Name: Des procédés pour la modulation et de lanalyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T23:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Découvrez des méthodes pour moduler et analyser la neurogenèse adulte dépendante de NF-κB chez la souris. Ce protocole utilise le test comportemental Barnes maze et l'analyse histologique pour étudier les fonctions cognitives.

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Nous remercions Angela Kralemann-Köhler pour un excellent soutien technique. Le travail expérimental décrit ici a été réalisée dans notre laboratoire et a été soutenu par des subventions du Conseil de recherches en allemand (DFG) à CK et BK et une subvention du ministère allemand de la Recherche et de l&#39;Education (BMBF) à BK.

Déclaration éthique Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les règlements de la commission des animaux et l&#39;utilisation des soins gouvernementale, LANUV de l&#39;état Rhénanie du Nord-Westphalie (Düsseldorf, Allemagne). Toutes les expériences animales ont été approuvés par LANUV, Düsseldorf sous le numéro de licence 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance et le nombre d&#39;animaux requis pour l&#39;étude. Une. Protection des animaux et du Logement <ol><li> Tous les animaux utilisés dans les protocoles décrits ici doivent être conservés dans des conditions exemptes d&#39;organismes pathogènes spécifiques, tels que définis par l&#39;Association Fédération européenne des sciences des animaux de laboratoire (FELASA). </li><li> Souris doivent être gardés dans des cages standard pour une température et à l&#39;humidité contrôlée (22 ° C) dans des conditions diurnes chambre (12 h cycle lumière / obscurité) avec filtre HEPA air. </li><li> Aliment normalisé et l&#39;eau doivent être fournis ad libitum. &lt;/ Li&gt; <li> Si IkB / tTA et IkB / - souris de contrôle sont utilisés, le génotypage par PCR devrait être effectué pour chaque animal, tel que décrit dans 7, 18. </li><li> Les mâles avec une différence d&#39;âge de moins de quatre jours devraient à être utilisés pour réduire la variabilité individuelle. </li><li> (OPTION): Pour NF-kB expériences de réactivation, la doxycycline doit être administré dans l&#39;eau potable (2 mg / ml avec 2,5% de saccharose) pendant au moins 14 jours. </li></ol> 2. Motif spatiale séparation-Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Tous les tests de comportement doit être effectuée conformément aux directives internationales et locales. </li><li> IMPORTANT! Utilisez uniquement des souris mâles avec un âge de six mois ou plus. La différence d&#39;âge entre les animaux d&#39;une série d&#39;essais doit être inférieur à quatre jours. Le test doit être effectué par le même opérateur, pour chaque série. La souris devrait recevoir une alimentation standard avant l&#39;épreuve d&#39;augmenter encore la motivation partiellement entraîné par commeweet récompense alimentaire. </li><li> Mettre en place une plaque blanche circulaire réalisée à partir de plastique dur (diamètre de 120 cm, voir Figure 5A) dans une et à l&#39;humidité ambiante à température contrôlée (22 ° C), éclairé par au moins 4 x 80 W et 3 x 215 lampes fluorescentes W néon . IMPORTANT! Assurer l&#39;éclairage correct est utilisé, comme la motivation des souris pour entrer dans les maisons des aliments est partiellement entraîné par leur aversion pour les endroits lumineux, exposés. </li><li> Mettre en place le système de vidéo-tracking. L&#39;appareil doit être placé 115 cm au-dessus du centre de la plaque (voir figure 5A). </li><li> Fixez multicolores indices extra-labyrinthe (CEM) à un tissu de couleur blanche dans des positions bien visibles pour les animaux, environ 100 cm de la frontière de la plaque (voir figure 5A). </li><li> Nettoyez soigneusement la plaque avec un désinfectant rapide qui peut éliminer toute odeur de l&#39;expérimental. </li><li> Placez sept maisons identiques jaune alimentaires (12 cm x 7 cm x 8 cm, voir la figure 5A </strong&gt;) sur la plaque blanche. Les positions doivent être sans équivoque marqués (voir figure 5A). </li><li> Placez douces récompenses à granulés de nourriture (un trimestre d&#39;une maison de boucle de Froot / alimentaire de l `Kellogs) à l&#39;intérieur toutes les maisons de nourriture sur des positions définies (voir figure 5A) avec une seule maison de la nourriture défini étant librement accessible à l&#39;animal (lieu F, voir la figure 5A ). Fermer les maisons alimentaires non ciblés avec une feuille transparente. </li><li> Avant l&#39;essai, effectuer accoutumance (un jour avant de commencer la tâche). Faire toutes les maisons alimentaires librement accessibles et permettent aux souris pour explorer le labyrinthe librement et de récupérer une récompense de boulette de nourriture (10 min / animal). </li><li> Mettez l&#39;ordinateur et l&#39;appareil photo et lancer le logiciel de système de vidéo-tracking. </li><li> Commencer l&#39;enregistrement. </li><li> Placez l&#39;animal au point de départ défini sur la plaque circulaire (figure 5A, S: position de départ) et de permettre