Déclenchement à distance magnétique de sondes micrométriques pour

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser en C deux mesures des propriétés physiques locales d'un biofilm bactérien à l'échelle micrométrique. Pour ce faire, des particules magnétiques sont introduites dans un biofilm en croissance afin de servir de sondes pouvant être activées à distance sans perturber les propriétés structurales du biofilm. Des pinces magnétiques dédiées sont ensuite utilisées pour exercer une force définie sur chaque particule.

Lorsqu'elles sont intégrées dans le biofilm, les déplacements des particules induits par la traction magnétique sont suivis par microscopie vidéo afin de déterminer les paramètres viscoélastiques locaux et d'obtenir la distribution spatiale tridimensionnelle des propriétés mécaniques du biofilm. Les résultats obtenus révèlent l'hétérogénéité mécanique du biofilm de E. coli et fournissent des indices sur les composants du biofilm qui en soutiennent les propriétés physiques. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie, la rhéologie ou l'analyse de l'ensemble de la végétation bactérienne réside dans sa capacité à rendre compte in situ de la distribution spatiale des propriétés mécaniques sans perturber la structure d'origine du matériau.

Pour préparer les particules magnétiques pour ce protocole, vortexer le flacon stock de particules de 2,8 micromètres afin de les resuspendre. Ensuite, transférer 10 microlitres dans un tube de microcentrifugeuse. Puis, pour laver les particules, ajouter 190 microlitres de milieu minimum et agiter doucement le tube, le placer sur un support magnétique, attendre la formation d’un culot et aspirer la solution surnageante.

Répétez cette étape de lavage deux fois supplémentaires et resuspendez les billes dans 190 microlitres de milieu minimal. Ensuite, ajoutez 950 microlitres de M 63 B1 contenant 0,4 % de glucose à 50 microlitres de la solution de billes lavées afin d'ajuster la concentration en particules à environ 5 millions de billes par millilitre. Pour préparer le canal, utilisez un coupe-verre au diamant pour couper deux capillaires carrés en verre borosilicaté de 10 centimètres de long afin d'obtenir deux morceaux de huit centimètres de long.

À l’aide du coupe-verre, coupez une lame de verre en deux. Ensuite, à l’aide d’une colle cyanoacrylée à prise rapide ou d’une super colle, fixez les deux morceaux de capillaires sur deux morceaux de lames de verre comme indiqué sur ce schéma. Disposez-les à deux centimètres d’intervalle, avec un débordement d’un centimètre à chaque extrémité, puis stérilisez l’ensemble du montage ainsi que les tubes nécessaires par autoclavage.

Pour la connexion supplémentaire de canaux, rassemblez les matériaux stériles suivants sous une hotte à flux laminaire. Les tubes et raccords de canal montés, deux filtres ou pièges à bulles pédiatriques, deux pinces, des seringues de 30 millilitres remplies de M 63 B, 1,4 % de glucose, ainsi que la bouteille de déchets.

Connectez les deux capillaires de la même manière. À l’aide de l’un des tubes, reliez la bouteille de déchets à une extrémité du capillaire.

Ensuite, à l'aide de connecteurs à verrouillage comme jonctions, reliez l'autre extrémité du capillaire au piège à bulles maison ou du piège un au piège deux. Puis, reliez la seringue de 30 millilitres M 63 B un au piège deux. Ensuite, remplissez le dispositif avec du M 63 B un stérile contenant 0,4 % de glucose.

Installez la seringue sur la pompe à seringue et mettez la pompe en marche à un débit d'environ cinq millilitres par heure supérieur aux débits expérimentaux. Surveillez attentivement et éliminez toutes les bulles dans le circuit si nécessaire. Débranchez et rebranchez le circuit tout en effectuant cette procédure.

