Name: Génération rapide d’amyloïde à partir de protéines natives in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Apprenez à générer rapidement des fibrilles amyloïdes à partir de protéines natives in vitro en utilisant la température et le réticulage chimique. Cette méthode permet d'étudier le mécanisme de formation de l'amyloïde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail est soutenu par des subventions accordées à W.C. par les National Institutes of Health Grant AI074809 et le programme de subventions de recherche institutionnelle M. D. Anderson Cancer Center de l’Université du Texas.

1. Préparer le tampon MES
<ol>
	<li>Utilisez un tampon MES (0,1 M d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique et 0,9 M de NaCl) pour préparer à la fois des oligomères amyloïdes protéiques uniquement protéiques et des oligomères de protéines solubles stabilisées. Peser 1,95 g de MES et 5,27 g de NaCl. Ajouter H2O et ajuster le pH à 4,7. Porter le volume final à 100 ml. Conserver à 4º C jusqu’à 6 mois.</li>
</ol>
2. Préparer de l’amyloïde uniquement protéique directement à partir de protéines natives
<ol>
	<li>Peser la protéine de votre choix (toute protéine native ou peptide) et la reconstituer à 10 mg/ml dans un tampon MES.</li>
	<li>Incuber à 65 ºC dans un bain d’eau pendant 4 heures. À la fin de la période, un précipité blanc est visible en solution.</li>
	<li>Neutraliser l’échantillon avec 10 % (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
	<li>Dialysez la protéine dans une cassette de dialyse pendant la nuit pour l’échanger vers le tampon souhaité pour une analyse plus approfondie.</li>
	<li>Un échantillon témoin de protéines natives peut être préparé en suivant les étapes 2.1, 2.3 et 2.4 sans précipitation de chaleur (étape 2.2).</li>
</ol>
3. Préparer de l’amyloïde hybride à partir d’oligomères solubles stabilisés de protéines natives
<ol>
	<li>Préparer des oligomères protéiques solubles stabilisés
	<ol>
		<li>Peser la protéine de votre choix et la reconstituer à 10 mg/ml dans un tampon MES. Laisser à température ambiante pendant 15 min.</li>
		<li>Peser le chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl]carbodiimide (EDC) et préparer une nouvelle dose de 20 mg/ml dans un tampon MES.</li>
		<li>Mélanger les solutions de protéines et d’EDC dans un rapport de 2:5 (v/v), soit 2 mg de protéines pour 10 mg d’EDC.</li>
		<li>Incuber à température ambiante pendant 2 heures.</li>
		<li>Neutraliser l’échantillon avec 10 % (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
		<li>Dialysez la protéine dans une cassette de dialyse pendant la nuit pour l’échanger vers le tampon souhaité pour une analyse plus approfondie.</li>
		<li>Conservez l’oligomère protéique soluble stabilisé à 4 ºC jusqu’à 4 semaines.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparez des amyloïdes hybrides à partir d’oligomères de protéines solubles stabilisés.
	<ol>
		<li>Pour préparer de l’amyloïde contenant de l’ADN, mélangez l’ADN et l’oligomère protéique soluble stabilisé dans un rapport de 1:1 (p/p). Laisser à 4 ºC pendant au moins 2 heures. Pendant cette période, un précipité insoluble est visible en solution lorsque la concentration initiale en protéines est de 0,5 mg/ml ou plus.</li>
		<li>Pour préparer l’amyloïde contenant de l’ARN, mélangez l’ARN et l’oligomère protéique soluble stabilisé dans un rapport de 1:1 (p/p). Laisser à 4 ºC pendant au moins 2 heures. Pendant cette période, un précipité insoluble est visible en solution lorsque la concentration initiale en protéines est de 0,5 mg/ml ou plus.</li>
		<li>Pour préparer de l’amyloïde contenant de l’héparine, mélangez de l’héparine et un oligomère protéique soluble stabilisé dans un rapport de 1:1 (p/p). Laisser à 4 ºC pendant au moins 2 heures. Pendant cette période, un précipité insoluble est visible en solution lorsque la concentration initiale en protéines est de 0,5 mg/ml ou plus.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+in+fatal+ways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding%3A+The+dark+side+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding: The dark side of proteins.</a> Nature. 464, 828-829 (2010).</li>
<li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+amylome%2C+proteins+capable+of+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).</li>
<li>Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amyloid+-+from+bacteria+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional amyloid - from bacteria to humans.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+Curli+Operons+in+Directing+Amyloid+Fiber+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Barnhart, M. M., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Biogenesis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli Biogenesis and Function.</a> Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).</li>
<li>Claessen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+n%09olved+in+aerial+hyphae+formation+in+Streptomyces+coelicolor+by+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A n	olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils.</a> Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).</li>
<li>Maji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+As+Natural+Storage+of+Peptide+Hormones+in+Pituitary+Secretory+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules.</a> Science. 325, 328-332 (2009).</li>
<li>Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+Signal+Their+Arrival%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids Signal Their Arrival.</a> Sci. Signal. 2, pe43(2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+Necrosome+Forms+a+Functional+Amyloid+Signaling+Complex+Required+for+Programmed+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Stefani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biophysical+features+of+both+oligomer%2Ffibril+and+cell+membrane+in+amyloid+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity.</a> FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).</li>
<li>Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+classification+of+toxic+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural classification of toxic amyloid oligomers.</a> J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+with+nucleic+acids+or+glycosaminoglycans+converts+soluble+protein+oligomers+to+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid.</a> J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
<li>Jiménez, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+Interaction+at+the+Origin+of+Neurological+Diseases%3A+A+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis.</a> J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).</li>
<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
<li>Vetri, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Serum+Albumin+protofibril-like+aggregates+formation%3A+Solo+but+not+simple+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism.</a> Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+an+amyloid+precursor+of+b2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).</li>
<li>Chiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+conditions+for+in+vitro+formation+of+amyloid+protofilaments+and+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).</li>
<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