aux souris de rechercher la maison de la nourriture cible pendant 10 min. </li><li> Stop la vidéo de suivi. </li><li> IMPORTANT! Nettoyez la plaque circulaire et les maisons de nourriture après chaque essai avec un désinfectant rapide. </li><li> Répétez le test par jour pendant sept jours consécutifs (pour chaque animal). </li><li> Analyser les résultats (temps de latence, la distance parcourue et erreurs) en utilisant un logiciel de statistiques appropriées. Définir des erreurs que l&#39;on approche de la maison et / ou contact avec la boîte appropriée sans entrer et récupérer la récompense de boulette de nourriture aliments mal. Pour une analyse groupée utiliser deux ANOVA avec test de Bonferroni post-hoc. </li><li> (OPTION) Sacrifiez les souris et analyser l&#39;hippocampe comme décrit ci-dessous. </li></ol> 3. BrdU Labeling <ol><li> Injecter par voie intrapéritonéale de 50 mg / kg ip BrdU une fois par jour pendant 3 jours (analyse de la différenciation et l&#39;intégration) ou 200 mg / kg ip pour une seule injection (analyse de la prolifération). </li><li> Sacrifier les animaux, disséquer l&#39;hippocampe et préparer 40 sections um comme décrit ci-dessous. </li><li> Dénaturer l&#39;des sections avec du HCl 2 M pendant 10 min et incuber dans 0,1 M de tampon de borate pendant 10 min. </li><li> Étiqueter une série unique en douze sections um 40 (240 um d&#39;intervalle) de chaque animal par immunohistochimie, comme décrit ci-dessous en utilisant des anticorps dirigés contre BrdU. </li><li> Quantifier les cellules marquées par une analyse par microscopie confocale dans toute la mesure rostrocaudal de la couche de cellules granulaires et la zone sous-granulaire. Multiplier les chiffres obtenus par 12 pour obtenir le nombre total estimé de cellules marquées à la BrdU par l&#39;hippocampe et diviser par deux pour obtenir le nombre total de cellules marquées par la DG. </li></ol> 4. Retrait des cerveaux et préparation de cryosections de non perfusés Animaux <ol><li> Respecter les procédures approuvées localement pour euthanasier les animaux. Les souris peuvent être directement euthanasiés par luxation du rachis cervical. </li><li> (Facultatif) Les animaux peuvent être anesthésiés avant l&#39;euthanasie conformément aux directives locales et internationales, par exemple en Inje intrapéritonéalection de 0,8 ml Avertin pour 33 g de souris (fraîchement préparé en mélangeant 150 ml de solution d&#39;achat d&#39;actions en 2,2 mg 2,2,2-tribromoéthanol dans 1 ml d&#39;isoamyle éthanol avec 1,85 ml d&#39;une solution saline ou un tampon physiologique). </li><li> Stériliser la tête à la Bétadine (10% de povidone-iode)-gaze imbibée et écouvillon ensuite avec de la gaze trempé dans 70% d&#39;éthanol. </li><li> Décapiter l&#39;animal à l&#39;aide des ciseaux chirurgicaux appropriés et tirer la peau de côté. </li><li> (Facultatif) fixateurs peuvent être appliquées pour éviter repliement de la peau retardée. </li><li> Faire une incision médiane dans le crâne et tirez délicatement les fragments de crâne de côté. </li><li> Retirez délicatement l&#39;ensemble du cerveau à l&#39;aide d&#39;un instrument chirurgical approprié (par exemple la Moria cuillère). </li><li> Pré-refroidissement 25 ml de 2-méthylbutane dans un bécher de 50 (par exemple Schott Duran) à -30 à -40 ° C sur de la glace sèche. Remarque: Pour la coloration flottant de sections «épais» qui sont parfaitement adaptés pour la microscopie confocale à balayage laser, retirez cerveau, laver 3fois dans du tampon et stocker à 4 ° C dans un tampon phosphate la solution de saccharose à 30% dans 50 ml tube jusqu&#39;à ce que le cerveau a coulé vers le bas vers le bas (typiquement durant la nuit). </li><li> Placez délicatement le cerveau sur un morceau de Nescofilm (Parafilm) et couvrir avec un grand quantité de composé TissueTek PTOM geler sur Nescofilm en 2-méthylbutane, conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Remarque: Pour un entreposage de longue date à -20 ° C magasin dans 9% de saccharose, 7 mM de MgCl2, 50 mM de tampon phosphate, 44% de glycérol. </li><li> Couper le cerveau en 10-12 sections um d&#39;épaisseur sur cryomicrotome approprié. Remarque: Pour les sections flottantes épaisses, geler cerveau sur cryotome stade de cryotome approprié (par exemple Reichert Jung, Frigomobil.) Et couper 40 um sections horizontales de -20 ° à - 25 ° C. Recueillir sections de couteau avec une brosse fine et collecter dans un tampon ou de garder dans une solution de stockage (étape 4.9) à -20 ° C pour le stockage à long terme. </li><li> Monter soigneusement deux tranches sur des lames de microscope simples. Le nouse de diapositives Superfrost Ultraplus est fortement recommandée afin de maximiser l&#39;adhérence des sections. </li><li> Sécher les lames pendant 5 min à température ambiante. Lames peuvent être stockées à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 5. Préparation des sections de perfusé Animaux <ol><li> Anesthésier les animaux décrits ci-dessus (étape 4.2). </li><li> Perfuser soigneusement l&#39;animal transcardiaque avec du tampon phosphate