Name: Méthodes pour étudier les mécanismes daction des antipsychotiques dans Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez des méthodes pour étudier les effets des antipsychotiques sur le développement et le pompage pharyngé chez Caenorhabditis elegans. Ces protocoles permettent d'évaluer les mécanismes d'action des médicaments.

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Le travail a été soutenu par une NIH prix scientifique de développement clinique K08NS002083, une subvention de l&#39;Institut de recherche Shervert Frazier, et le Prix du jeune chercheur NARSAD à Edgar A. Buttner.

Une. Retard de développement / test de létalité: Le type sauvage (N2) et deux souches mutantes (MUT1 et Mut2) sont testés dans trois concentrations de clozapine dans une plaque de 12 puits <ol><li> Au jour 1, verser 2 ml NGM support 10 dans chaque puits d&#39;une plaque de 12 puits (chaque puits d&#39;un diamètre de 2 cm) et laisser durcir sur le banc à la température ambiante (RT) pendant la nuit. Le même jour, choisir une colonie de bactéries Escherichia coli OP50, infecter une bouteille de 50 ml de solution LB, et de la culture dans un shaker 37 ° C à 220 rpm rotation pendant la nuit. </li><li> Le jour 2, transférer 20 culture bactérienne ul OP50 sur le centre de chaque NGM bien. Incuber les plaques dans un incubateur à 37 ° C ou les laisser à la température ambiante pendant une nuit pour permettre au tapis bactérien de croître plus épais. </li><li> Faire une clozapine solution stock de 80 mM en dissolvant la clozapine dans le DMSO (diméthylsulfoxyde) solvant. Ensuite, faire une solution de travail de 80 pi avec la solution mère diluée dans 1,7 mM d&#39;acide acétique belon sur le tableau 1. Remarque: La solution de travail pour un médicament d&#39;intérêt particulier doit être déterminée en faisant une série de tests de concentration préliminaires pour trouver la concentration la plus appropriée pour distinguer le type sauvage des mutants. </li><li> Transfert de 80 ul solution de travail clozapine sur la plaque NGM ensemencé bien et agiter la plaque pour permettre la solution afin de répartir uniformément sur la surface. Attendez que la plaque sécher. Utilisation de la plaque pour le dosage, le même jour ou le placer dans un incubateur à 20 ° C pour être utilisé le jour suivant. Remarque: La solution de travail est une suspension de médicament en raison de la faible solubilité de la clozapine, en particulier à une concentration plus élevée. Par conséquent, le tube vortex avant de transférer la solution à la plaque de médicament, afin de garantir que la concentration de médicament est exacte. </li><li> Lavez vers une assiette de 3,5 cm contenant de nombreux adultes gravides avec le tampon M9 puis tournez-les dans un tube de 15 mlà 2000 rpm pendant 1 min. </li><li> Aspirer le surnageant. Ajouter 5 ml de solution d&#39;eau de Javel (NaOH: hypochlorite: le trou DDH 2 O à 04:01:05) et perturber les nématodes en retournant doucement les tubes. </li><li> Observer les animaux jusqu&#39;à ce que la moitié d&#39;entre eux sont dissous à environ 5 min. Centrifuger les œufs à 2000 rpm pendant 1 min. </li><li> Aspirer le surnageant et ajouter rapidement 14 ml de tampon M9. </li><li> Isoler les œufs à 2000 rpm pendant 1 min et aspirer le surnageant, laissant environ 100 solution ul. Vortex pour suspendre les oeufs. </li><li> Transfert 2 oeufs ul suspension dans M9 sur une plaque NGM régulière pour tester combien d&#39;oeufs sont transférés. Réglez le volume des œufs en suspension pour assurer qu&#39;il ya environ 30-35 œufs dans chaque transfert. Transférer 30 à 35 œufs dans chaque puits de la plaque de dosage et ensuite incuber dans un incubateur à 20 ° C pendant 24 heures. </li><li> Au premier jour de l&#39;essai, marquer le nombre d&#39;œufs éclos. Réglez le nombre total d&#39;animaux éclos à 25/well par picking hors les vers supplémentaires si nécessaire. </li><li> Les jours suivants, observer les animaux et de les marquer tous les 24 heures. Stade développement est reçu sur la base de la taille de l&#39;animal et la forme de la vulve 11. L&#39;expérience dure 5-6 jours avec l&#39;effet le plus robuste typiquement vu sur le troisième ou le quatrième jour. </li><li> Saisissez les données dans un fichier Excel et calculer le pourcentage d&#39;animaux à chaque étape de développement pour chaque jour de l&#39;expérience. Générer des graphiques avec la fonction &#39;100% Stacked colonne &quot;dans la colonne &#39;2 D &#39;menu. </li></ol> 2. Pharyngée pompage Dosage: Jeune adulte Animaux pour le type sauvage et souches mutantes sont notés sur la clozapine dosage plaques <ol><li> La plaque d&#39;essai est faite suivant le même protocole utilisé pour le dosage retard / de létalité de développement. </li><li> Choisissez 50 animaux L4 pour chaque souche de plaques NGM ensemencées 24 heures avant l&#39;essai et incuber les vers à 20 ° C. </li><li> Choisissez 10 animaux à un assay plaque bien. Ensuite, prenez 10 animaux à l&#39;autre et toutes les 15-20 minutes. </li><li> Après les animaux dans le premier puits ont été exposés au médicament pendant 30 minutes, commencer l&#39;essai en observant pharyngée pompage sous un microscope à dissection et marquer les pompes pendant 20 sec 9. Une fois pharyngée pompage est marqué, ramasser le ver de la plaque. </li></ol>

