Name: Les xénogreffes orthotopiques primaires de gliome récapitulent la croissance infiltrante et la mutation de l’isocitrate déshydrogénase I (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Découvrez comment générer des xénogreffes orthotopiques primaires de gliome pour modéliser la croissance infiltrante et les mutations IDH dans des modèles animaux précliniques. Cette méthode permet d'étudier la biologie tumorale et les réponses thérapeutiques.

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Nous sommes particulièrement redevables aux patients du Centre médical de l’Université Vanderbilt qui ont fourni du matériel de recherche inestimable pour la Banque de tissus neurochirurgicaux moléculaires. Nous remercions ceux qui ont établi et maintenu la Banque de tissus, Reid C. Thompson MD (chercheur principal), Cherryl Kinnard INF (infirmière de recherche) et Larry A. Pierce MS (gestionnaire). Les services histologiques ont été effectués, en partie, par la ressource partagée en pathologie translationnelle du Centre médical de l’Université Vanderbilt (VUMC) (soutenue par le prix 5P30 CA068485 au Centre de cancérologie Vanderbilt-Ingram). Ce travail a été soutenu par des subventions à MKC du NINDS (1R21NS070139), du Burroughs Wellcome Fund et des fonds de développement VMC. MKC est appuyé par le ministère des Anciens Combattants, l’Administration de la santé des anciens combattants, le Bureau de la recherche et du développement, la recherche et le développement en laboratoire biomédical au moyen de la subvention 1 I01 BX000744-01. Le contenu ne représente pas les points de vue du ministère des Anciens Combattants ou du gouvernement des États-Unis.