salin (PBS) contenant de l&#39;héparine (0,025 g/100 ml de PBS) et la procaine (0,5 g/100 ml de PBS) pendant 2 à 4 min, suivi par du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 10 à 15 min . La perfusion est réalisée de façon optimale par perfusion via le ventricule gauche et l&#39;orifice de l&#39;oreillette droite en utilisant une pression hydrostatique de l&#39;ordre de 1.2 à 1.4 m ou en utilisant une pompe péristaltique fixé à environ 15 ml / min. Résultats de la perfusion optimales dans un cerveau blanc pâle avec pas de vaisseaux sanguins rouges sont visibles. </li><li> Disséquer et post-fixer le cerveau dans du paraformaldéhyde 4% à 4 ° C pendant 24 heures. </li><li> Cryoprotéger le cerveau en saccharose à 30% dans du PBS à 4 ° C pendant au moins 24 h. </li><li> Geler le cerveau sur la scène cryotome. </li><li> Préparer 40 um sections horizontales de forebrains entiers en utilisant un cryotome approprié. </li><li> Les lames peuvent être stockées dans une solution de cryoprotecteur (0,1 M de tampon phosphate, 50% de glycerol, 0,14% de MgCl2, 8,6% de saccharose) à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 6. Immunohistochimie de cerveau Sections de non perfusés Animaux <ol><li> Post-fixer les coupes cryogéniques, préparés comme décrit ci-dessus, en utilisant du méthanol à -20 ° C pendant 10 minutes à froid. </li><li> Bloquer avec 5% de sérum normal contenant 0,3% de Triton-X (à partir de l&#39;espèce qui a été utilisé pour élever l&#39;anticorps secondaire) pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x et incuber avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x et incuber avec des anticorps secondaires à température ambiante pendant une heure. </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x </li><li> Counterstain la section de l&#39;ADN en utilisant vert SYTOX, ou DAPI (ou un colorant de l&#39;ADN de remplacement). </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x </li><li> Incluez les sections dans un milieu aqueux intégration. </li><li> Que le milieu d&#39;inclusion polymériser pendant au moins 48 heures. </li></ol> 7. Immunohistochimie de cerveau articles de perfusé Animaux <ol><li> Bloc tel que décrit dans l&#39;étape 6.2 et incuber les coupes de cerveau fixées dans une solution d&#39;anticorps primaire dilué dans du PBS contenant 0,3% de Triton-X (flottant) pendant une nuit à 4 ° C par la suite </li><li> Rincer trois fois avec PBS 1x et incuber dans une solution d&#39;anticorps secondaire dilué dans du PBS contenant 0,3% de Triton-X (flottant librement) à la température ambiante pendant 3 heures. </li><li> Rincer 3 fois avec PBS 1x </li><li> Contre-colorer la section de l&#39;ADN en utilisant SYTOX vert ou DAPI (ou un colorant de l&#39;ADN de remplacement). </li><li> Rincer trois fois avec PBS 1x </li><li> Incluez les sections dans un milieu aqueux intégration. </li><li> Que le milieu d&#39;inclusion polymériser pour unt moins 48 heures. </li></ol> 8. Enquête sur les projections Mossy fibre <ol><li> Sacrifier les animaux, préparer 40 um coupes coronales comme décrit ci-dessus et tacher la section de l&#39;hippocampe en utilisant un anticorps pour neurofilaments M. </li><li> Parcourez les sections à la longueur d&#39;onde appropriée à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à balayage laser microscope pour visualiser les fibres moussues et les noyaux. Démarrez le balayage à faible grossissement. </li><li> Utilisez les images à faible grossissement d&#39;orientation et de cibler l&#39;hippocampe avec des projections de fibres moussues. </li><li> Parcourez les sections (z) sectionnement à haute résolution et fort grossissement. </li><li> Analyser l&#39;aspect morphologique et la connectivité des fibres moussues visualisées par coloration de NF-M. </li><li> (OPTION) Analyser la taille et le volume de l&#39;hippocampe lames. Utiliser le signal d&#39;ADN pour les mesures. </li></ol> 9. Fluoro-Jade C Assay (mort cellulaire neuronale) <ol><li> Sacrifier les animaux, disséquer le hippocAmpus, et préparer 12 sections um comme décrit ci-dessus. </li><li> Laissez les sections sécher pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Fixer les sections à 4% de PFA pendant 40 min à température ambiante. </li><li> Laver rapidement les sections 3x avec le trou DDH 2 O. </li><li> Incuber les sections avec 0,06% de permanganate de potassium (KMnO 4) pendant 10 min sous continu, agitant doucement. </li><li> Lavez les sections 3x avec le trou DDH 2 O. </li><li> Incuber les sections avec une solution C Fluoro-Jade 0,002% pendant 20 min à température ambiante. </li><li> (En option) pour colorations nucléaires simultanées, solution 0,002% Fluoro-Jade C peut être complétée avec 10 pg / ml DAPI. </li><li> Laver rapidement les sections 3x avec le trou DDH 2 O. </li><li> Laissez les sections sécher pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Incuber les sections avec du xylene (1 min) </li><li> Montez les sections en utilisant un milieu de montage à base de xylène (DPX). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas de conflit d&#39;intérêt.