La méthode décrite ici offre un moyen rapide et flexible de préparer des fibrilles amyloïdes in vitro à partir de pratiquement n’importe quelle protéine ou peptide de votre choix. Plusieurs types différents d’amyloïde peuvent être préparés de manière fiable - des fibrilles uniquement protéiques ou des agrégats hybrides contenant de l’ADN, de l’ARN ou des glycosaminoglycanes. Les procédures sont simples, directes et ne nécessitent pas de formation technique avancée. L’amyloïde préparée par cette méthode est assez...

Les protéines sont les macromolécules biologiques les plus abondantes présentes dans tous les types de cellules. Ils se présentent dans une grande variété de tailles, de structures et de modifications post-traductionnelles, et remplissent une énorme gamme de fonctions biologiques importantes lorsqu’ils sont dans leurs formes natives. Plus de deux douzaines de polypeptides aberrants ont été impliqués dans de nombreuses conditions pathologiques humaines, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et le diabète de type 21-4. Les protéines terminales mal repliées s’accumulent sous forme de fibrilles amyloïdes, les agrégats stables insolubles qui se produisent extracellulairement ou intracellulairement.
Malgré l’implication de protéines spécifiques dans certaines maladies, de plus en plus de preuves soutiennent l’idée que tous les polypeptides ont des propriétés intrinsèques qui permettent la transformation de l’amyloïde. Une étude de séquence à l’échelle du génome a identifié l'« amylome », par laquelle les fragments à tendance amyloïde constituent environ 15 % de tous les segments peptidiques codants d’E. coli à l’homme5. En conséquence, un nombre croissant d’amyloïdes fonctionnelles, qui participent à divers processus cellulaires importants, ont été découverts ces dernières années. Par exemple, les bactéries assemblent des amyloïdes pour former des structures de biofilm et de spores qui sont essentielles à leur survie et à leur pathogenèse6-9. Les hormones peptidiques forment des dépôts amyloïdes pendant le stockage dans les granules sécrétoires des mammifères avant d’être libérées, ce qui implique en outre que la forme amyloïde protéique peut remplir des fonctions biologiques bénéfiques6,10,11. De plus, les protéines peuvent également s’assembler en fibrilles amyloïdes pour relayer les signaux cellulaires critiques12,13.
Pendant de nombreuses années, les amyloïdes les plus étudiés sont préparés à partir de peptides individuels associés à des maladies humaines, tels que la bêta-amyloïde ou le peptide prion. Ces peptides n’ont généralement pas de structure bien définie et forment spontanément de l’amyloïde en solution au fil du temps, un processus médié par un intermédiaire partiellement mal replié qui sert de précurseur de l’amyloïde insoluble. Le précurseur de l’amyloïde est également appelé oligomère protéique soluble, qui est rare et instable lorsqu’il est généré à partir de peptides naturels14,15. Cependant, comme décrit précédemment, presque toutes les protéines peuvent en principe adopter la conformation amyloïde dans des conditions appropriées. Nous avons récemment mis au point une méthode pour préparer des oligomères solubles stabilisés de protéines natives, qui forment facilement de l’amyloïde en présence de divers cofacteurs16. Les fibrilles amyloïdes résultantes reflètent la nature complexe des agrégats de dés-repliement des protéines terminales17,18. Ici, nous utilisons le terme amyloïde protéique uniquement pour désigner les fibrilles protéiques sans cofacteurs et l’amyloïde hybride pour les fibrilles contenant des composants non protéiques.
Auparavant, diverses méthodes ont été développées pour générer de l’amyloïde in vitro en appliquant des conditions connues pour favoriser le mauvais repliement des protéines, telles qu’une température élevée, un environnement hydrophobe et des variationsde pH de 19 à 23. Cependant, ils s’associent à divers problèmes, tels qu’une faible efficacité, un pliage réversible, de grandes variations de lots ou une cinétique lente. L’approche décrite ici est reproductible, facile à mettre à l’échelle et permet de contrôler avec précision le moment et l’état de la conversion amyloïde.

