Induction du envahissantes Transitional cancer de la vessie cellulaire dans immunitaire humain MUC1 souris transgéniques intactes: un modèle pour le développement d'immunothérapie

L’objectif global de l’expérience suivante est d’induire efficacement une réponse cytotoxique des lymphocytes T ciblant un antigène associé à la tumeur dans le cancer de la vessie. Ceci est réalisé en induisant le cancer de la vessie chez les souris qui expriment l’antigène mach un associé à la tumeur humaine. Ensuite, un vaccin peptidique est injecté dans les souris et une réponse spécifique des lymphocytes T cytotoxiques est générée.

Ensuite, la tumeur sérique et la rate sont isolées et les tissus sont analysés pour les cytokines, les antigènes et la réponse immunitaire respectivement. L’utilisation d’un multiplexage par transfert Western, de microbilles fluorométriques, d’une immunohistochimie par immunodosage et d’une analyse en direct nous permet de tester l’efficacité d’un vaccin peptidique contre le cancer de la vessie. Bonjour, je suis le Dr Gregory Wetz, chercheur scientifique au Davis Health System de l’Université de Californie à Sacramento, en Californie.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme les xénogreffes, est que les xénogreffes nécessitent des hôtes immunodéprimés, alors que notre modèle utilise une souris transgénique immunitaire intacte qui exprime un antigène associé à une tumeur humaine qui est la cible du vaccin peptidique. Daniel V, les docteurs Chaga et Audrey Gutierrez, qui sont tous des collègues chercheurs, ainsi que le laboratoire du Dr Michael de Gregorio et le système de santé de l’UC Davis feront la démonstration des techniques avec moi. Avant d’administrer la première dose de N butyle, de N quatre hydroxy, de butyl NITROSAMINE ou de O-H-B-B-N pour induire le cancer de la vessie, effectuez un saignement sous-mandibulaire sur chaque souris pour recueillir le sang total et les tubes de coagulation sanguine et laissez 30 minutes pour que le sang coagule.

À partir de huit semaines, à l’aide d’aiguilles à gavage en acier inoxydable de calibre 20, administrez l’O-H-V-B-N par voie orale cinq jours par semaine pendant 12 semaines. À la semaine 20, utilisez 600 microlitres de solution saline stérile à 0,9 % pour reconstituer chaque flacon de vaccin peptidique lyophilisé et remettez complètement la solution en suspension en aspirant la solution à travers une aiguille de calibre 27 de 0,5 pouce six fois à l’aide d’une solution saline. Ajustez la concentration de manière à ce que la dose souhaitée soit administrée dans un volume de 100 microlitres après la dernière dose d’O-H-B-B-N et administrez le vaccin sur une base hebdomadaire pendant un cycle de huit semaines en utilisant une aiguille de calibre 25 pour injecter 100 microlitres du vaccin huit semaines après la dernière dose d’O-H-B-B-N.

Après avoir euthanasié toutes les souris par asphyxie au dioxyde de carbone, placez chaque souris sur une planche de dissection et fixez les quatre membres. Ensuite, à l’aide de pinces et de ciseaux, faites une incision horizontale dans la région abdominale supérieure. Insérez les ciseaux dans l’incision entre la couche épidermique et la paroi abdominale et, à l’aide d’une pince, séparez doucement la peau du tissu sous-jacent.

Faites une incision verticale à partir de l’incision horizontale en suivant l’axe médian vers l’extrémité antérieure de la souris. Ensuite, séparez la peau de la cage thoracique et, à l’aide d’une seringue d’un millilitre et d’une aiguille de calibre 22, percez le cœur et prélevez du sang avec un prélèvement doux et régulier à l’aide de pinces et de ciseaux. Coupez et décollez le reste de la couche épidermique à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique.

Couper à travers la paroi abdominale et le péritoine et de manière aseptique. Retirez la tumeur de la vessie pour l’immunohistochimie ou IHC et le Western blot pour l’IHC. Placez l’échantillon de tumeur de la vessie dans une cassette de tissu et fixez-le dans de la formine réfrigérée pendant la nuit.

À température ambiante, prélever la rate pour l’analyse de la viabilité cellulaire et un point de lie pour effectuer le dosage immunométrique microbien fluorométrique multiplex. Utilisez 200 microlitres de tampon de dosage pour pré-mouiller. Une plaque inférieure de filtre à 96 puits, permettant au filtre de tremper complètement.

Ensuite, utilisez un appareil à vide à plaque à 96 puits pour vider doucement le filtre et utilisez des serviettes en papier pour sécher le fond de la plaque à l’aide d’une pipette multicanaux, pipette 25 microlitres de matrice sérique dans les puits assignés pour les blancs et les étalons, et pipette 25 microlitres de tampon de dosage dans les puits attribués aux contrôles et inconnus. Ensuite, pipetez 25 microlitres des étalons vierges, des contrôles et des inconnues vers les puits respectifs attribués. Agitez le mélange de perles pendant 20 secondes et transférez les billes dans un réservoir.