Neurogenèse adulte, et la possibilité de sa manipulation par l&#39;inhibition de NF-kB dans les neurones, et sa réactivation plus tard par la doxycycline, propose un système fascinant pour les enquêtes sur les nouveaux neurones dans le cerveau adulte, ainsi que dans des neurones de-et re-génération . La beauté de ce système est que le NF-kB voie de signalisation inhibition des neurones non seulement entraîne des changements dans la mort des cellules neuronales, la prolifération des progéniteurs et la migration, et les c...

Ontologiquement, l&#39;hippocampe est l&#39;une des plus anciennes structures cérébrales anatomiques connues. Il est responsable de diverses tâches complexes, telles que les fonctions pivots dans la régulation de la mémoire à long terme, l&#39;orientation spatiale, et la formation et la consolidation de la mémoire respective. Anatomiquement, l&#39;hippocampe est constitué de couches de cellules pyramidales (stratum pyramidale), y compris la corne d&#39;Ammon (CA1, CA2, CA3 et CA4) régions et le gyrus denté (gyrus dentatus), qui contient des cellules granulaires et quelques progéniteurs neuronaux dans sa zone sous-granulaire . Les cellules granulaires projettent vers la région CA3 via les fibres moussues dits (axones des cellules granulaires). Jusqu&#39;à la fin du siècle dernier, le cerveau des mammifères adultes a été considéré comme un organe statique manque plasticité cellulaire et la neurogenèse. Cependant, au cours des deux dernières décennies, un nombre croissant de preuves démontre clairement la neurogenèse adulte qui aura lieu dans au moinsdeux régions du cerveau, la zone sous-ventriculaire (SVZ) et la zone sous-granulaire de l&#39;hippocampe. Nos études antérieures, et ceux d&#39;autres groupes, ont montré que le facteur de transcription NF-kB est un des régulateurs moléculaires essentiels de la neurogenèse adulte, et que ses résultats de-régulation dans de graves anomalies de l&#39;hippocampe structurelles et des déficiences cognitives 1-6. NF-kB est le nom générique d&#39;un facteur de transcription inductible composé de différentes combinaisons dimères de cinq sous-unités de liaison à l&#39;ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, et p65 (RelA), les trois derniers qui ont des domaines de transactivation. Dans le cerveau, la forme la plus abondant trouvé dans le cytoplasme est un hétérodimère de p50 et p65, qui est maintenu sous une forme inactive par inhibiteur de kappa B (IkB)-protéines. D&#39;étudier et de manipuler directement la neurogenèse NF-kB-entraîné, nous utilisons des modèles de souris transgéniques pour permettre simples inhibition de tous les subun NF-kBson, en particulier dans le cerveau antérieur 7 (voir la figure 1). À cette fin, nous Croisé les lignées de souris transgéniques suivantes, IKB / - et -/tTA. Le IKB transgénique / - ligne a été généré en utilisant un mutant négatif trans-dominant de NF-kB inhibiteur IκBa (super-répresseur IκBa-AA1) 8. Contrairement à la IKBa de type sauvage, IKBa-AA1 a deux des résidus de sérine mutés en alanines (V32 et V36), qui empêchent la phosphorylation et la dégradation par le protéasome ultérieure de l&#39;inhibiteur. Pour cerveau antérieur expression spécifique des neurones de la IκBa-AA1-transgène, IkB / - souris ont été croisées avec des souris hébergeant une kinase calcium-calmoduline-dépendante IIa (CAMKIIα)-promoteur qui peut être entraîné par trans-activateur tétracycline (TTA) 9. souris knock-out p65 ont un phénotype létal embryonnaire, en raison de l&#39;apoptose massif du foie 10, si l&#39;approche présentée