<table><tbody><tr><td>Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de carbodiimide 1-éthyl-3-[3-diméthyl-aminopropyl] (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>ADN de sperme de saumon</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>ARN de levure torula</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Héparine de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Équipement :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer cassette de dialyse</td><td>Thermo/Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

génération rapide d’amyloïde à partir de protéines natives in vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Les protéines accomplissent des tâches cruciales dans les organismes en exerçant des fonctions induites à partir de leurs plis tridimensionnels spécifiques. Bien que les structures natives des polypeptides remplissent de nombreuses fonctions, il est maintenant reconnu que la plupart des protéines peuvent adopter un assemblage alternatif d’amyloïde riche en feuillets bêta. Les fibrilles amyloïdes insolubles sont initialement associées à de multiples affections humaines, mais elles sont de plus en plus montrées comme des acteurs fonctionnels participant à divers processus cellulaires importants. De plus, l’amyloïde déposée dans les tissus des patients contient des composants non protéiques, tels que les acides nucléiques et les glycosaminoglycanes (GAG). Ces cofacteurs peuvent faciliter la formation d’amyloïde, ce qui entraîne la génération de différents types de précipités insolubles. En tirant parti de notre compréhension de la façon dont les protéines se replient mal via un stade intermédiaire de précurseur soluble de l’amyloïde, nous avons mis au point une méthode pour convertir les protéines natives en fibrilles amyloïdes in vitro. Cette approche permet de préparer de l’amyloïde en grandes quantités, d’examiner les propriétés de l’amyloïde générée à partir de protéines spécifiques et d’évaluer les changements structurels accompagnant la conversion.

La capacité de convertir directement des protéines natives en amyloïde repose sur le changement de conformation induit à haute température dans le tampon MES. La précipitation dans la solution constitue un bon indicateur d'agrégation protéique et éventuellement de formation d'amyloïde. En revanche, afin de stabiliser les oligomères protéiques solubles, l'EDC est utilisé pour réticuler les protéines et fixer la conformation oligomérique induite dans le tampon MES. En conséquence, les oligomères protéiques stabilisés sont ...

Les protéines peuvent soit adopter une structure native, soit se replier en amyloïde insoluble. Les conditions qui favorisent la voie de mauvais repliement conduisent à la formation de différents types de fibrilles amyloïdes. Les méthodes décrites ici permettent une conversion rapide des protéines natives en amyloïde in vitro.