1. Préparation de la suspension de cellules tumorales
Remarque : Des approbations institutionnelles appropriées pour l’utilisation du matériel patient et des animaux sont requises pour établir et maintenir des xénogreffes orthotopiques primaires de gliome. Au Centre médical de l’Université Vanderbilt, le matériel tumoral réséqué qui est supérieur à celui requis à des fins diagnostiques est recueilli avec le consentement du patient pour un dépôt de tissus de recherche. Les échantillons sont étiquetés avec un numéro de base de données REDcap à 5 chiffres randomisé et tous les identificateurs spécifiques au patient sont retirés. La base de données REDcap contient des données cliniques dépersonnales pour chaque échantillon dans le dépôt de tissus qui comprennent le sexe, l’âge (en années), la race, l’état de survie, la pathologie, les traitements du cancer, l’année de résection et le temps de progression. Pour maintenir la stérilité et optimiser le succès de la méthode de xénogreffe primaire, tous les réactifs, les instruments chirurgicaux autoclavés à la vapeur et le site chirurgical doivent être assemblés ou préparés à l’avance.
Remarque : Les spécimens de gliome contiennent souvent de grandes quantités de myéline et de débris. Selon la taille de l’échantillon, il peut être nécessaire d’utiliser plus de 4 tubes à gradient discontinu pour éliminer suffisamment la myéline et les débris.
Remarque : Le processus est terminé lorsqu’il ne reste pas, ou peu, de tissu non dissocié clairement visible. Évitez l’introduction de bulles pendant le processus de trituration.
Remarque : La viabilité cellulaire après dissociation est généralement de >90%. Des capacités plus faibles peuvent refléter de nombreuses variables, y compris la manipulation sous-optimale des tissus ou le temps de transport de la salle d’opération, la méthode de cryoconservation ou la technique de dissociation des papaïnes. Des capacités cellulaires plus faibles peuvent encore être adéquates, cependant, tant qu’un nombre suffisant de viables peut être transplanté dans le volume approprié. Pour chaque souris, 50 000 à 200 000 cellules viables sont implantées en volume de 2 μl. En raison de l’extrémité biseautée de l’aiguille de la seringue, une suspension cellulaire supplémentaire de 5 μl doit être incluse dans le volume final pour s’assurer qu’un matériau adéquat peut être aspiré dans la seringue pour chaque injection. Par exemple, pour injecter 2 μl/souris pour 5 souris, le volume final doit être de 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl).
<ol><li>Placer le matériel du patient fraîchement réséqué et dépersonnalisé dans un contenant stérile et recouvert sur de la glace pour le transport au laboratoire. Traiter l’échantillon directement pour la transplantation ou cryoconserver l’échantillon dans de l’azote liquide (voir ci-dessous) pour le stockage dans l’azote liquide et l’utilisation ultérieure.</li>
	<li>Préparer les solutions de dissociation de la papaïne (solution de papaïne, solution d’inhibiteur de lavage/protéase et solution de gradient discontinu) dans une hotte stérile avec les composants du kit et les instructions fournies par le fabricant. Étiqueter les tubes coniques stériles en polystyrène de 15 ml et répartir les solutions comme suit:<ul>
<li>Tube 1: 5 ml de solution de papaïne</li>
			<li>Tube 2 : 3 ml de solution d’inhibiteur de lavage/protéase</li>
			<li>Tubes 3-6: 5 ml chacun de solution de gradient discontinu</li>
		</ul>
</li>
	<li>Placer l’échantillon de gliome dans le tube 1 avec 5 ml de solution de papaïne et triturer avec une pipette de 5 ml sur une période de temps de 10 à 20 minutes.</li>
	<li>Pipetter le matériau de haut en bas 10 fois, puis incuber le matériau pendant 2-3 min à température ambiante avant de commencer le prochain cycle de trituration.</li>
	<li>Placer la pointe de la pipette de 5 ml plus près du fond du tube conique à chaque cycle de trituration de telle sorte que la pointe touche le fond du tube pendant les 2 derniers cycles.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirez le surnageant et pipettez le culot de haut en bas 10x dans 3 ml de la solution inhibitrice de lavage/protéase.</li>
	<li>Superposez soigneusement un volume égal de la suspension sur chacune des solutions de gradient discontinues de 5 ml (tubes 3-6), avec un pipettor réglé à la vitesse de distribution « gravitaire ».</li>
	<li>Placez les tubes dans une centrifugeuse équipée d’un rotor à godets oscillants, la vitesse d’accélération étant réduite au réglage le plus bas et le frein éteint. Centrifuger à 76 x g pendant 12 min à température ambiante. Lorsque le frein est éteint, la centrifugation est généralement terminée après 20 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant, ressuscitez et combinez chaque pastille dans 5 ml de solution saline équilibrée stérile et placez les cellules sur de la glace.</li>
	<li>Retirer une partie (10-100 μl) de la suspension cellulaire et déterminer la densité des cellules viables par exclusion bleue trypan avec un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et ressuscitez la pastille cellulaire à une densité de 25 000 à 125 000 cellules viables par μl.</li>
	<li>Transférer un volume adéquat de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 200 μl (tube PCR) et placer sur de la glace.</li>
</ol>2. Préparation du site chirurgical et des instruments
