Visualisation du flux cytoplasmique pendant la cicatrisation d’une plaie unicellulaire chez Stentor coeruleus

L’objectif global de cette procédure est de mesurer le flux de cytoplasme pendant la cicatrisation des plaies dans une seule cellule. Pour ce faire, il faut d’abord collecter des cellules d’endoprothèse vivante ou de SEIUs pour les utiliser comme système modèle pour les blessures cellulaires. La deuxième étape consiste à préparer les outils en verre pour couper les cellules.

Ensuite, les cellules du stent sarius sont ouvertes sur une configuration de microscope personnalisée qui permet une chirurgie simultanée à faible grossissement et une imagerie à haute résolution. La dernière étape consiste à effectuer une analyse computationnelle du flux cytoplasmique à l’aide d’un logiciel de symétrie de vitesse d’image de particules. En fin de compte, l’imagerie à haute résolution du cytoplasme est utilisée pour montrer la réponse active des cellules pendant la cicatrisation des plaies.

Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés sur la cicatrisation cellulaire des plaies, par exemple si le cytoplasme devient gélifié autour de la région d’une coupure afin d’éviter les fuites dans le milieu environnant. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation et de coupe de l’outil de manipulation des cellules sont difficiles à apprendre car elles nécessitent une dextérité manuelle. Pour commencer à obtenir une endoprothèse ou des cellules Sirius à partir de pons naturels tels que décrits par le tartre ou d’un fournisseur commercial, ajoutez 300 millilitres de stent modifié ou de milieu adapté de recettes par le tartre et dissuadez comme décrit dans le protocole de texte ci-joint.

Entretenez les cultures en les cultivant dans l’obscurité à 20 degrés Celsius. Ensuite, cultivez des cultures de chlamydomonas Rhine Algues rustiques dans un milieu phosphate tris acétate. À l’aide de méthodes de culture standard avant de les nourrir, lavez les cellules de Chlamydomonas en les faisant tourner doucement vers le bas, en retirant le surnageant et en les suspendant dans l’endoprothèse ou le milieu modifié.

Nourrissez le stent de 300 millilitres ou les cultures de sarius avec environ 30 millions de cellules chm deux ou trois fois par semaine si nécessaire. Prélever une endoprothèse ou des cellules pour la chirurgie. Pour commencer, agitez doucement la culture en faisant bouillonner l’air à travers la pointe d’une pipette jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher et à nager librement.

Capturez ensuite les cellules natatoires à l’aide d’une pipette d’un millilitre équipée d’une pointe à large alésage pour éviter de cisailler les cellules. Une fois collectées, laissez les cellules se déposer. Ensuite, pipetez lentement le milieu au-dessus d’eux et ajoutez un stent ou un milieu modifié frais.

Préparez les aiguilles de verre utilisées pour couper les cellules du stent en tenant deux tiges d’agitation en verre au-dessus de l’abondance et du brûleur jusqu’à ce que les extrémités commencent à fondre. Touchez ensuite les extrémités des deux tiges jusqu’à ce que le verre fondu fusionne. Une fois qu’ils ont fusionné, retirez-les du feu et laissez-les refroidir pendant une à deux secondes.

Ensuite, séparez-les lentement pour faire une pause nette. Idéalement, cela produira une aiguille d’environ un à deux centimètres de long avec une pointe fine à l’extrémité. Si l’aiguille résultante n’est pas optimale, cassez la pointe dans la taille du verre et réutilisez les tiges.

Ensuite, utilisez un tampon en caoutchouc carré recouvert de vaseline pour préparer une chambre carrée à paroi de vaseline en la pressant dans une lamelle en verre. Ajoutez ensuite 100 microlitres de stent modifié ou de milieu contenant 2 % de méthylcellulose au carré de vaseline. Placez la lamelle préparée dans un adaptateur en plastique, puis ajoutez les cellules du stent lavées à la lamelle.