Génération rapide d’amyloïde à partir de protéines natives in vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir rapidement des fis amyloïdes à partir de n’importe quelle protéine in vitro. Ceci est réalisé en dissolvant la protéine de choix dans le tampon MES pour induire un mauvais repliement de la structure. La protéine peut ensuite être incubée à haute température, ce qui favorise la formation d’amyloïde en l’absence d’autres cofacteurs.Alternativement, la protéine est réticulée par EDC afin de générer des ligaments protéiques solubles stabilisés, le précurseur de l’amyloïde. Enfin, des cofacteurs non protéiques sont mélangés à des oligomères de protéines solubles stabilisés pour permettre la formation d’amyloïdes hybrides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les maladies de mauvais repliement des protéines, telles que la précision avec laquelle l’amyloïde se forme à partir d’oligomères protéiques solubles et si différents types d’amyloïde ont des fonctions biologiques et pathologiques distinctes.Pour commencer, préparez un tampon MES comme décrit dans le protocole textuel pour les protéines amyloïdes seules et les protéines solubles stabilisées. Tous les ligaments pèsent ensuite la protéine de leur choix et la reconstituent à 10 milligrammes par millilitre dans un tampon MES. Dans cette démonstration, on utilise de l’albumine sérique humaine ou HSA, incubez la solution à 65 degrés Celsius dans un bain-marie pendant quatre heures.À la fin de la période, un précipité blanc est visible dans la solution. Neutralisez l’échantillon avec 10 % de volume par volume. T tris, HCL dialyser la protéine dans une cassette de dialyse pendant la nuit pour l’échanger vers le tampon souhaité.Pour une analyse plus approfondie, préparez un échantillon de contrôle de protéines natives en suivant ces étapes sans précipitation de chaleur. Pour préparer une protéine soluble stabilisée, tous les ligaments pèsent la protéine de choix et la reconstituent à 10 milligrammes par millilitre. Dans un tampon MES, laissez la solution protéique à température ambiante pendant 15 minutes.Préparez un stock frais de 20 milligrammes par millilitre d’EDC dans un tampon MES. Mélangez les solutions de protéines et d’EDC dans un rapport de deux à cinq, puis incubez à température ambiante pendant deux heures après l’incubation. Neutralisez l’échantillon avec 10 % de volume par volume de tris HCL : dialysez la protéine dans une cassette de dialyse pendant la nuit pour l’échanger dans le tampon souhaité.Pour une analyse plus approfondie. Conservez la protéine soluble stabilisée dans tous les ligaments à quatre degrés Celsius jusqu’à quatre semaines. Cette suspension sera utilisée pour préparer des amyloïdes hybrides pour la préparation de l’ADN contenant de l’amyloïde et de l’ARN contenant de l’amyloïde.Mélangez l’acide nucléique et la protéine soluble stabilisée tous les ligaments dans un rapport de un pour un. Laissez le mélange à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures pendant cette période. Le précipité insoluble est visible en solution lorsque la concentration initiale en protéines est de 0,5 milligramme par millilitre ou plus.Pour préparer l’héparine contenant de l’amyloïde, mélangez de l’héparine et des protéines solubles stabilisées, le tout ligament dans un rapport de un pour un avant de l’incuber à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures. Semblable à l’acide nucléique contenant des amyloïdes dans le précipité soluble, il est visible en solution. Lorsque la concentration initiale en protéines est de 0,5 milligramme par millilitre ou plus, la capacité de convertir les protéines natives directement en amyloïde dépend du changement de confirmation induit à haute température.Dans le tampon MES, la précipitation dans la solution est une bonne indication de l’agrégation des protéines et de la formation possible d’amyloïde pour permettre aux oligomères protéiques solubles de se stabiliser. L’EDC est utilisé pour réticuler les protéines afin de solidifier la confirmation oligomérique induite dans le tampon MES. En conséquence, la protéine stabilisée allgas sont des protéines multimères distinctes des protéines natives monomères ou des agrégats induits par la chaleur.Lorsqu’ils sont séparés par une protéine soluble stabilisée à la page SDS, tous les ligaments peuvent facilement se lier aux acides nucléiques, y compris l’ADN et l’ARN, de manière indépendante de la séquence. Par conséquent, un test de décalage de gel peut être effectué pour visualiser l’interaction directe entre la protéine soluble stabilisée, tous les ligaments et l’ADN, ce qui entraînerait la migration retardée de l’ADN sur un gel AROS. La cytotoxicité est un caractère archétypal des protéines solubles.Protéine soluble stabilisée de tous les ligaments, tous les ligaments induits par la mort cellulaire dépendante de la dose, détectable par tri cellulaire activé par fluorescence. Comme le montre ici, les cellules RP I 8 2 2 6 sont extrêmement sensibles aux protéines solubles, toutes les morts induites par les ligaments qui sont mesurées par coloration à l’iodure de propidium. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer différents types d’amyloïde à partir de n’importe quelle protéine de votre choix in vitro.

rapid-generation-of-amyloid-from-native-proteins-in-vitro

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Production rapide d'amyloïdes à partir de protéines natives in vitro

DDS-AGE est une technique utile pour la détection et la caractérisation de l'amyloïde comme les polymères dans les cellules. Ici nous démontrons une adaptation qui rend cette technique prêtent à grande échelle des applications.