Remarque : Des gants chirurgicaux stériles sont portés pendant la procédure. Selon les exigences de chaque établissement, des blouses chirurgicales, des casquettes et des protecteurs faciens peuvent être requis.
<ol><li>Préparez une paillasse désinfectée pour la chirurgie des rongeurs avec des zones adjacentes séparées pour la préparation des animaux, le champ d’opération et la récupération des animaux.</li>
	<li>Stériliser les instruments chirurgicaux dans un autoclave à vapeur. Par la suite, utilisez un stérilisateur de perles chaudes pour stériliser les instruments lors de la transition d’un animal à l’autre.</li>
</ol>3. Induction, anesthésie et analgésie
Remarque : Les chirurgies dépassant 15 min à partir du moment où les souris sont anesthésiées nécessitent une source de chaleur de contact. Pour prévenir l’hypothermie, les souris reçoivent une source de chaleur (couverture d’eau chaude circulante) pendant les périodes pré- et post-opératoires. 
<ol><li>Préparer le cocktail kétamine/xylazine pour l’anesthésie par induction de sorte que chaque souris reçoive 100 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine en injectant 10 μl du cocktail par gramme de poids corporel.</li>
	<li>
Tableau 1. Cocktail d’anesthésie.
		<table><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
					<td rowspan="2">Concentration des stocks</td>
					<td colspan="3">Volume à préparer </td>
				</tr>
<tr>
<td>une souris</td>
					<td>cinq souris</td>
					<td>dix souris</td>
				</tr>
<tr>
<td>kétamine</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>25 μl</td>
					<td>125 μl</td>
					<td>250 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>Xylazine</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>2,5 μl</td>
					<td>12,5 μl</td>
					<td>25 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>Solution saline isotonique</td>
					<td></td>
					<td>223 μl</td>
					<td>1 113 μl</td>
					<td>2 225 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td colspan="2">total</td>
					<td>250 ul</td>
					<td>1 250 μl</td>
					<td>2 500 μl</td>
				</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Préparer la solution de kétoprofène pour l’analgésie en diluant la solution mère (10 mg/ml) 1:20 dans de l’eau stérile et sans pyogène de sorte que chaque souris reçoive une dose de 5 mg/kg en injectant 10 μl de la solution par gramme de poids corporel.</li>
	<li>Peser et enregistrer le poids préchirurgical. Le poids individuel de la souris varie, mais varie généralement de 18 à 22 g.</li>
	<li>Injecter 10 μl du cocktail kétamine/xylazine par gramme de poids corporel de la souris dans l’espace intrapéritonéal à l’utilisation d’une seringue à insuline. Par exemple, injectez 200 μl pour une souris de 20 g.</li>
	<li>Déterminez si la souris est complètement anesthésiée par pincement de la patte postérieure. Il faut généralement 3 à 5 minutes pour que la souris ne se retire plus du pincement.</li>
	<li>Injecter 10 μl de la solution de kétoprofène par gramme de poids corporel de souris par voie sous-cutanée dans la peau lâche du flanc à l’utilisation d’une seringue à insuline. Par exemple, injectez 200 μl pour une souris de 20 g.</li>
	<li>Rasez les cheveux sur le crâne avec des tondeuses, frottez le cuir chevelu exposé avec de la povidone-iode à l’aide d’un applicateur de pointe de coton, puis essuyez un tampon d’alcool. Répétez ces étapes, gommage povidone-iode et lingette à l’alcool, deux fois de plus.</li>
	<li>Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris.</li>
	<li>Faites une incision médiane de 1 cm s’étendant de derrière les oreilles jusqu’à juste devant les yeux avec une lame de scalpel stérile.</li>
	<li>Placez la souris sous une portée de dissection et exposez le crâne pour identifier les lignes de suture. À l’aide de mouvements circulaires avec une perceuse, centrez un trou de bavure de 2,5 mm latéralement au bregma et de 1 mm postérieur à la suture coronale.</li>
</ol>4. Transplantation intracrânienne
Remarque : Des volumes d’injection supérieurs à 2,5 μl peuvent être mortels pour les souris.
<ol><li>Placez la souris sur un cadre stéréotaxique en accrochant les incisives supérieures sur la barre d’incisives et en appliquant la pince nasale de sorte que le crâne soit fermement maintenu en position neutre.</li>
	<li>Aspirer 5 à 10 μl des cellules d’un tube à microcentrifugation plusieurs fois dans une seringue Hamilton de 10 μl serrée dans le porte-sonde du manipulateur stéréotaxique pour mélanger la suspension et éliminer les bulles. Pressez le piston de sorte que la seringue soit chargée de 2 μl (le volume adéquat pour injecter un animal).</li>
	<li>Tirez le bord latéral de l’incision de la peau pour exposer le trou de bavure et, avec le micromanipulateur, introduisez l’aiguille dans le trou de bavure de sorte que la partie biseautée soit juste en dessous de la surface du crâne.<ol>
<li>Avancez l’aiguille de 3 mm, puis retirez l’aiguille de 0,5 mm pour créer un espace d’injection.</li>
			<li>Avancez lentement le piston sur 30 secondes, puis laissez l’aiguille rester dans le cerveau pendant 2 minutes supplémentaires. Retirer l’aiguille progressivement en montant 0,5 mm et en attendant 30 secondes supplémentaires avant de retirer l’aiguille du cerveau.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Retirez la souris du cadre stéréotaxique et fermez la plaie à l’arme d’un autoclip.</li>