Ensuite, pipetez 25 microlitres du mélange de perles dans chacun. Couvrez bien la plaque pour la protéger de la lumière et secouez la plaque sur un shaker à 500 tr/min pendant deux heures à température ambiante, égouttez la plaque et utilisez 200 microlitres de PBST pour la laver deux fois avant de l’égoutter et de la sécher. Pour préparer la solution d’anticorps de détection, combinez la quantité requise de 0,1 % de PBST et d’anticorps de détection dans un tube de 15 millilitres et agitez pendant 10 secondes.

Ensuite, pipetez 25 microlitres dans chacun. Bien agiter la plaque à 500 tr/min pendant une heure à température ambiante. Ensuite, égouttez et lavez la plaque avec 200 microlitres de 0,1 % PBST Égouttez et épongez deux fois la pipette sèche de 25 microlitres de streptocoque, AVID et FICO eryn ou SAPE fraîchement préparés, placez bien la plaque sur l’agitateur de plaque et incubez pendant 30 minutes à température ambiante à 500 tr/min.

Égouttez et lavez deux fois avec du PBST. Pour suspendre les billes, ajoutez 100 microlitres de PBST à 0,1 % dans chaque puits et agitez à 500 tr/min pendant au moins deux minutes. Utilisez l’appareil Luminex LX 200 pour lire et analyser la plaque dans une enceinte de sécurité biologique.

Transformez les rates de souris à travers des tamis en tissu de nylon de 100 micromètres en cinq millilitres de PBS stérile dans des boîtes de Pétri stériles. Superposez les PLE aytes sur trois millilitres de milieu de séparation des lymphocytes dans des tubes stériles de 15 millilitres. Centrifugez les tubes à 600 GS pendant 15 minutes.

Pour séparer les lymphocytes des globules rouges, transférez les lymphocytes superposés au-dessus du gradient dans de nouveaux tubes stériles de 15 millilitres dans des tubes à centrifuger à bouchon à vis de 1,5 millilitre. Utilisez le réactif de viabilité de la numération pour effectuer une dilution en série des lymphocytes. Puis analysez sur la muse.

Préparez une carte des échantillons et des conditions pour la plaque spot alliée en préparant la plaque selon le protocole du fabricant et en pipetant 100 microlitres de peptide moyen ou en poussant un peptide brouillé dans chacune. Eh bien, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Suivez le protocole du fabricant pour le test de point ALI et utilisez le microscope de dissection pour analyser la plaque de point Aly développée.

Quantifiez les résultats en comptant le nombre de taches colorées correspondant à chaque analyte dans chaque puits. Les taches correspondent au nombre de cellules formant des taches dans chaque puits dans notre modèle de souris transgénique induction avec le cancérogène chimique. L’O-H-B-B-N a entraîné un taux élevé d’incidents de cancer de la vessie caractérisé principalement par un carcinome à cellules transitionnelles ou TCC avec un carcinome épidermoïde ou un CSC, ce qui est similaire au cancer de la vessie chez l’homme, comme le montre cette figure.

Huit semaines après l’induction de l’O-H-B-B-N, le taux d’incidence du cancer de la vessie chez les souris transgéniques ou TG mach one et les souris de type sauvage était de 67 % La coloration à l’hématine et à l’éosine a confirmé la présence de TCC et de CSC, les TCC prédominant dans un rapport de deux pour un. Parmi celles-ci, nous avons observé une gamme de tumeurs non invasives de bas et de haut grade à invasives de haut grade. Tous les échantillons de cancer de la vessie de Mach un étaient positifs pour l’expression de Mach un par IHC.

Au cours du développement du modèle, les taux sériques de cytokines inflammatoires ont été surveillés en série entre la huitième et la 28e semaine. Nous avons observé que les niveaux de cytokines inflammatoires augmentaient au fil du temps depuis l’induction jusqu’à la fin de l’étude. Ce modèle de cytokines est très similaire à ce que nous avons observé précédemment dans notre modèle de cancer du poumon, ce qui suggère fortement que l’augmentation des niveaux de cytokines inflammatoires peut être corrélée au développement tumoral.

Afin d’évaluer la réponse des cytokines sériques au vaccin peptidique, 15 souris vaccinées et 14 souris Mach 1 TG traitées par placebo ont été euthanasiées et du sang a été prélevé à la fin de l’étude, 24 heures après le dernier traitement vaccinal. L’analyse multiplex montre une augmentation des taux sériques de cytokines du TNF, de l’alpha, de l’interféron gamma, de l’IL, de l’IL, de l’IL, de l’IL, de l’IL, de l’IL12 et de l’IL17 dans le groupe vacciné.

Par rapport au groupe placebo, les taux de TNF, d’alpha, d’interféron gamma et d’IL-17 étaient significativement plus élevés chez les souris traitées par le vaccin. Ces résultats suggèrent une réponse cytokinique polarisée au vaccin peptidique afin d’évaluer la réponse immunitaire TH un, TH deux au vaccin peptidique. Les cytes SP ont été évalués par interféron gamma IL quatre points ALI illustrés ici est une évaluation de la viabilité des lymphocytes isolés après l’ensemencement de plaques de points ALI avec des lymphocytes viables, les résultats de cette expérience étaient clairs et la réponse spécifique de l’interféron gamma au peptide, ce qui confirme la réponse immunitaire TH un au vaccin peptidique Après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie du cancer pour explorer de nouvelles immunothérapies en utilisant un modèle préclinique de cancer de la vessie avancé.