Des procédés pour la modulation et de l'analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la fonction du facteur de transcription NF kappa B dans le cerveau adulte. Ceci est accompli en sélectionnant d’abord des souris transgéniques qui inhibent spécifiquement l’activité de NF kappa B dans les neurones. La deuxième étape de la procédure consiste à tester les conséquences comportementales de l’inhibition de NF kappa B en utilisant le motif spatial, la séparation ou les granges, le labyrinthe.

La troisième étape est la profusion soigneuse des animaux, l’ablation de la cervelle et la section appropriée de celle-ci. La dernière étape consiste à analyser les effets histologiques et structurels, tels que la visualisation des projections de fibres moussues par immuno-marquage. En fin de compte, l’utilisation du test de comportement suivi de l’histologie peut corréler les changements dans l’apprentissage dépendant du gyrus denté avec les changements structurels dans les tissus associés.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme Mars Vase est que les liaisons de séparation spatiale MA offrent la possibilité de mesurer spécifiquement les processus d’apprentissage anti-dépendance à l’enfant ainsi que la dégénérescence et la régénération neurologiques dans cette zone du cerveau. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse adulte, telles que l’apprentissage en tant que séparation de motifs spéciaux. La démonstration du labyrinthe sera faite par Angela Kula, une technicienne de mon laboratoire.

La perfusion sera présentée par Peter Hyman, associé de recherche. Ensuite, la section des cerveaux sera montrée par le technicien Ulrich KA. Et enfin, la microscopie confocale à balayage sera présentée par Jeanine Muah, une étudiante au doctorat de mon laboratoire Réaliser la séparation spatiale des motifs.

Barnes Maze Tests comportementaux selon les directives internationales et locales. Pour ce test, il est important d’utiliser uniquement des souris mâles âgées d’au moins six mois. Pour chaque série d’essais, les animaux doivent être âgés d’à moins de quatre jours et le même exploitant doit effectuer tous les essais avant l’essai.

Les souris doivent être nourries avec un régime standard afin qu’elles soient motivées par des aliments sucrés. Pour mettre en place le test, procurez-vous d’abord une plaque blanche de 120 centimètres de diamètre en plastique dur. Les repères de labyrinthe supplémentaires peuvent être faits de différents matériaux et peuvent avoir des formes différentes.

Il est important de noter qu’ils doivent avoir un contraste élevé pour être clairement reconnus par les roues de l’animal. Les échelles et les tunnels sont tous de bons indices. Placez la plaque sous plusieurs lampes fluorescentes au néon modérément intenses, afin que les souris soient motivées à sortir de la lumière.

La pièce doit être à humidité contrôlée et à une température constante de 22 degrés Celsius. Configurez maintenant le système de suivi vidéo. Positionnez l’appareil photo à 115 centimètres au-dessus du centre de la plaque.

Ensuite, fixez des queues de labyrinthe supplémentaires multicolores à un chiffon de couleur blanche qui s’adapte à la plaque. Placez-les près du centre du tissu afin qu’ils soient facilement visibles par les animaux. Maintenant, nettoyez soigneusement la plaque avec le désinfectant rapide qui peut éliminer toute odeur de la configuration expérimentale.

Placez sept maisons de nourriture jaunes identiques sur l’assiette blanche. Leurs positions doivent être marquées sans équivoque un jour avant de commencer les tests, habituez chaque souris au disque. Placez des récompenses de granulés de nourriture sucrée comme une boucle de fruit coupée en quartiers à l’intérieur de chacune des sept maisons de nourriture pour l’essai d’habitation.

Placez chaque souris sur le point de départ de la plaque et laissez-lui 10 minutes pour explorer. Enregistrez cette exploration entre souris. Nettoyez la plaque circulaire et les bâtiments alimentaires avec un désinfectant rapide.

Réapprovisionnez également les récompenses alimentaires. Au cours des sept prochains jours consécutifs, exécutez les essais d’essai. Toutes les maisons, sauf une, sont fermées par du ruban adhésif transparent pendant toute la durée de l’expérience.

C’est toujours la même maison. Chaque maison est toujours chargée d’une récompense et le test se déroule comme l’épreuve d’habituation. Effectuez les tests à la même heure de la journée pour chaque animal afin d’éviter les variations circadiennes.

Par la suite, analysez la latence, la distance parcourue et les erreurs à l’aide de statistiques appropriées. Les logiciels définissent les erreurs comme s’approcher de la mauvaise maison de restauration ou entrer en contact avec la bonne boîte, mais ne pas entrer et récupérer la récompense. Pour comparer les groupes, utilisez une ANOVA à deux facteurs avec un test post hoc bon fer.

Après avoir anesthésié l’animal par une injection interpéritonéale de vertine, perfusez-le soigneusement par voie transcinale avec du PBS contenant de l’héparine et du propane. Faites un trou dans le ventricule gauche à l’aide d’une aiguille de calibre 26. Faites également une incision dans l’oreillette droite pour permettre au sang et aux huit perfusés de s’écouler.

Insérez l’aiguille de perfusion dans le ventricule gauche au niveau du trou avec un angle droit et à une profondeur d’un à deux millimètres. Utilisez une pression hydrostatique de 1,2 à 1,4 mètre et perfusez la souris pendant deux à quatre minutes. Suivez l’héparine et le propane avec 4 % de paraldéhyde dans le PBS pendant 10 à 15 minutes.