	<li>Placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle et surveillez en permanence le motif respiratoire et la couleur des muqueuses et des tissus exposés (plante des pieds).</li>
	<li>Placez la souris dans une cage de microisolateur stérile une fois qu’elle se remet complètement de l’anesthésie (sternale et ambulatoire) et retournez-la à l’installation d’hébergement pour animaux.</li>
</ol>5. Soins et observation des animaux post-implantation
Remarque : L’indication la plus fiable de la greffe de tumeur et de la croissance infiltrative est une perte de poids progressive et soutenue accompagnée du développement d’une posture voûtée et d’un pelage rugueux. Aux occasions rares, des déficits neurologiques sont notés qui incluent l’ataxie, la parésie, et les saisies. Les xénogreffes primaires orthotopiques sont fortement invasives et se développent sur une longue période de temps. Les souris manifestent généralement des symptômes de croissance tumorale 3 à 6 mois après la transplantation.
<ol><li>Observez quotidiennement des souris avec des xénogreffes orthotopiques pour la prise de nourriture et d’eau, le comportement, le toilettage et les signes d’infection au site d’incision.</li>
	<li>Administrer du kétoprofène (5 mg/kg par voie sous-cutanée, 1 à 2x par jour) si de la douleur ou de la détresse est observée postopératoirement.</li>
	<li>Retirer les autoclips 8-10 jours après la chirurgie.</li>
	<li>Peser les souris chaque semaine.</li>
	<li>Surveiller les signes et les symptômes de la greffe de tumeur.</li>
</ol>6. Récolte tumorale
Remarque : Par cette méthode, la première tranche coronale (#1) contient l’aspect postérieur des bulbes olfactifs et l’aspect antérieur des lobes frontaux. La tumeur greffée est la plus abondante dans le bon hémisphère des 3 tranches coronales suivantes (tranche #2, #3, et #4) et la vue d’injection est par habitude contenue dans la tranche coronale #3. Selon les besoins expérimentaux, le matériel peut être utilisé pour le passage de tumeur, les sections congelées de tissu, les sections de tissu incorporées de paraffine fixe de fortérine, la cytométrie de flux de tissu dissocié, la culture cellulaire ou les lysats pour l’ADN, l’ARN, ou l’analyse de protéine. Des parties de la tumeur peuvent cryopreserved pour de futurs besoins avec la viabilité de cellules s’étendant de de 80-95%.
<ol><li>Euthanasier des souris par une exposition prolongée au dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale.</li>
	<li>Décapitez les souris euthanasiées à la base du cerveau (niveau de foramen magnum) avec une plus grande paire de ciseaux chirurgicaux, et tirez la peau de l’incision vers l’avant pour exposer complètement le crâne.</li>
	<li>Retirez le cerveau.<ol>
<li>Insérez une pointe de paire de ciseaux chirurgicaux fins dans l’aspect latéral du magnum de foramen au niveau du méat auditif externe gauche pour couper l’os occipital le long du côté gauche du crâne. Effectuez la même coupe sur le côté droit.</li>
			<li>Couper l’os occipital le long d’un plan coronal d’un méat auditif externe à l’autre et enlever l’os pour exposer le cervelet.</li>
			<li>Couper les plaques osseuses nasales entre les yeux.</li>
			<li>Couper la suture sagittale en coupant postérieurement le long de la suture sagittale des plaques osseuses nasales au bregma. Accomplissez l’incision de midline le long de la suture sagittale en coupant antérieur du lambda au bregma.</li>
			<li>Insérez soigneusement la pointe d’une fine paire de pinces le long de l’ouverture sagittale de chaque côté pour déchirer toute adhérence dural du crâne au cerveau, puis épluchez les deux moitiés du crâne latéralement pour exposer le cerveau et les bulbes olfactifs dorsalement.</li>
			<li>Faites glisser la pince entre l’aspect ventral des bulbes olfactifs et le crâne pour libérer toute adhérence.</li>
			<li>Inclinez le crâne vers l’arrière pour permettre au cerveau d’être rétracté afin que l’optique et les autres nerfs crâniens soient exposés. Sectionz les nerfs crâniens pour libérer le cerveau dans un plat contenant du PBS stérile.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Transférer le cerveau avec une spatule de pesée dans une trancheuse matricielle et générer des tranches coronales de 2 mm avec des lames de rasoir.</li>
	<li>Disposer les tranches coronales dans un plat contenant du PBS stérile pour une inspection visuelle plus approfondie et un traitement plus poussé des tissus.</li>
</ol>7. Cryoconservation tumorale
<ol><li>Préparer une solution mère de milieu de cryoconservation.<ol>
<li>Ajouter 50 ml de supplément de prolifération, 5 ml de solution de pénicilline et de streptomycine 100x et 450 μl d’héparine à 0,2 % à 450 ml de milieu basal.</li>
			<li>Conserver la solution mère à 4 °C à l’abri de la lumière.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Préparer une solution de travail du milieu de cryoconservation.<ol>
<li>Mélanger 47,5 ml de milieu de cryoconservation et 2,5 ml de DMSO stérile dans un tube conique en polypropylène de 50 ml et bien mélanger.</li>
			<li>Aliquote 1,0 ml de solution de travail à chaque cryovial et conserver à 4 °C à l’abri de la lumière.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Placez une tranche coronale de 2 mm de cerveau xénogreffe dans un milieu de cryoconservation cryovial sur de la glace.</li>
	<li>Bien casser le flacon et le placer dans un récipient de congélation à -80 °C. Transférer le cryovial le lendemain dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage plus long.</li>
</ol>