<ol><li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+%28PI3K%29%2Finsulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li>
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<li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
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<li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Res%22%5BJournal%5D)">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+effects+of+clozapine%3A+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li>
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<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;il n&#39;y a pas de conflit d&#39;intérêt en cause.

Ici, nous décrivons les méthodes pour tester les effets des APD sur le développement et le comportement de C. elegans. DMSO ou de l&#39;éthanol est utilisé pour dissoudre la clozapine, étant donné que le médicament est relativement insoluble dans l&#39;eau. Parce que les solvants ont été signalés à affecter C. elegans biologie 12, le DMSO seul ou groupes de contrôle éthanol seul sont essentiels. La plus forte concentration de DMSO utilisés dans nos essais est jusqu&#39;à 3%, qui n&#39;a pas ...

Caenorhabditis elegans est un organisme génétique simple prêtent à grande échelle écrans génétiques avant et arrière et des écrans génétiques chimiques. C. elegans est sensible à un large spectre de composés bioactifs et a donc été utilisée avec succès pour déterminer les mécanismes d&#39;action de ces divers composés. Par exemple, les composés bioactifs étudiés en utilisant la pharmacogénétique à vis sans fin comprennent des agonistes des récepteurs de l&#39;acétylcholine (par exemple, lévamisole, la nicotine, morantel, et pyrantel), anesthésiques (par exemple, l&#39;halothane), la caféine, les inhibiteurs de cholinestérase (par exemple, l&#39;aldicarbe, Lannate, et trichlorfon), le fluorure, le GABA-connexes composés (par exemple GABA et muscimol), l&#39;ivermectine, le paraquat, les esters de phorbol et les médicaments liés à la sérotonine (par exemple, la sérotonine et imiprimine) 3. Par ailleurs, C. elegans a été utilisé pour les écrans de petites molécules à grande échelle, permettant la découverte d&#39;un nouveau composé bioactifs et l&#39;identification de cibles génétiques nouveaux 4. Le C. génome elegans comprend médicament antipsychotique potentiel (APD) des cibles conservées chez l&#39;homme, y compris les gènes codant pour des protéines nécessaires à la synthèse des neurotransmetteurs et pour la structure et la fonction synaptique 5. Ainsi, C. elegans neurogénétique et offre de neurobiologie méthodes pour découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires d&#39;action des APD. Dans les nématodes, exposition APD tôt dans le développement produit un retard de développement, et à des concentrations plus élevées, la létalité 2,6. Exposition APD à l&#39;âge adulte produit phénotypes comportementaux. Par exemple, l&#39;exposition clozapine inhibe la locomotion et du pharynx pompage et améliore la ponte 1,2,7. Retard de développement APD-induite et la létalité sont des phénotypes puissants pour grands écrans génétiques chimiques. Ces phénotypes sont complexes dans la mesure où ils ont probablement plus d&#39;un basi cellulaires et génétiquess. Par conséquent, ces écrans génétiques devraient donner une variété de cibles indirectes de drogue. Cependant, notre laboratoire a effectué des écrans de gènes candidats et un écran ARNi à grande échelle pour des suppresseurs de retard de développement APD-induite et de la létalité et les gènes qui codent probablement des cibles directes, y compris la dopamine, l&#39;insuline et les récepteurs nicotiniques de l&#39;acétylcholine 2,8 a réussi à récupérer. Cribles génétiques basés sur les comportements APD-induits chez l&#39;adulte ont également conduit à l&#39;identification de nouvelles cibles APD, et nous sommes maintenant la validation de cibles à partir des écrans à la fois développement et de comportement chez les mammifères 7. Ainsi, une approche génétique chimique invertébrés de découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires d&#39;action des APD semble réalisable 5,8. Le C. elegans pharynx est un organe qui comprend 20 neurones, 20 des cellules musculaires, et les 20 cellules accessoires, enveloppés par une membrane basale. Semblable à cœur de mammifère, le pharynx est un autonomend pompes constamment aliment depuis l&#39;environnement externe 9. Inhibition de la vitesse de pompage du pharynx compromet l&#39;absorption de nourriture, et donc des mutations ou des médicaments qui inhibent pharyngée pompage cause de retard de développement ou arrêter 9. APD inhibent le taux de pompage du pharynx, soit dans le cadre de leurs effets sur le développement et la viabilité 1,2. Ici, nous utilisons la clozapine APD atypique comme un exemple pour démontrer dosages de médicaments pour le développement des nématodes et du pharynx pompage.

