de gels colorés au Coomassie. Les signes + et - sous l'axe des abscisses indiquent la présence ou l'absence de FtsZ et de SepF dans la réaction. (B) Résultats représentatifs obtenus sur un gel coloré au Coomassie. Polymérisation du FtsZBs en présence ou en absence de SepF. À titre de contrôle, SepF a été utilisé sans FtsZ. La polymérisation a été réalisée avec du GTP et du GDP. (S) fractions du surnageant, (P) fractions du culot issues de l'expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Graphiques de diffusion de la lumière de FtsZ avec des concentrations de KCl ; montrant les effets du pH 6,5, 6,8, 7,5." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Diffusion de la lumière de 12 μM FtsZEc et 12 μM FtsZBs. Les FtsZ ont été assemblées en présence de 2 mM GTP et la polymérisation a été suivie par diffusion de la lumière à un angle de 90°. Polymérisation de FtsZBs (A) et de FtsZEc (B) à 50 mM KCl aux pH 7,5, 6,8 et 6,5. Polymérisation de FtsZBs (C) et de FtsZEc (D) à 300 mM KCl aux pH 7,5, 6,8 et 6,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Microscopie électronique de polymères de FtsZ à différents pH et concentrations de KCl ; analyse structurale." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4. Structures des polymères de FtsZBs et de FtsZEc visualisées par microscopie électronique. (A-L) Images de FtsZBs à 12 µM (A-C et G-I) et de FtsZEc (D-F) et (J-L) polymérisés avec 2 mM de GTP. (A-C) FtsZBs dans un tampon contenant 50 mM de KCl et un pH de 7,5, 6,8 et 6,5 respectivement. (D-F) FtsZEc dans un tampon contenant 50 mM de KCl et un pH de 7,5, 6,8 et 6,5 respectivement. (G-I) FtsZBs dans un tampon contenant 300 mM de KCl et un pH de 7,5, 6,8 et 6,5 respectivement. (J-L) FtsZEc dans un tampon contenant 300 mM de KCl et un pH de 7,5, 6,8 et 6,5 respectivement. Échelle : 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Graphique de l'activité GTPase ; diagramme en barres de FtsZ à 50 mM et 300 mM de KCl, variations de pH à 7,5, 6,8 et 6,5." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5. Hydrolyse du GTP lors de la polymérisation de FtsZ dans six tampons différents. Dans toutes les expériences, 2 mM de GTP ont été utilisés. Un échantillon témoin sans MgCl2 a été utilisé. L'activité de FtsZ sans MgCl2 a été soustraite de l'activité de FtsZ en présence de MgCl2. À gauche : activité GTPase de FtsZ à 50 mM de KCl ; à droite : activité GTPase de FtsZ à 300 mM de KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.

La polymérisation de FtsZ est essentielle pour la division cellulaire bactérienne. Dans ce rapport, nous détaillons des protocoles simples pour surveiller l’activité de polymérisation de FtsZ et discutons de l’influence de la composition du tampon. Les protocoles peuvent être utilisés pour étudier l’interaction de FtsZ avec des protéines régulatrices ou des médicaments antibactériens qui affectent la polymérisation de FtsZ.

Tests de polymérisation FtsZ : protocoles et considérations simples

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer les conditions appropriées pour étudier la FTSZ, la polymérisation et l’activité à l’aide de tests et d’équipements simples. Ceci est réalisé en effectuant des tests de sédimentation des polymères FDSC dans diverses conditions pour trouver les conditions appropriées auxquelles le FDSZ polymérise. Dans un deuxième temps, nous effectuons des tests de diffusion de la lumière pour étudier la polymérisation FDSZ en temps réel.Ensuite, nous effectuons des tests d’hydrolyse du GTP pour déterminer l’activité g gtpa associée à la polymérisation du FT SC. Les résultats obtenus montrent quelles conditions sont les mieux adaptées à l’étude du FTSC d’une source bactérienne spécifique en fonction de la sédimentation, de la diffusion de la lumière et de l’hydrolyse du GTP. La technique présentée ici est facile à réaliser dans n’importe quel laboratoire et fournira une idée rapide des capacités de polymérisation de FT a z spécifiques. Nous constatons que le choix du bon tampon est particulièrement important lorsque l’on travaille avec du FTAZ en présence d’autres protéines, démontrant que la technique sera réalisée par EVA crawl, un étudiant diplômé de mon laboratoire.Pour commencer, ajoutez cinq microlitres de chlorure de magnésium de 100 millimolaires et 12 micromolaires de protéines bactériennes, FDSC et / ou SEP F dans l’un des tampons de polymérisation choisis qui ont différentes valeurs de pH et compositions comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Ensuite, placez les tubes dans un incubateur doté d’une fonction d’agitation et incubez les échantillons pendant deux minutes à 30 degrés Celsius et 300 tr/min. Une fois que les tubes ont été soigneusement