La perfusion doit être à un taux de 15 millilitres par minute. Maintenant, disséquez le cerveau. Il doit être blanc pâle sans vaisseaux sanguins rouges visibles.

Fixez tous les cerveaux collectés dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain. Cryo protéger les cerveaux dans 30 % de saccharose dans PBS les stocker à quatre degrés Celsius pendant au moins 24 heures plus tard.

Les cerveaux sont congelés sur une scène cryogénique et coupés en sections horizontales de 40 microns d’épaisseur. Après avoir coloré les sections avec un anticorps pour le filament neurologique M, les projections de fibres moussues peuvent être visualisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser à la longueur d’onde appropriée pour l’anticorps fluorescent. Commencez le balayage à faible grossissement et orientez-vous vers l’hippocampe et les projections de fibres moussues.

Ensuite, à un grossissement plus élevé, collectez des scans de césarienne à haute résolution des fibres moussues pour analyse afin d’étudier l’expression du transgène I kappa B alpha AA one. Dans le double transgénique, les cerveaux de souris ont été isolés, cryosectionnés et colorés à l’aide d’un anticorps contre la GFP. La microscopie a révélé une forte expression du transgène dans la région CA un, la région CA trois et dans le DG pour déterminer le type de cellule le plus précoce exprimant le CAMK deux alpha piloté I kappa B alpha AA un dans la région neurogène de l’hippocampe.

Sections cryo d’hippopotames Campi de I Kappa BTTA. Les animaux ont été colorés pour la courtine double et l’analyse confocale du transgène a révélé des signaux GFP dans les jeunes cellules granulaires positives au DCX marquées par les flèches indiquant l’induction de l’expression du transgène par l’activité alpha de CAMK deux. Des coupes coronales de l’hippocampe de souris i kappa BTTA et i Kappa B moins ont été colorées pour le neurofilament M afin de visualiser les projections de fibres moussues et de révéler une organisation complexe et vésiculaire chez les souris i kappa BTTA.

Les projections de fibres moussues ont été gravement altérées. De plus, l’inhibition de NF kappa B a conduit à une réduction significative de l’épaisseur de la pale sperale et à un volume DG plus petit pour étudier les raisons potentielles de ce défaut structurel dramatique. Des tranches d’hippocampe fraîches non fixées de souris témoins et I kappa BTTA ont été colorées avec du fluoro jade C, ce qui permet la détection spécifique de la mort cellulaire neuronale.

Une augmentation spectaculaire du nombre de neurites dégénératives a été observée chez les animaux transgéniques doubles par rapport aux témoins transgéniques simples. De plus, une augmentation significative des cellules positives à la capace clivée a été détectée chez les souris I kappa BTTA. En revanche, la coloration immunohistochimique contre DCX a révélé une augmentation significative des quantités de cellules DCX positives dans le cerveau des souris I kappa BT.

De plus, les cellules positives d CX chez I kappa B TTA hippo Campi n’étaient pas disposées exclusivement dans la zone sous-granulaire, mais ont également été trouvées dans les régions plus profondes de la dg. Alors que les progéniteurs positifs à D CX chez les animaux témoins étaient localisés presque exclusivement dans la zone sous-granulaire. Le test de la quantité accrue de cellules exprimant DCX était le résultat de la maturation de progéniteurs antérieurs ou directement dû à la prolifération de cellules DCX positives.

BRDU a été injecté par voie intrapéritonéale à des souris i kappa BTTA et témoins, qui ont ensuite été cryosectionnées et colorées avec DCX et BRDU pour l’analyse de la prolifération. BRDU a été injecté une fois suivi d’une analyse après 24 heures. Pour l’analyse de la différenciation, trois injections ont été effectuées par jour, suivies d’une analyse sept jours après une seule injection de BRDU.

Aucune différence significative n’a été observée dans le nombre total de cellules BRDU positives entre les animaux I kappa BTTA négatifs et les animaux témoins. En revanche, l’approche des trois injections en série a révélé une augmentation nette du nombre de cellules positives B-R-D-U-D-C-X dans le DG de I capa, BTTA. Les souris perturbées par la différenciation ou l’intégration des cellules exprimant DCX peuvent avoir augmenté le nombre de cellules et les cellules de type trois peuvent avoir été impliquées pour tester spécifiquement le comportement des souris transgéniques doubles.

Dans une tâche dépendante de la DG, le S-P-S-B-M a été utilisé. Les animaux témoins I kappa B ont exploré les maisons de nourriture en série le premier jour de l’expérience. Après sept jours de formation, les animaux ont pu trouver directement la maison de nourriture ouverte.

En revanche, les animaux IA BTTA continuent d’explorer les maisons de nourriture en série, même après la formation. L’observation d’une augmentation significative des distances parcourues et de latences et de taux d’erreur plus élevés chez les animaux I kappa BTTA par rapport aux animaux témoins i Kappa B suggère que ces animaux présentaient de graves défauts d’apprentissage. Une fois établie, cette technique peut être réalisée en 30 minutes par animal si elle est exécutée correctement après son développement.

Cette technique pourrait ouvrir la voie à d’autres neuroscientifiques intéressés par les tâches dépendantes des gyroscopes tels que la neurogenèse adulte, la dégénérescence ou la régénération chez la souris.