ici fournit une méthode éléganted&#39;enquêter sur le rôle de NF-kB dans postnatale et la neurogenèse adulte. Le test de comportement classique pour étudier l&#39;apprentissage spatial et la mémoire a été décrit dans les années 1980 par Richard Morris, un test connu sous le nom d&#39;eau de Morris (MWM) 11. Dans ce champ ouvert eau-labyrinthe, les animaux apprennent à sortir de l&#39;eau opaque sur une plate-forme cachée fondée sur l&#39;orientation et extra-labyrinthe repères. Une variante sec de MWM est le labyrinthe Barnes dite (BM) 12. Ce test utilise une plaque circulaire de 20 trous circulaires disposés à la frontière d&#39;une plaque, avec un trou défini comme une boîte d&#39;échappement, et des repères visuels extra-labyrinthe d&#39;orientation. Les deux paradigmes expérimentaux reposent sur le comportement de vol induite par un rongeur de l `aversion pour l&#39;eau, ou des espaces ouverts, illuminées. Les deux tests permettent une enquête de l&#39;orientation spatiale, et la performance de mémoire liée. Bien que l&#39;hippocampe joue un rôle essentiel et en général la formation de la mémoire spatiale, l&#39;hippocampe rÉGIONS impliqués diffèrent selon le critère appliqué. La mémoire testé en BM découle de l&#39;activité neuronale entre le cortex enthorinal (CE) et les neurones pyramidaux situés dans la région CA1-de l&#39;hippocampe sans contribution de la DG 13-16. En particulier, la BM classique repose principalement sur ​​la navigation par la voie temporo-ammonique monosynaptic de CE III CA1 à CE V. Surtout, la DG est cruciale impliquée dans la configuration dite reconnaissance spatiale 17, ce qui implique non seulement le traitement des l&#39;information visuelle et spatiale, mais aussi la transformation des représentations ou des souvenirs similaires dans différents, les représentations ne se chevauchent pas. Cette tâche requiert un circuit tri-synaptique fonctionnelle du CE II DG de CA3 de CA1 et CE VI, qui ne peuvent être testés dans le BM 15. Pour relever ces défis, nous avons conçu SPS-BM comme un test de comportement pour tester spécifiquement denté performances cognitives gyrus dépendant en coanimaux ntrol, et dans le modèle super-répresseur IKB / TTA suite à l&#39;inhibition de NF-kB. Néanmoins, contrairement à la MWM ou la BM, le SPS-BM peut révéler des déficits comportementaux subtils résultant de la dépréciation de la neurogenèse. Depuis spatiale motif de séparation est strictement dépendante d&#39;un circuit fonctionnel entre la CE II et la DG et CA3 et CA1 et CE VI, ce test est très sensible aux changements potentiels dans la neurogénèse, les modifications de la voie des fibres moussues ou altérations de l&#39;homéostasie tissulaire au sein de la DG. Techniquement, la mise en place de notre test est basé sur l&#39;étude de Clelland et al., Dans lequel le motif de la séparation spatiale a été testé en utilisant un bois 8-bras bras labyrinthe radial (RAM) 19. Dans notre set-up modifié, les huit bras ont été remplacés par sept maisons jaunes alimentaires identiques. En résumé, les méthodes présentées ici, y compris l&#39;analyse de (DCX +) des cellules de doublecortine exprimant dans l&#39;hippocampe, les projections de fibres moussues, neuronale cellule death et en particulier le SPS-BM présenté ici, peut être appliquée à des enquêtes sur d&#39;autres modèles de souris comportant des transgènes qui ont un impact sur la neurogenèse adulte. D&#39;autres applications peuvent inclure l&#39;étude des agents pharmacologiques et mesurer leur impact sur le modèle de séparation DG et spatiale.