<table><tbody><tr><td>Clozapine</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique (HAC)</td><td>Fisher</td><td>BP2401</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>EMD</td><td>SX0590-13</td><td></td></tr><tr><td>Hypochlorite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur d’incubateur</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1246-0006</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à basse température 815</td><td>Precision Scientific</td><td>J1790-1B</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 35 x 10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9434271</td><td></td></tr><tr><td>12 puits Plaque de culture tissulaire</td><td>BD Falcon</td><td>REF 353043</td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes pour étudier les mécanismes d&#39;action des antipsychotiques dans<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans est un organisme génétique simple prêtent à grande échelle avant et arrière écrans génétiques et les écrans génétiques chimiques. Le C. génome elegans comprend médicament antipsychotique potentiel (APD) des cibles conservées chez l&#39;homme, y compris les gènes codant pour des protéines nécessaires à la synthèse des neurotransmetteurs et pour la structure et la fonction synaptique. Exposition APD produit retard et / ou la létalité chez les nématodes de développement d&#39;une manière dépendante de la concentration. Ces phénotypes sont dus, en partie, par l&#39;inhibition induite APD de 1,2 pharyngée pompage. Ainsi, le phénotype de développement a une base neuromusculaire, ce qui est utile pour des études pharmacogénétiques des neuroleptiques. Ici, nous démontrons des procédures détaillées pour tester les effets APD sur le développement des nématodes et du pharynx pompage. Pour le dosage du développement, les embryons sont placés synchronisés sur un milieu de croissance de nématodes (NGM) des plaques contenant APDs, et les stades de développement de l&#39;anusmaux sont ensuite marqués quotidien. Pour le test de débit de pompage du pharynx, mis en scène de jeunes animaux adultes sont testés sur des plaques NGM contenant APD. Le nombre de pompes du pharynx par unité de temps est enregistré, et le débit de pompage est calculé. Ces dosages peuvent être utilisés pour l&#39;étude de nombreux autres types de petites molécules ou même de grandes molécules.

Une. Le retard de développement / résultat du test de létalité Un résultat typique pour le dosage de retard / de létalité de développement est mise en évidence sur les figures 1a et 1b. Lorsque les animaux sauvages dans le groupe de contrôle ont grandi à l&#39;âge adulte gravide (figure 1a), les animaux de type sauvage exposées à la clozapine sont encore dans les jeunes stades larvaires ou sont morts (figure 1b). Figure 1c mont...

Approches pour tester les effets des médicaments antipsychotiques (APDS) dans Caenorhabditis elegans sont démontrés. Les dosages sont décrits pour tester les effets des médicaments sur le développement et sur la viabilité et le taux de pompage du pharynx. Ces méthodes sont également applicables pour les expériences pharmacogénétiques avec d&#39;autres classes de médicaments que les PDA.

Méthodes pour étudier les mécanismes d&#39;action des antipsychotiques dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