mélangés, commencez la polymérisation en ajoutant un microlitre de mélange GTP ou GDP à partir d’une solution mère de 100 millimolaires de sorte que la concentration finale soit de deux millimolaires.Ensuite, replacez les échantillons dans l’incubateur à agitation pendant 20 minutes supplémentaires. Ensuite, faites tourner les tubes à température ambiante pendant 15 minutes à 20 000 tr/min à l’aide d’un rotor TLA 55 ou d’un équivalent de 24 600 G si vous utilisez autre chose. Une fois la centrifugeuse terminée, transférez les surnageants dans des tubes propres et conservez les granulés pour plus tard.Prenez 20 microlitres de surnageants transférés et mélangez-les dans un tube séparé avec 20 microlitres de tampon d’échantillon deux fois concentré. Fixez les bouchons et faites bouillir les échantillons pendant 10 minutes à 98 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillon deux fois concentré à chaque fraction de granulés précédemment mise de côté et suspendez les polymères en faisant bouillir les échantillons pendant 10 minutes à 98 degrés Celsius.Une fois que les échantillons ont fini d’bouillir, ajoutez 50 microlitres supplémentaires d’eau déminéralisée dans les tubes contenant les granulés. Ensuite, chargez 10 microlitres de surnageants et de granulés de chaque échantillon côte à côte sur un gel à 10 % de SDS et faites fonctionner le gel à 150 volts. Une fois le gel terminé, retirez le gel et teignez-le avec du kumasi brilliant blue G two 50.Ensuite, imagez le gel et quantifiez la protéine à l’aide de la cytométrie comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Allumez d’abord un spectromètre fluorescent et laissez la lampe se réchauffer pendant plusieurs minutes pour éviter les fluctuations thermiques. Allumez également un bain-marie à circulation et réglez la température de l’eau à 30 degrés Celsius pour maintenir la chambre vétérinaire à une température constante.Au fur et à mesure que le système se réchauffe, définissez les paramètres de fonctionnement du spectromètre. Réglez la haute tension du détecteur sur 300 volts et les longueurs d’onde d’émission et d’excitation sur 350 nanomètres avec une largeur de fente de quatre nanomètres. Programmez ensuite le protocole d’acquisition de données en choisissant une acquisition basée sur le temps d’une durée de 3 600 secondes.Nettoyez soigneusement un vete de fluorescence de 200 microlitres avec une longueur de trajet d’un centimètre en le forniquant dans une solution de nettoyage au bain-marie pendant cinq minutes. Ensuite, préparez 294 microlitres d’un mélange maître pour chacun des neuf tampons de polymérisation décrits dans le protocole de texte d’accompagnement, chacun avec 10 millimolaires de chlorure de magnésium et 12 micromolaires de FDSE comme concentrations finales calculées pour 300 microlitres. Ensuite, brièvement vortex les mélanges transfèrent 196 microlitres du premier tampon de polymérisation au vétérinaire.Placez-le dans le spectromètre et incubez pendant deux minutes pour amener la température de l’échantillon jusqu’à 30 degrés Celsius. Au bout de deux minutes, démarrez l’acquisition de données et attendez 90 secondes pour vérifier que le signal est stable. Ajoutez ensuite quatre microlitres de 100 millimolaires GTP ou GDP.Mélangez l’échantillon et poursuivez l’acquisition des données pendant une heure complète. Répétez ces étapes pour chaque tampon répertorié. Préparez 1,5 millilitre de GTP de deux millimolaires dans un tampon de polymérisation choisi.Préparez également une dilution de l’étalon de phosphate dans la plage de zéro à 40 micromolaires dans le même tampon. Ensuite, préparez le réactif de travail vert de malachite comme décrit dans le kit d’essais biologiques. Ensuite, préparez quatre mélanges maîtres d’un volume total de 360 microlitres chacun : un mélange maître contient du FDSZ dérivé de B subtilis et un mélange principal deux contient du FDSE dérivé d’e coli.Les mélanges maîtres trois et quatre sont utilisés comme témoins et contiennent de l’EDTA au lieu du chlorure de magnésium. Prochaine pipette 20 microlitres aliquotes des mélanges maîtres et étalons de phosphate. Dans la plaque de puits A-Q-P-C-R 96 de sorte qu’il y ait 16 puits pour chaque mélange maître et les étalons de phosphate disposés comme indiqué ici.Pipette de 180 microlitres de stock GTP de deux millimolaires jusqu’à la dernière voie de la plaque. Placez ensuite la plaque dans une machine PCR. Exécutez un programme avec un seul cycle réglé à 30 degrés Celsius pendant 40 minutes.Dans une deuxième pipette à plaque de 96 puits, 20 aliquotes microlitres du réactif de travail vert de malachite dans des puits, A un à H 10. Ensuite, à 60 microlitres du tampon de polymérisation