<table><tbody><tr><td>Moria MC17 Cuillère perforée&nbsp ;</td><td>FST</td><td>10370-18</td><td>Enlèvement du cerveau Microscope</td></tr><tr><td>de dissection</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi SV8</td><td>Enlèvement du cerveau</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux&nbsp ;</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td>ablation de la cervelle</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux&nbsp ;</td><td>FST</td><td>14381-43</td><td>Epilation du cerveau</td></tr><tr><td>Pince Dumont #5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Eplation du cerveau</td></tr><tr><td>SuperFrost Slides</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td>Lames pour l’immunohistochimie</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>fixateur</td></tr><tr><td>TissueTek OCT compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>1004200018</td><td>encastrement du cerveau</td></tr><tr><td>Blocage du sérum normal de chèvre</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>005-000-001</td><td>dans l’IHC</td></tr><tr><td>Sérum de lapin normal</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>011-000-001</td><td>dans l’IHC</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>017-000-001</td><td>Blocage de l’anticorps</td></tr><tr><td>anti-Neurofilament-M</td><td>IHC Études de développement Banque d’hybridomes</td><td>2H3</td><td>IHC, dilution 1:200</td></tr><tr><td>anti-Doublecortin&nbsp ; anticorps</td><td>sc-8066</td><td>Santa Cruz</td><td>IHC, dilution 1:800</td></tr><tr><td>anticorps anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>IHC, dilution 1:2 000</td></tr><tr><td>anticorps anti-BrdU</td><td>OBT0030G</td><td>Accurate Chemicals</td><td>IHC, dilution 1:2,000&nbsp ;</td></tr><tr><td>Fluoro-Jade C</td><td>FJ-C</td><td>HistoChem</td><td>Détermination de la mort cellulaire neuronale</td></tr><tr><td>Désinfectant D08AG02 Bétadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryomicrotome</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td>Préparation de coupes de cerveau Sel</td></tr><tr><td>d’héparine sodique</td><td>Perfusion Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Plaque circulaire en plastique dur (diamètre 120 cm)</td><td>en laboratoire</td><td>aucune</td><td>plaque pour SPS-BM, diamètre 120 cm</td></tr><tr><td>Désinfectant rapide Buraton&nbsp ;</td><td>Sch&uuml ; lke Mayr</td><td>113 911</td><td></td></tr><tr><td>désinfectant Système de vidéo-suivi TSE VideoMot 2 avec progiciel VideoMot2</td><td>TSE Systems</td><td>302050-SW-KIT</td><td>suivi et analyse du SPS-BM</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>perméabilisation/IHC</td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Reichert Jung/Leica</td><td>Frigomobil 1206</td><td>préparation de 40 &micro ; m brain slices</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Carl Roth</td><td>Art.-Nr. 0713</td><td>intégration des lames</td></tr><tr><td>SYTOX green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Coloration nucléaire Granulés</td></tr><tr><td>alimentaires (Kellog’s Froot Loops)</td><td>Kellog’s</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Prism, Version 3.0</td><td>Graph Pad Software, San Diego, USA</td><td></td><td>Évaluation statistique du logiciel SPS-BM</td></tr><tr><td>Zen 2008 ou Zen 2011</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Software (microscope confocal)</td></tr><tr><td>D.P.X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317616</td><td>support de montage pour la coloration au fluoro-jade C</td></tr></tbody></table>