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<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les lignées cellulaires cultivées, les xénogreffes et les souris génétiquement modifiées sont les méthodes les plus courantes de modélisation des gliomes, et il existe des avantages et des limites distincts pour chaque système modèle3,13,14. Les avantages pertinents des xénogreffes orthotopiques primaires de glioma incluent la croissance infiltrative qui caractérise des gliomas diffus et la conservation des changements génétiques et des mécanismes de signalisation importants qui peuvent être excessivement diff...

Les gliomes malins sont des tumeurs gliales primaires du système nerveux central qui se produisent dans le cerveau et parfois dans la moelle épinière. Les gliomes sont classés par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) en fonction de leur ressemblance histologique avec les astrocytes, les oligodendrocytes ou les cellules épendymaires, puis classés numériquement (I à IV) pour les caractéristiques pathologiques de la malignité. Les sous-types histologiques les plus communs sont les astrocytomas, les oligodendrogliomas et les oligoastrocytomas mélangés. Les gliomes malins englobant les grades II à IV de l’OMS sont caractérisés par une croissance et une récalcitrance invasives aux thérapies actuelles. Chaque année aux États-Unis, environ 15 750 personnes reçoivent un diagnostic de gliome malin et environ 12 740 patients succombent à cette maladie. Ces statistiques mettent en évidence la nature particulièrement mortelle des gliomas malins et le besoin important d’efficacité thérapeutique augmentée.
Les modèles de cancer sont essentiels pour étudier la biologie et les thérapies de tumeur. Les lignées cellulaires cancéreuses humaines représentent une première étape importante pour les manipulations in vitro et les études de xénorografting in vivo (xénogreffes secondaires)1. Cependant, les cultures de cellules cancéreuses standard subissent une transformation phénotypique et génotypique2-4 qui peut ne pas être restaurée dans les xénogreffes secondaires5. En outre, les altérations génétiques telles que les mutations de l’isocitrate déshydrogénase(IDH)6,les populations distinctes de cellules souches7 et la dépendance aux voies de signalisation clés8 peuvent être perdues dans les cultures de cellules cancéreuses. Les profils génomiques peuvent être maintenus dans une meilleure mesure dans la culture de la sphère cancéreuse, bien qu’ils ne reflètent toujours pas pleinement le génotype des tumeurs primaires2,3. La transplantation orthotopique directe annule les influences de la culture in vitro, fournit un microenvironnement approprié et préserve l’intégrité des cellules tumorales9,10. Par conséquent, les xénogreffes primaires représentent un modèle préclinique puissant et pertinent pour tester rigoureusement des agents ciblés afin d’aider à la conception rationnelle des futurs essais cliniques5,11,12.

