Tests de polymérisation FtsZ : protocoles et considérations simples

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer les conditions appropriées pour étudier la FTSZ, la polymérisation et l’activité à l’aide de tests et d’équipements simples. Ceci est réalisé en effectuant des tests de sédimentation des polymères FDSC dans diverses conditions pour trouver les conditions appropriées auxquelles le FDSZ polymérise. Dans un deuxième temps, nous effectuons des tests de diffusion de la lumière pour étudier la polymérisation FDSZ en temps réel.

Ensuite, nous effectuons des tests d’hydrolyse du GTP pour déterminer l’activité g gtpa associée à la polymérisation du FT SC. Les résultats obtenus montrent quelles conditions sont les mieux adaptées à l’étude du FTSC d’une source bactérienne spécifique en fonction de la sédimentation, de la diffusion de la lumière et de l’hydrolyse du GTP. La technique présentée ici est facile à réaliser dans n’importe quel laboratoire et fournira une idée rapide des capacités de polymérisation de FT a z spécifiques. Nous constatons que le choix du bon tampon est particulièrement important lorsque l’on travaille avec du FTAZ en présence d’autres protéines, démontrant que la technique sera réalisée par EVA crawl, un étudiant diplômé de mon laboratoire.

Pour commencer, ajoutez cinq microlitres de chlorure de magnésium de 100 millimolaires et 12 micromolaires de protéines bactériennes, FDSC et / ou SEP F dans l’un des tampons de polymérisation choisis qui ont différentes valeurs de pH et compositions comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Ensuite, placez les tubes dans un incubateur doté d’une fonction d’agitation et incubez les échantillons pendant deux minutes à 30 degrés Celsius et 300 tr/min. Une fois que les tubes ont été soigneusement mélangés, commencez la polymérisation en ajoutant un microlitre de mélange GTP ou GDP à partir d’une solution mère de 100 millimolaires de sorte que la concentration finale soit de deux millimolaires.

Ensuite, replacez les échantillons dans l’incubateur à agitation pendant 20 minutes supplémentaires. Ensuite, faites tourner les tubes à température ambiante pendant 15 minutes à 20 000 tr/min à l’aide d’un rotor TLA 55 ou d’un équivalent de 24 600 G si vous utilisez autre chose. Une fois la centrifugeuse terminée, transférez les surnageants dans des tubes propres et conservez les granulés pour plus tard.

Prenez 20 microlitres de surnageants transférés et mélangez-les dans un tube séparé avec 20 microlitres de tampon d’échantillon deux fois concentré. Fixez les bouchons et faites bouillir les échantillons pendant 10 minutes à 98 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillon deux fois concentré à chaque fraction de granulés précédemment mise de côté et suspendez les polymères en faisant bouillir les échantillons pendant 10 minutes à 98 degrés Celsius.

Une fois que les échantillons ont fini d’bouillir, ajoutez 50 microlitres supplémentaires d’eau déminéralisée dans les tubes contenant les granulés. Ensuite, chargez 10 microlitres de surnageants et de granulés de chaque échantillon côte à côte sur un gel à 10 % de SDS et faites fonctionner le gel à 150 volts. Une fois le gel terminé, retirez le gel et teignez-le avec du kumasi brilliant blue G two 50.

Ensuite, imagez le gel et quantifiez la protéine à l’aide de la cytométrie comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Allumez d’abord un spectromètre fluorescent et laissez la lampe se réchauffer pendant plusieurs minutes pour éviter les fluctuations thermiques. Allumez également un bain-marie à circulation et réglez la température de l’eau à 30 degrés Celsius pour maintenir la chambre vétérinaire à une température constante.

Au fur et à mesure que le système se réchauffe, définissez les paramètres de fonctionnement du spectromètre. Réglez la haute tension du détecteur sur 300 volts et les longueurs d’onde d’émission et d’excitation sur 350 nanomètres avec une largeur de fente de quatre nanomètres. Programmez ensuite le protocole d’acquisition de données en choisissant une acquisition basée sur le temps d’une durée de 3 600 secondes.

Nettoyez soigneusement un vete de fluorescence de 200 microlitres avec une longueur de trajet d’un centimètre en le forniquant dans une solution de nettoyage au bain-marie pendant cinq minutes. Ensuite, préparez 294 microlitres d’un mélange maître pour chacun des neuf tampons de polymérisation décrits dans le protocole de texte d’accompagnement, chacun avec 10 millimolaires de chlorure de magnésium et 12 micromolaires de FDSE comme concentrations finales calculées pour 300 microlitres. Ensuite, brièvement vortex les mélanges transfèrent 196 microlitres du premier tampon de polymérisation au vétérinaire.

Placez-le dans le spectromètre et incubez pendant deux minutes pour amener la température de l’échantillon jusqu’à 30 degrés Celsius. Au bout de deux minutes, démarrez l’acquisition de données et attendez 90 secondes pour vérifier que le signal est stable. Ajoutez ensuite quatre microlitres de 100 millimolaires GTP ou GDP.

Mélangez l’échantillon et poursuivez l’acquisition des données pendant une heure complète. Répétez ces étapes pour chaque tampon répertorié. Préparez 1,5 millilitre de GTP de deux millimolaires dans un tampon de polymérisation choisi.

Préparez également une dilution de l’étalon de phosphate dans la plage de zéro à 40 micromolaires dans le même tampon. Ensuite, préparez le réactif de travail vert de malachite comme décrit dans le kit d’essais biologiques. Ensuite, préparez quatre mélanges maîtres d’un volume total de 360 microlitres chacun : un mélange maître contient du FDSZ dérivé de B subtilis et un mélange principal deux contient du FDSE dérivé d’e coli.