des procédés pour la modulation et de l&#39;analyse de nf-kb-dépendante neurogenèse adulte

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

L&#39;hippocampe joue un rôle essentiel dans la formation et la consolidation de la mémoire épisodique, et dans l&#39;orientation spatiale. Historiquement, l&#39;hippocampe adulte a été considérée comme une région anatomique très statique du cerveau des mammifères. Cependant, des études récentes ont démontré que le gyrus denté de l&#39;hippocampe est une zone de très grande plasticité chez les adultes, impliquant non seulement les modifications de circuits neuronaux existants, mais aussi la neurogenèse adulte. Cette plasticité est régulée par des réseaux complexes de transcription, dans lequel le facteur de transcription NF-kB joue un rôle de premier plan. Pour étudier et de manipuler la neurogenèse adulte, un modèle de souris transgénique pour l&#39;inhibition neuronale spécifique du cerveau antérieur de l&#39;activité de NF-kB peut être utilisé. Dans cette étude, des méthodes sont décrites pour l&#39;analyse de la neurogenèse NF-kB-dépendante, y compris ses aspects structuraux, et l&#39;apoptose neuronale progénitrice, la prolifération et la signification cognitive, which a été spécifiquement évaluée par un gyrus denté (la DG) dépendant test de comportement, la répartition spatiale séparation Barnes labyrinthe (SPS-BM). Le protocole SPS-BM pourrait être simplement adaptée pour une utilisation avec d&#39;autres modèles animaux transgéniques destinés à évaluer l&#39;influence de certains gènes sur la neurogenèse hippocampique adulte. En outre, SPS-BM pourrait être utilisé dans d&#39;autres contextes expérimentaux visant à étudier et manipuler l&#39;apprentissage DG-dépendante, par exemple, l&#39;utilisation d&#39;agents pharmacologiques.

Le croisement des IkB / - lignées de souris transgéniques et tTA mène à l&#39;inhibition de l&#39;activité de NF conditionnel-kB dans l&#39;hippocampe. Pour étudier l&#39;expression de la IKBa-AA1-transgène dans la double transgénique souris (figure 1A), les cerveaux ont été isolés, cryosectioned et colorées en utilisant un anticorps contre la GFP (protéine fluorescente verte). La microscopie confocale à balayage laser a révélé une forte expression du transg...

Des méthodes pour la manipulation et l&#39;analyse des NF-kB-dépendante de l&#39;hippocampe de la neurogenèse adulte sont décrits. Un protocole détaillé est présenté pour un test de comportement gyrus denté-dépendant (appelé le modèle spatial séparation Barnes labyrinthe) pour l&#39;étude des résultats cognitifs chez la souris. Cette technique devrait également aider à permettre des enquêtes dans d&#39;autres contextes expérimentaux.

Des procédés pour la modulation et de l&#39;analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la fonction du facteur de transcription NF kappa B dans le cerveau adulte. Ceci est accompli en sélectionnant d’abord des souris transgéniques qui inhibent spécifiquement l’activité de NF kappa B dans les neurones. La deuxième étape de la procédure consiste à tester les conséquences comportementales de l’inhibition de NF kappa B en utilisant le motif spatial, la séparation ou les granges, le labyrinthe.La troisième étape est la profusion soigneuse des animaux, l’ablation de la cervelle et la section appropriée de celle-ci. La dernière étape consiste à analyser les effets histologiques et structurels, tels que la visualisation des projections de fibres moussues par immuno-marquage. En fin de compte, l’utilisation du test de comportement suivi de l’histologie peut corréler les changements dans l’apprentissage dépendant du gyrus denté avec les changements structurels dans les tissus associés.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme Mars Vase est que les liaisons de séparation spatiale MA offrent la possibilité de mesurer spécifiquement les processus d’apprentissage anti-dépendance à l’enfant a

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Une façon d'étudier l'intégration des nouveaux-nés des cellules granulaires denté chez les animaux adultes est décrite. Cette technique utilise un rétrovirus conçu pour étiqueter les nouveaux neurones, suivie par des enregistrements électrophysiologiques de déterminer à l'intégration fonctionnelle in vivo.