<table><tbody><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Système de dissociation de la papaïne</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>Solution de bleu de trypan 0,4 %</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine HCl</td><td>Obtenue auprès d’une pharmacie institutionnelle ou d’une entreprise</td><td></td><td></td>locale de fournitures vétérinaires</tr><tr><td>Xylazine HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kétoprofène</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pommade ophtalmique </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidone iode </td><td>Fisher Scientific</td><td>190061617</td><td> </td></tr><tr><td> Milieu de cryoconservation et supplément de prolifération </td><td>StemCell Technologies</td><td>05751</td><td> </td></tr><tr><td> 0,2 % Sel d’héparine sodique dans PBS </td><td>StemCell Technologies</td><td>07980</td><td> </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td> </td></tr><tr><td> diméthylsulfoxyde </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6250-5X10ML</td><td> </td></tr><tr><td> NOD. Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice </td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td> NSG mice</tr><tr><td> > Anticorps anti-vimentine humaine </td><td>Dako</td><td>M7020</td><td> Use 1:200 à 1:800 </td></tr><tr><td> < >Anticorps anti-humain IDH1 R132H </td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td> Use 1:100 à 1:400 </td></tr><tr><td> Centrifugeuse avec rotor à godets oscillants </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Pipette avec contrôle de la vitesse de distribution </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Hémocytomètre jetable </td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td> </td></tr><tr><td> Gants chirurgicaux stériles </td><td>Fisher Scientific</td><td>11-388128</td><td> </tr><tr><td> > Blouse jetable </td><td>Fisher Scientific</td><td>18-567</td><td> </td></tr><tr><td> Chirurgical masque </td><td>Fisher Scientific</td><td>19-120-1256</td><td> </td></tr><tr><td> Seringue tuberculine </td><td>BD</td><<td>p>305620</td><td> </td></tr><tr><td> Tampons d’alcool </td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246-073</td><td> </td></tr><tr><td> Balance électronique portable </td> Fisher <td> Scientific</td><td>01-919-33</td><td> </td></tr><tr><td> Microscope Zoom </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Tondeuse chirurgicale </td><td>Stoelting</td><td>51465</td><td> </tr><tr><td> > Manche de scalpel </td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td> </td></tr><tr><td> Lames de scalpel, #10 </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Instrument stéréotaxique </td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td> </td></tr><tr><td> Perceuse à grande vitesse </td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td> </td></tr><tr><td>Mèche, 0,6 mm</td><td>Stoelting</td><td>514552</td><td></td></tr><tr><td> Hamilton seringue </td><td>Hamilton</td><td>80336</td><td> </td></tr><tr><td> Autoclip, 9 mm </td><td>BD</td><<td>p>427630</p</td><td>> </td></tr><tr><td> Coussin chauffant à circulation d’eau </td><td>Kent Scientific</td><td>TP-700 TP-1215EA </td><td> </td></tr><tr><td> Stérilisateur à sec à billes chaudes </td><td>Kent Scientific</td><td>INS300850</td><td> </td></tr><tr><td> Ciseaux chirurgicaux </td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td> </tr><tr><td> > Ciseaux fins </td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td> </td></tr><tr><td> Ciseaux à ressort </td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td> </td></tr><tr><td> Pince Dumont </td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td> </td></tr><tr><td> Spatules semimicro </td><td>Fisher Scientific</td><td>14374</td><td> </td></tr><tr><td> Mouse brain slicer matrix </td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS002-1</td><td> </td></tr><tr><td> Flacons de stockage cryogéniques </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-501</td><td> </td></tr></tbody></table>