Le dépistage de l&#39;agrégation amyloïde par les semi-électrophorèse sur gel dénaturant Détergent-Agarose

Source : Balczon, R., et al. Méthodes de détection des amyloïdes cytotoxiques à la suite de l’infection de cellules endothéliales pulmonaires par Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre la procédure de génération d’un surnageant cytotoxique à partir de cellules endothéliales pulmonaires après une infection par Pseudomonas aeruginosa. Il décrit comment les protéines effectrices bactériennes perturbent la structure de la cellule hôte et induisent la libération d’oligomères...

Obtention d’amyloïdes cytotoxiques à la suite d’une infection bactérienne de cellules endothéliales pulmonaires de rat

Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Une méthode chromatographique en deux étapes est décrite pour la purification de la protéine Shadoo recombinante exprimée sous forme de corps d’inclusion chez Escherichia coli, ainsi qu’un protocole pour fibriller Shadoo purifié en structures amyloïdes.

Purification et le repliement de fibrilles d&#39;amyloïde de (Son)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged protéine recombinante Shadoo Exprimé en corps d&#39;inclusion dans<em&gt; E. coli</em

Un protocole d’expression acellulaire facile à utiliser pour l’incorporation spécifique de résidus d’analogues d’acides aminés non canoniques dans les protéines, y compris l’analyse en aval, est présenté pour des études médicales, pharmaceutiques, structurelles et fonctionnelles.

Incorporation spécifiques résidus de noncanonical acides aminés en protéines de modèle à l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Système de transcription-traduction libre Cell-

Il existe une demande pour faire précliniques Essais pour une nouvelle classe de médicaments « orphelins » appelées chaperons pharmacologiques reproductible, rapide et efficace. Nous avons développé un test culture cellule simple, très standardisé et polyvalent à écran pour patients admissibles ainsi que des médicaments nouveaux chaperons pharmacologiques.

In Vitro Mesure d’enzyme à Test pharmacologique chaperon réactivité Fabry et la maladie de Pompe

Méthodes simples sont décrits pour démontrer la production des cytotoxiques amyloïdes suite à une infection de l’endothélium pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa.

Méthodes pour détecter les cytotoxiques amyloïdes suivant Infection de pulmonaire cellules endothéliales par Pseudomonas aeruginosa

Nous présentons ici un protocole pour analyser la croissance d’Aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique.  En utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus , nous avons suivi l’infection et la propagation du champignon dans les grains mûrs en temps réel. L’essai est rapide, fiable et reproductible.

Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.

Fourni ici est un protocole pour étudier les interactions entre la forme indigène, préfibrillaire, et les fibrilles amyloïdes matures de différents peptides et protéines avec des mitochondries isolées de différents tissus et diverses zones du cerveau.

Interactions avec et perméabilisation des membranes des mitochondries cérébrales par amyloïde Fibrils

Nous décrivons ici un système de levure reconstituant la γ-sécrétase humaine. Ce système permet d’identifier et d’étudier les mutations affectant l’activité et de cribler les inhibiteurs de la γ-sécrétase (GSI). En utilisant les propriétés de perte de fonction des mutants familiaux de la maladie d’Alzheimer, il est possible de dépister les modulateurs de la γ-sécrétase (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modèles de la maladie d’Alzheimer pour cribler les gènes, les mutations et les produits chimiques affectant la production de bêta-amyloïde par la γ-sécrétase

Apprenez à générer rapidement des fibrilles amyloïdes à partir de protéines natives in vitro en utilisant la température et le réticulage chimique. Cette méthode permet d'étudier le mécanisme de formation de l'amyloïde.

Génération rapide d’amyloïde à partir de protéines natives in vitro

Explorer plus de vidéos