Etudier l&#39;intégration des adultes-né Neurones

La fonction des neurones de mammifères adultes-né reste une zone active de l'enquête. Rayonnements ionisants inhibe la naissance de nouveaux neurones. Utilisation de la tomographie par ordinateur guidée irradiation focale (CFIR), le ciblage anatomique tridimensionnelle des populations spécifiques progénitrices neurales peut maintenant être utilisée pour évaluer le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte.

Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

la migration des neuroblastes est une étape cruciale dans la neurogenèse postnatale. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour étudier le rôle des régulateurs candidats de la migration des neuroblastes en utilisant / petit ARN en épingle à cheveux d'ADN (shRNA) nucléofection et un test de migration 3D avec neuroblastes isolés du rongeur postnatale courant de migration rostrale.

Nucléofection de rongeurs Neuroblastes à étudier neuroblaste migrations<em&gt; In vitro</em

Cet article vidéo illustre un protocole complet permettant de détecter et de quantifier tous les stades de la neurogenèse de l’hippocampe adulte au sein d’une même section de tissu. Nous avons élaboré une méthode pour surmonter les limites de l’immunofluorescence multiple indirecte qui surviennent lorsque des anticorps appropriés de différentes espèces hôtes ne sont pas disponibles.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Nous décrivons un protocole d'immunohistochimie pour étudier le profil d'activation des neurones de l'hippocampe après exposition à une tâche spatiale d'apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d'origine neurologique du développement. Ce protocole peut être appliqué sur les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisée par des déficits cognitifs.

Visualisation immunohistochimique de l&#39;hippocampe Neuron Activité Après l&#39;apprentissage spatial dans un modèle de souris de troubles neurodéveloppementaux

Nous décrivons ici une procédure basée sur l’utilisation de particules lentivirales pour la modification génétique à long terme des cellules souches neurales et/ou de leurs cellules épendymaires adjacentes dans la niche neurogène ventriculaire-sous-ventriculaire adulte qui permet l’analyse séparée des effets autonomes et non autonomes des cellules dépendantes de la niche sur les cellules souches neurales.

Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l&#39;analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

Le but de ce protocole est de décrire une approche pour analyser le comportement des cellules neurales adultes de tige/progéniteur en réponse à la manipulation chimiogénétique d'un circuit neural local spécifique.

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La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Présenté ici est une méthode pour séquencer des noyaux uniques isolés du gyrus denté de la souris qui exclut la plupart des neurones par tri des noyaux activés par fluorescence (FAN). Cette approche génère des profils d’expression de haute qualité et facilite l’étude de la plupart des autres types de cellules représentées dans la niche, y compris les populations rares telles que les cellules souches neurales.

Tri négatif des neurones par noyaux activés par fluorescence combiné au séquençage de l’ARN à noyau unique pour étudier la niche neurogène de l’hippocampe

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Isolement, expansion et nucléofection de cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire murine adulte

Les tests de croissance des neurites fournissent une valeur quantitative sur les processus neuronaux régénératifs. L’avantage de ce logiciel semi-automatique est qu’il segmente les corps cellulaires et les neurites séparément en créant un masque et mesure divers paramètres tels que la longueur des neurites, le nombre de points de branchement, la surface des grappes de corps cellulaires et le nombre de grappes de cellules.

Standardisation d’un nouveau logiciel semi-automatique pour la mesure de l’excroissance des neurites 

Découvrez des méthodes pour moduler et analyser la neurogenèse adulte dépendante de NF-κB chez la souris. Ce protocole utilise le test comportemental Barnes maze et l'analyse histologique pour étudier les fonctions cognitives.

Des procédés pour la modulation et de l'analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

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