Veillez soigneusement à éliminer toutes les bulles avant et lors de l'introduction du mélange de particules cellulaires dans le tube, il est utile de placer la poubelle au-dessus des capillaires, ce qui favorisera la croissance continue du biofilm. Laissez le milieu circuler dans le système pendant 10 à 15 minutes. Pendant ce temps, dans un tube de microcentrifugeuse, mélangez un millilitre de la suspension bactérienne à une densité optique de 0,5 avec un millilitre de la solution de billes lavées préparée précédemment.

Arrêtez l'écoulement, rebranchez le tube et fermez ensuite les pinces. Ensuite, remplissez une seringue d'un millilitre avec le mélange de billes bactériennes et introduisez-le dans le capillaire. Après le piège à bulles maison, déplacez l'appareil sous le microscope situé là-bas.

Installez le capillaire sur la platine du microscope et placez le récipient de déchets à un niveau légèrement plus élevé. Placez la pompe à seringue sur le plan de travail à côté du microscope. Laissez l'appareil reposer de 15 à 20 minutes afin de permettre aux bactéries de se déposer et de s'attacher à la surface du capillaire.

Une fois que les bactéries se sont fixées sur le capillaire, ouvrez les pinces et réglez le débit sur la pompe à seringue, puis démarrez l'écoulement. Au cours des 24 à 48 heures suivantes, un biofilm se développe sur la surface du capillaire, en se concentrant sur le plan inférieur du capillaire, et commencez l'enregistrement en lapse de temps des images de l'échantillon. Généralement, une fréquence d'acquisition de deux images par minute permet de rendre compte adéquatement de la croissance du biofilm.

Ce film montre le stade initial du biofilm juste après l'injection du mélange de particules cellulaires. Dans l'acquisition capillaire, la fréquence est d'une image par seconde, et le film est lu à 10 images par seconde. Après quatre heures de croissance, les particules se sont progressivement détachées de la surface pour se répartir dans le volume du biofilm.

Les flèches bleues indiquent les événements de détachement. Ici, la fréquence d'acquisition est de deux images par minute, et la vidéo est lue à 15 images par seconde. Après 20 heures de croissance, une douzaine de particules uniformément réparties peuvent être surveillées dans un plan focal.

Ce film a été pris dans un plan médian, à 20 micromètres au-dessus du fond du capillaire. Deux images ont été acquises par minute. Le film est lu à 15 images par seconde.

Une fois que le biofilm semé avec des particules magnétiques se développe manuellement, vissez les pinces magnétiques sur la platine du microscope. Pour garantir la génération de gradients de champ magnétique appropriés dans la zone d'observation, assurez-vous que les pinces sont placées comme indiqué sur ce diagramme, dans lequel la région de mesure représentée en rouge se situe à 300 micromètres des bords des pôles gauche et droit des pinces le long de l'axe Y. Le fond du capillaire est placé à 200 micromètres sous le bas des pinces magnétiques.

Pour réaliser cette étape, utilisez la commande de déplacement XY de la platine du microscope afin d'aligner le bord du pôle magnétique gauche avec le bord gauche du capillaire. Dans le même champ d'observation, ajustez la position du pôle à 300 micromètres du bord du capillaire à l'aide du bouton x du micromanipulateur gauche des pinces. Effectuez la même opération du côté droit.

Ensuite, ajuster la position des pinces le long de l'axe Z par rapport au fond du capillaire. Tout d'abord, aligner le bas des pôles avec le fond du capillaire, puis déplacer les pôles de 200 micromètres vers le haut.

À l’aide du cadran Z du micromanipulateur, régler les paramètres du générateur de fonctions sur 24 secondes de signal nul et 16 secondes à quatre ampères. Courant continu avec déclenchement. Envoyer au obturateur de la lumière en champ clair après 20 secondes.

Pour la synchronisation du signal, reliez la pince au générateur de fonctions à l’aide de l’amplificateur de puissance. Veillez à connecter correctement les pôles en série afin d’obtenir des courbes de fluage spatialement distribuées. Définissez une origine spatiale, en prenant l’origine de l’axe Z au bas intérieur du capillaire.