Enfin, disposez les cellules dans la méthylcellulose de manière à ce qu’elles soient régulièrement espacées et qu’elles soient poussées suffisamment près de la surface de la lamelle pour être nettes pendant l’imagerie. Pour commencer, placez la lame sur la platine du microscope inversé. Retirez ensuite le corps du microscope de dissection de son support et déterminez la position approximative dans laquelle il devra être placé afin de visualiser la lame à faible grossissement depuis le haut.

Ensuite, construisez un microscope à deux étages en ajoutant une boîte en carton avec l’espacement souhaité entre l’oculaire du microscope inversé et la lunette de dissection. Collez la boîte en place à l’aide de ruban adhésif de laboratoire afin qu’elle puisse être facilement retirée Une fois l’expérience terminée, assurez-vous que l’échantillon sera dans le champ de vision et net sans avoir besoin de déplacer la lunette de dissection Une fois qu’elle est fixée, tenez la lunette de dissection contre la boîte et collez-la sur la boîte à l’aide de ruban adhésif de laboratoire. Ensuite, installez le microscope inversé à l’aide de l’optique DIC en mettant en place un objectif aérien 20x.

Assurez-vous également d’utiliser un condenseur DIC à longue distance de travail pour fournir suffisamment d’espace pour effectuer la microchirurgie par le haut. Ensuite, faites la mise au point sur les cellules avec le microscope inversé avec tout préparé et net des deux côtés. Commencez à acquérir des images à une fréquence d’images de deux images par seconde, à l’aide d’une caméra CCD cinq 12 x cinq 12.

Coupez ensuite la cellule à l’aide de l’aiguille de verre. Capturez le modèle de flux cytoplasmique initial et observez toutes les étapes du processus de plaie et de cicatrisation des plaies. Terminez l’acquisition lorsque la cellule a repris son aspect normal ou a recommencé sa motilité active.

Pour commencer, téléchargez PIV lab, un package MATLAB permettant de mesurer le flux cytoplasmique à l’aide de la symétrie véloque de l’image de particules. Ensuite, chargez la pile d’images TIFF pour chaque séquence vidéo dans le programme de symétrie vitesse de l’image de particules dans le manuel MATLAB. Générez manuellement un masque pour chaque pile d’images afin de masquer les régions des données brutes à l’extérieur du corps de l’endoprothèse.

Configurez ensuite PIV lab pour qu’il utilise le paramètre de transformée de Fourier rapide et une taille de bac de 64 x 64 pixels, qui divisera les pixels de chaque image en pixels carrés plus grands. Exécutez ensuite PIV lab pour calculer les corrélations croisées entre les pixels de chaque image et les pixels voisins. Dans l’image suivante, cela produira un vecteur d’écoulement dépendant du temps centré sur chaque pixel de pliage, qui a la même résolution temporelle que les données brutes.

Calculez ensuite les moyennes temporelles de la sortie du champ vectoriel résultant afin de comparer les données prises avec le stent avant la coupe et pendant la cicatrisation de la plaie. Calculez également des histogrammes de vitesses d’écoulement pour étudier l’intensité de l’écoulement et le changement de vitesse à un pixel donné au fil du temps afin d’étudier les fluctuations de l’écoulement. Lors de l’imagerie de séquences avec le stent ou la cellule clivé en deux, calculez le flux total de cytoplasme dans le corps cellulaire proprement dit en multipliant la vitesse d’écoulement moyenne par la section transversale de la base de la bulle de cytoplasme extracellulaire.

Voici l’imagerie en direct d’un stent ou d’une cellule alors qu’il est coupé et perturbé avec une aiguille de verre. Après la coupe, une quantité substantielle de cytoplasme a été retirée du corps cellulaire principal, mais elle retourne rapidement dans la cellule. À la suite de cette procédure, des inhibiteurs chimiques peuvent être ajoutés afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les composants cytosquelettiques qui pourraient contribuer au mouvement cytoplasmique pendant la cicatrisation de l’endoprothèse ou de la plaie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les outils pour couper le stent dans nos cellules et comment imager le flux cytoplasmique pendant le processus de coupe et de cicatrisation des plaies au sein de la cellule géante unique.