Les mélanges maîtres trois et quatre sont utilisés comme témoins et contiennent de l’EDTA au lieu du chlorure de magnésium. Prochaine pipette 20 microlitres aliquotes des mélanges maîtres et étalons de phosphate. Dans la plaque de puits A-Q-P-C-R 96 de sorte qu’il y ait 16 puits pour chaque mélange maître et les étalons de phosphate disposés comme indiqué ici.

Pipette de 180 microlitres de stock GTP de deux millimolaires jusqu’à la dernière voie de la plaque. Placez ensuite la plaque dans une machine PCR. Exécutez un programme avec un seul cycle réglé à 30 degrés Celsius pendant 40 minutes.

Dans une deuxième pipette à plaque de 96 puits, 20 aliquotes microlitres du réactif de travail vert de malachite dans des puits, A un à H 10. Ensuite, à 60 microlitres du tampon de polymérisation de l’expérience, les revendications A un à H huit, puis à 20 microlitres de la solution GTP à deux millimolaires dans les puits de chaque voie de plaque. L’un à des intervalles prédéterminés, comme indiqué ici, pour examiner la réaction à différents points temporels.

Versez les mélanges de haut en bas pour les mélanger après 30 minutes, en commençant par la première voie de la première plaque, transférez 20 microlitres de la première voie de la première plaque dans la première voie de la deuxième plaque et pipetez de haut en bas pour mélanger. C’est le point de départ du développement de la couleur vert malachite pour la réaction de 30 minutes après 30 minutes et demie, transférez 20 microlitres de la deuxième voie de la première plaque dans la deuxième voie de la deuxième plaque et mélangez. C’est le point de départ du développement de la couleur vert malachite pour la réaction de 20 minutes.

Répétez ces étapes avec les voies restantes de trois à sept à 32e intervalles après 33 minutes et demie à 20 microlitres de GTP jusqu’à la huitième voie sur la première plaque et mélangez. Transférez ensuite 20 microlitres dans le couloir huit sur la deuxième assiette et mélangez. Cela représente la réaction de la minute zéro et est le point de départ du développement de la couleur vert malachite.

Après 34 minutes, ajoutez 80 microlitres du couloir neuf de la première plaque contenant l’étalon de phosphate au couloir neuf de la deuxième plaque et mélangez après 34 minutes et demie, transférez 80 microlitres du deuxième étalon de phosphate du couloir 10 de la première plaque au couloir 10 de la deuxième plaque et mélangez. Retirez ensuite toutes les bulles d’air des échantillons et incubez la plaque à température ambiante pendant encore 25 minutes et demie. Après l’incubation.

Placez la plaque dans un lecteur de plaque à 96 puits à partir de 60 minutes après le début de l’expérience. Mesurez la plaque à 630 nanomètres toutes les 30 secondes pendant cinq minutes afin de prendre 10 points de temps. La première mesure de plaque correspondra à la voie un, la seconde à la voie deux, et de sorte que chaque voie ait eu exactement le même temps pour que la couleur vert malachite se développe.

Ensuite, calculez le phosphate libre dans chaque échantillon à l’aide de la courbe d’étalonnage de l’étalon de phosphate et tracez les données sous forme de libération de phosphate au fil du temps. Calculez ensuite l’activité d’hydrolyse F-D-S-Z-G-T-P à partir de l’intervalle linéaire de la courbe. On voit ici le pourcentage de SEP F et FDSZ dans les pastilles des échantillons.

Le FDSZ n’a été récupéré dans la pastille au-dessus des niveaux de fond que lorsque SEP F et GTP étaient également présents dans l’échantillon. La stœchiométrie exacte de SEPPE et de FDSZ dans ces tubules n’est pas connue, mais ces résultats suggèrent qu’il y a plus de seppe présent que de FDSZ. La diffusion de la lumière de FDSZ de B subtilis et d’e coli est montrée ici, assemblée en présence de deux GTP millimolaires dans le tampon de chlorure de potassium de 50 millimolaires.

F-D-S-E-B-S donne un signal de diffusion de la lumière 20 à 40 fois plus élevé que FDSC EC en fonction du pH tampon. Il est intéressant de noter que l’augmentation de la concentration de chlorure de potassium dans le tampon n’a pas influencé de manière significative le signal de diffusion de la lumière de F-D-S-Z-E-C, mais le signal de F-T-S-Z-B-S a diminué d’environ 80 fois à un pH de 7,5, de 30 fois à un pH de 6,8 et de 45 fois à un pH de 6,5 dans 300 millimolaires de chlorure de potassium par rapport aux tampons contenant 50 millimolaires de chlorure de potassium. L’activité d’hydrolyse du FDSZ a été mesurée dans différentes conditions tampons à l’aide d’un dosage colorimétrique du phosphate libre.

On a constaté que l’activité GTPS de FT SZ augmentait avec l’augmentation de la concentration de chlorure de potassium dans chacune des différentes conditions de pH. À 50 millimolaires de chlorure de potassium, l’activité gtpa a été réduite en raison du regroupement des filaments F-D-S-Z-B-S à 50 millimolaires. Le chlorure de potassium FDSZ EEC avait une activité GTPS trois à six fois plus élevée que F-D-S-Z-B-S en raison d’un désassemblage plus rapide des polymères FDSC EEC.

Enfin, la différence d’activité d’hydrolyse du GTP entre F-D-S-Z-B-S et F-D-S-Z-E-C a été réduite à 300 millimolaires de chlorure de potassium, peut-être en raison de la réduction du regroupement des filaments F-D-S-Z-B-S. Suite à cette procédure, d’autres métaux comme l’électromicroscopie peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires relatives à la structure des polymères fts dans l’échantillon.