Prenez note de la position du contrôle Z du microscope. Ensuite, repérez l'intersection des axes x et Y, définis respectivement par le bord de la capillarité et le bord du piège polaire. Ce point constitue l'origine de l'analyse.

Prenez note des coordonnées. Toutes les coordonnées seront prises par rapport à cette origine dans la suite. Une fois que le biofilm a poussé, utilisez le bouton de réglage fin de mise au point pour ajuster la position verticale du capillaire de manière à ce que le premier plan se situe à quatre à sept micromètres au-dessus du fond du capillaire.

Cette coupe correspond à la coupe de biofilm dans laquelle l'origine du repère spatial est située en haut à gauche. Ensuite, allumez le générateur de courant et déclenchez manuellement la séquence d'acquisition d'images. Pour initier la 42e séquence d'événements, le flux d'images acquis ici correspond à un plan donné et à un champ XY.

Une fois la séquence capturée, déplacer la capillarité pour enregistrer une vidéo d'un nouveau champ. Continuer à répéter ce processus afin d'obtenir toutes les vidéos nécessaires à l'analyse des données. Ouvrir les images dans ImageJ ou un logiciel équivalent de suivi de particules pour toutes les séries acquises concernant l'ensemble des particules.

Convertir les images en fichiers texte en suivant le déplacement des particules. Ensuite, à l'aide d'un logiciel de traitement des données, tracer les courbes de déplacement et convertir ces courbes de déplacement en courbes de compliance, dans lesquelles la compliance totale du matériau JFT est calculée en fonction du temps selon la formule de compliance indiquée ici. Cette formule décrit la relation entre la contrainte appliquée et la déformation du matériau pour une particule témoin rouge, ou intégrée dans un milieu viscoélastique et incompressible, comme cela a été établi précédemment par lui et ses collaborateurs. À partir de l'ajustement de la courbe de compliance en fluage au modèle général de Burgers pour les matériaux viscoélastiques, déduire les paramètres viscoélastiques J zéro, J un, η zéro, η un prime, afin de fournir la distribution spatiale des propriétés viscoélastiques. Des courbes de fluage ont été enregistrées à différentes profondeurs dans un microvolume de biofilm d'environ 200 par 200 par 40 micromètres cubes. Des résultats typiques sont présentés ici.

Les valeurs de J zéro, la compliance élastique, sont données en fonction de l'axe Z selon la profondeur et de l'axe Y selon une dimension latérale du biofilm. Chaque point correspond à une microbille pour laquelle l'analyse de la courbe de fluage a fourni une valeur de J zéro. Les données révèlent que la compliance locale varie selon la profondeur du biofilm sur près de trois ordres de grandeur.

En outre, une forte hétérogénéité latérale s'est produite à toutes les hauteurs du biofilm. Les données fournissent également la distribution des valeurs de compliance, qui présentent une forme étendue et asymétrique. La comparaison de ces résultats avec ceux obtenus précédemment sur d'autres polymères biologiques suggère que les propriétés mécaniques du biofilm sont assurées par des gels polymériques fortement réticulés.

Dans le cas C, deux mesures du biofilm ont également été effectuées afin d'analyser les propriétés locales sous différentes conditions environnementales, comme un débit plus faible, tel qu'illustré ici. Les valeurs de compliance d'un biofilm cultivé à 0,1 millilitre par heure présentent toujours un profil mécanique fortement hétérogène. Toutefois, la dépendance claire de la rigidité du biofilm par rapport à la profondeur en Z, observée dans le biofilm cultivé à un millilitre par heure, a disparu.

Ces résultats démontrent l'impact significatif des conditions externes sur l'organisation du biofilm en regardant la vidéo. Vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de cartographier les propriétés viscoélastiques de l'Institut du biofilm dans des conditions de croissance entièrement contrôlées.