de l’expérience, les revendications A un à H huit, puis à 20 microlitres de la solution GTP à deux millimolaires dans les puits de chaque voie de plaque. L’un à des intervalles prédéterminés, comme indiqué ici, pour examiner la réaction à différents points temporels.Versez les mélanges de haut en bas pour les mélanger après 30 minutes, en commençant par la première voie de la première plaque, transférez 20 microlitres de la première voie de la première plaque dans la première voie de la deuxième plaque et pipetez de haut en bas pour mélanger. C’est le point de départ du développement de la couleur vert malachite pour la réaction de 30 minutes après 30 minutes et demie, transférez 20 microlitres de la deuxième voie de la première plaque dans la deuxième voie de la deuxième plaque et mélangez. C’est le point de départ du développement de la couleur vert malachite pour la réaction de 20 minutes.Répétez ces étapes avec les voies restantes de trois à sept à 32e intervalles après 33 minutes et demie à 20 microlitres de GTP jusqu’à la huitième voie sur la première plaque et mélangez. Transférez ensuite 20 microlitres dans le couloir huit sur la deuxième assiette et mélangez. Cela représente la réaction de la minute zéro et est le point de départ du développement de la couleur vert malachite.Après 34 minutes, ajoutez 80 microlitres du couloir neuf de la première plaque contenant l’étalon de phosphate au couloir neuf de la deuxième plaque et mélangez après 34 minutes et demie, transférez 80 microlitres du deuxième étalon de phosphate du couloir 10 de la première plaque au couloir 10 de la deuxième plaque et mélangez. Retirez ensuite toutes les bulles d’air des échantillons et incubez la plaque à température ambiante pendant encore 25 minutes et demie. Après l’incubation.Placez la plaque dans un lecteur de plaque à 96 puits à partir de 60 minutes après le début de l’expérience. Mesurez la plaque à 630 nanomètres toutes les 30 secondes pendant cinq minutes afin de prendre 10 points de temps. La première mesure de plaque correspondra à la voie un, la seconde à la voie deux, et de sorte que chaque voie ait eu exactement le même temps pour que la couleur vert malachite se développe.Ensuite, calculez le phosphate libre dans chaque échantillon à l’aide de la courbe d’étalonnage de l’étalon de phosphate et tracez les données sous forme de libération de phosphate au fil du temps. Calculez ensuite l’activité d’hydrolyse F-D-S-Z-G-T-P à partir de l’intervalle linéaire de la courbe. On voit ici le pourcentage de SEP F et FDSZ dans les pastilles des échantillons.Le FDSZ n’a été récupéré dans la pastille au-dessus des niveaux de fond que lorsque SEP F et GTP étaient également présents dans l’échantillon. La stœchiométrie exacte de SEPPE et de FDSZ dans ces tubules n’est pas connue, mais ces résultats suggèrent qu’il y a plus de seppe présent que de FDSZ. La diffusion de la lumière de FDSZ de B subtilis et d’e coli est montrée ici, assemblée en présence de deux GTP millimolaires dans le tampon de chlorure de potassium de 50 millimolaires.F-D-S-E-B-S donne un signal de diffusion de la lumière 20 à 40 fois plus élevé que FDSC EC en fonction du pH tampon. Il est intéressant de noter que l’augmentation de la concentration de chlorure de potassium dans le tampon n’a pas influencé de manière significative le signal de diffusion de la lumière de F-D-S-Z-E-C, mais le signal de F-T-S-Z-B-S a diminué d’environ 80 fois à un pH de 7,5, de 30 fois à un pH de 6,8 et de 45 fois à un pH de 6,5 dans 300 millimolaires de chlorure de potassium par rapport aux tampons contenant 50 millimolaires de chlorure de potassium. L’activité d’hydrolyse du FDSZ a été mesurée dans différentes conditions tampons à l’aide d’un dosage colorimétrique du phosphate libre.On a constaté que l’activité GTPS de FT SZ augmentait avec l’augmentation de la concentration de chlorure de potassium dans chacune des différentes conditions de pH. À 50 millimolaires de chlorure de potassium, l’activité gtpa a été réduite en raison du regroupement des filaments F-D-S-Z-B-S à 50 millimolaires. Le chlorure de potassium FDSZ EEC avait une activité GTPS trois à six fois plus élevée que F-D-S-Z-B-S en raison d’un désassemblage plus rapide des polymères FDSC EEC.Enfin, la différence d’activité d’hydrolyse du GTP entre F-D-S-Z-B-S et F-D-S-Z-E-C a été réduite à 300 millimolaires de chlorure de potassium, peut-être en raison de la réduction du regroupement des filaments F-D-S-Z-B-S. Suite à cette procédure, d’autres métaux comme l’électromicroscopie peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires relatives à la structure des polymères fts dans l’échantillon.

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