les xénogreffes orthotopiques primaires de gliome récapitulent la croissance infiltrante et la mutation de l’isocitrate déshydrogénase i

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Les gliomas malins constituent un groupe hétérogène de néoplasmes glial fortement infiltrative avec les configurations cliniques et moléculaires distinctes. Les xénogreffes orthotopic primaires récapitulent les dispositifs histopathologiques et moléculaires des sous-types malins de glioma dans les modèles animaux précliniques. Pour modéliser les gliomes malins de grade III et IV de l’OMS dans les essais de transplantation, les cellules tumorales humaines sont xénogreffes dans un site orthotopique, le cerveau, de souris immunodéprimées. Contrairement aux xénogreffes secondaires qui utilisent les cellules cultivées de tumeur, des cellules humaines de glioma sont dissociées des spécimens réséqués et transplantées sans passage antérieur dans la culture de tissu pour générer les xénogreffes primaires. Le procédé dans ce rapport détaille la préparation d’échantillon de tumeur, la transplantation intra-crânienne chez les souris immunocompromised, la surveillance pour l’engraftment de tumeur et la récolte de tumeur pour le passage suivant dans les animaux réceptifs ou l’analyse. La préparation de cellules tumorales nécessite 2 heures et la procédure chirurgicale nécessite 20 min/animal.

Les cellules de gliome dissociées sont transplantées directement dans le cerveau de souris immunodéprimées pour obtenir des lignées de xénogreffe orthotopiques primaires. Chaque échantillon tumoral se voit attribuer un numéro randomisé avant la transplantation, dans le cadre du processus de désidentification visant à supprimer les informations de santé protégées. Nous utilisons un numéro de base de données REDcap à 5 chiffres à cette fin. La figure 1 illustre le processus et la nomenclature pour établir ...

Les gliomas malins constituent un groupe hétérogène de néoplasmes glial fortement infiltrative avec les configurations cliniques et moléculaires distinctes. Les xénogreffes orthotopic primaires récapitulent les dispositifs histopathologiques et moléculaires des sous-types malins de glioma dans les modèles animaux précliniques.

Les xénogreffes orthotopiques primaires de gliome récapitulent la croissance infiltrante et la mutation de l’isocitrate déshydrogénase I

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

L’objectif global de cette procédure est de générer un gliome orthotopique primaire, des xénogreffes pour récapituler, des caractéristiques histopathologiques et moléculaires de sous-types de gliome malin dans des modèles animaux précliniques. Ceci est accompli en obtenant d’abord des échantillons de tumeurs cérébrales humaines pour une transplantation directe. La deuxième étape consiste à préparer une suspension cellulaire à partir de l’échantillon.Ensuite, les cellules tumorales sont transplantées dans le cerveau d’une souris immunodéprimée. La souris receveuse est ensuite surveillée pour détecter des signes de tumeur, de greffe et de croissance, puis récoltée pour une analyse ou une transplantation en série. En fin de compte, l’histologie, le séquençage de l’ADN et d’autres tests moléculaires sont utilisés pour montrer la croissance tumorale infiltrante et la rétention des altérations génétiques, telles que les mutations de la citrate déshydrogénase ISO.Les modèles animaux précliniques du cancer sont essentiels pour l’étude de la biologie et des thérapies tumorales. Le principal avantage des xénogreffes de gliome primaire par rapport aux méthodes existantes telles que les xénogr

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Luciférase modifiée xénogreffes de tumeurs humaines du cerveau peut être établie par voie intracrânienne chez des souris athymiques, avec un suivi ultérieur de la croissance tumorale et la réponse au traitement en utilisant l'imagerie par bioluminescence. En combinaison avec une analyse de survie, de surveillance bioluminescence est un outil de recherche indispensable pour les essais pré-cliniques de thérapies envisagées pour le traitement des tumeurs cérébrales.

Établir intracrânienne xénogreffes tumorales du cerveau avec analyse ultérieure de la croissance tumorale et la réponse à la thérapie à l&#39;aide d&#39;imagerie par bioluminescence

Nous décrivons une méthode intégrée pour la précision, l'implantation stéréotaxique de cellules humaines de glioblastome multiforme dans le cerveau des souris nude et de série...

Implantation stéréotaxique intracrânienne et<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie bioluminescente de xénogreffes tumorales dans un système de modèle de souris de glioblastome multiforme

Nous avons établi un modèle de glioblastome orthotopique corticale chez la souris pour intravitale microscopie à deux photons qui récapitule les contraintes biophysiques normalement en jeu au cours de la croissance de la tumeur. Une fenêtre en verre chronique remplaçant le crâne au-dessus de la tumeur permet le suivi de la progression de la tumeur au cours du temps par microscopie à deux photons.

Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique

Les astrocytes phénotypiquement sauvages et les cellules souches neurales récoltées sur des souris modifiées avec des allèles oncogéniques conditionnels floxés et transformés par recombinaison virale médiée par Cre peuvent être utilisés pour modéliser la pathogenèse de l’astrocytome in vitro et in vivo par injection orthotopique de cellules transformées dans le cerveau de compagnons de portée syngéniques et immunocompétents.

Modélisation astrocytome pathogenèse In Vitro Et In Vivo Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

Le cerveau est un site unique avec des qualités qui ne sont pas bien représentés par des analyses in vitro ou extra-utérines. Des modèles de souris orthotopique avec l'emplacement et les caractéristiques de croissance et reproductibles peuvent être créés de manière fiable avec des injections intracrâniennes en utilisant un instrument stéréotaxique de fixation et d'une pompe à seringue à basse pression.

Création anatomique précise et reproductible intracrânienne xénogreffes de tumeurs cérébrales humaines

Les cellules de gliome GL261 fournissent un modèle animal immunocompétent utile du glioblastome. Les objectifs de ce protocole sont de démontrer des techniques appropriées pour surveiller la croissance tumorale intracrânienne à l’aide de l’imagerie de bioluminescence in vivo, et de vérifier l’utilité des cellules GL261 modifiées par la luciférase pour l’étude de l’immunologie tumorale et des approches immunothérapeutiques pour le traitement du glioblastome.

Bioluminescence imagerie d&#39;un modèle animal pour immunocompétentes glioblastome

Neurospheres cultivés comme 3D cultures constituent un outil puissant pour étudier la biologie de gliome. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’immunohistochimie en conservant la structure 3D de gliome neurospheres par enrobage de paraffine. Cette méthode permet la caractérisation des propriétés neurosphère gliome tels que stemness et différenciation neurale.

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

Ici, nous décrivons un modèle murin orthotopique préclinique pour le GBM, établi par injection intracrânienne de cellules dérivées de tumeurs modèles de souris génétiquement modifiées. Ce modèle présente les caractéristiques de la maladie du GBM humain. Pour les études translationnelles, la tumeur cérébrale de souris est suivie par IRM in vivo et histopathologie.

Modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme

Les gliomes diffus de bas grade avec mutation IDH1 sont des tumeurs rares difficiles à cultiver. Nous introduisons une méthode d’explant simple et non enzymatique qui préserve l’expression de la protéine mutante IDH1 et maintient les cultures pendant des mois. Il est important de noter que cette technique fonctionne avec des tumeurs cryoconservées, offrant une ressource précieuse pour la recherche sur les gliomes.

Un protocole pour les cultures d’explants de gliomes diffus de bas grade avec mutation IDH1

Le développement de modèles orthotopiques de tumeurs cérébrales pédiatriques nécessite une précision méticuleuse, en utilisant un dispositif stéréotaxique pour implanter les cellules cancéreuses avec précision. La méthodologie présentée ici décrit les étapes de la préparation des cellules tumorales cérébrales, de la réalisation d’injections intracrâniennes et de la mise en œuvre d’un système de surveillance postopératoire pour évaluer la greffe de tumeur cérébrale.

Etablissement de modèles de xénogreffes orthotopiques dérivées de patients pour des tumeurs cérébrales à l’aide d’un dispositif stéréotaxique

L’objectif de ce protocole est de fournir aux chercheurs une technique hautement reproductible pour les implantations intracrâniennes.

Implantation intracrânienne stéréotactique de lignées cellulaires de xénogreffes dérivées d’un patient chez des souris

Découvrez comment générer des xénogreffes orthotopiques primaires de gliome pour modéliser la croissance infiltrante et les mutations IDH dans des modèles animaux précliniques. Cette méthode permet d'étudier la biologie tumorale et les réponses thérapeutiques.

Les xénogreffes orthotopiques primaires de gliome récapitulent la croissance infiltrante et la mutation de l’isocitrate déshydrogénase I (Vidéo) | JoVE Journal

Les xénogreffes orthotopiques primaires de gliome récapitulent la croissance infiltrante et la mutation de l’isocitrate déshydrogénase I

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