L’objectif général de cette procédure est d’examiner les effets des médicaments antipsychotiques sur le développement et le pompage pharyngé de l’elgan de mer. Ceci est accompli en augmentant d’abord une population de nématodes adultes et à partir de ceux-ci, en générant une population synchronisée d’animaux. L’étape suivante consiste à transférer des œufs synchronisés ou des adultes dans des plaques d’essai contenant des médicaments.La dernière étape consiste à observer et à noter les effets des médicaments sur les vers. En fin de compte, les résultats peuvent montrer que les médicaments antipsychotiques retardent le développement et inhibent le pompage pharyngé chez les animaux exposés au médicament. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des mécanismes d’action des médicaments antipsychotiques, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres petites molécules et même de grandes molécules telles que les lipides.Commencez par charger une plaque de 12 puits avec deux millilitres de NGM, moyen par puits. Mettez la plaque de côté pour qu’elle durcisse à température ambiante. Ensuite, choisissez une colonie de bactéries OP 50 et transférez-la dans une bouteille de 50 millilitres de culture LB.Les bactéries passent la nuit à 37 degrés Celsius avec agitation à 220 tr/min le lendemain dans chaque puits de la plaque préparée. À 20 microlitres de la culture bactérienne, réglez la plaque pour incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain. Chargez chacun bien assis avec 80 microlitres de médicament d’intérêt à la concentration de travail.Dans ce cas, le médicament est la clozapine C. Assurez-vous de vortex la solution avant de prendre des aliquotes. Faites tourner la solution pour la répartir uniformément dans le puits et laissez-la absorber à température ambiante avec le couvercle de la plaque retiré.Procédez ensuite au test ou conservez la plaque à 20 degrés Celsius pendant la nuit et commencez le test le lendemain. Commencez par prélever des œufs du génotype d’intérêt. Commençons par une population de vers avec de nombreux adultes GR.Lavez les vers dans une plaque de 3,5 centimètres à l’aide d’un tampon M nine. Ensuite, faites-les tourner dans un tube de 15 millilitres à 2000 tr/min pendant une minute. Retirez le surnageant par aspiration et remplacez-le par cinq millilitres d’eau de Javel.Ensuite, perturbez doucement les adultes en inversant le tube et attendez que les animaux commencent à se dissoudre continuellement. Observez les vers qui se dissolvent sous la lunette. Quand environ la moitié des vers se sont dissous.Après environ cinq minutes, faites tourner le tube pour recueillir les œufs, aspirez le surnageant et remplacez-le rapidement par un tampon M neuf. Ensuite, faites tourner le tube à nouveau comme avant et retirez tout sauf environ 100 microlitres du surnageant M neuf. Pour suspendre les œufs, vortex le tube.Transférez ensuite deux microlitres de suspension dans une plaque NGM et comptez le nombre d’œufs transférés. Chargez ensuite la plaque traitée avec 30 à 35 œufs par puits et incubez la plaque à 20 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, notez le nombre d’œufs éclos.Si plus de 25 vers sont présents dans l’un d’eux, éliminez bien les vers en excès. Remettez les vers sur la plaque dans l’incubateur pour une observation ultérieure à des intervalles de 24 heures chaque jour, notez le stade de développement des vers dans les puits en fonction de la taille des vers et de la forme de leurs vulves. Des effets robustes sont généralement observés le troisième et le quatrième jour.L’expérience devrait durer environ une semaine. Pour ce protocole, préparez des plaques de test de drogue comme décrit précédemment la veille, en lançant le test. Choisissez 50 L d’animaux à quatre stades pour chaque génotype de l’expérience.Transférez-les sur des plaques NGM et incubez les plaques pendant 24 heures à 20 degrés Celsius. Le lendemain, toutes les 15 à 20 minutes, chargez bien un test avec 10 animaux après qu’un groupe ait été exposé au médicament pendant une demi-heure. Commencez à observer leur pompage pharyngé au microscope de dissection.Tout d’abord, trouvez un ver, puis comptez ses pompes pharyngées pendant 20 secondes. Une fois marqué, retirez le ver de la plaque. Entaillez tous les vers dans le puits de la même manière.Les résultats attendus de la réalisation du délai expérimental. L’essai de létalité avec des témoins de type sauvage devrait montrer que, contrairement au taux de croissance typique jusqu’au stade adulte grave, les animaux exposés à la clozapine c sont encore aux stades larvaires jeunes ou sont morts. Universellement, la létalité de la muette un était inférieure à celle du type sauvage, et la létalité de la muette deux était plus élevée que prévu par rapport au contrôle : les animaux muets survivants sont plus capables de se développer, tandis que les survivants muets deux sont plus retardés.Un examen plus approfondi a révélé que l’exposition à la clozapine réduisait les taux de pompage pharyngé en fonction de la concentration. Cependant, la diminution du taux de tubercule un était inférieure à celle du type sauvage, tandis que le taux réduit de la tuberculose deux était supérieure à celle du type sauvage. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un dosage de médicaments antipsychotiques à petite échelle.Le message peut également être étendu pour effectuer un dépistage génétique à grande échelle.

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Une méthode d’imagerie basée sur un smartphone pour le test d’évitement de pelouse de C. elegans

Une méthode de transfert de gènes dans le cerveau de souris en développement est décrit en utilisant une méthode unique de chirurgie et la forme particulière des électrodes. Cette technique unique permet la transfection d'ADN plasmidique temporellement et spatialement, ce qui aidera de nombreux neuroscientifiques à étudier le développement du cerveau.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

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Méthodes pour étudier les mécanismes d'action des antipsychotiques dans

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