Name: Un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Découvrez un modèle orthotopique de cancer de la prostate humain chez la souris athymique pour quantifier la taille tumorale, les cellules tumorales circulantes et les métastases pulmonaires. Cette méthode permet d'étudier la progression métastatique et d'évaluer des thérapeutiques.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) à RCB, CA122985 et de la prostate SPORE CA90386, et à JMP, NIH T32 AG000260 &quot;Drug Discovery formation sur les troubles liés à l&#39;âge&quot;, et par Walter S. Et Lucienne programme d&#39;études supérieures en sciences de la vie Driskill à l&#39;Université Northwestern. Nous tenons également à remercier le phénotypage de souris et histologie laboratoire et des installations de base pathologie à l&#39;Université Northwestern.

Pour toutes les procédures impliquant des animaux, des protocoles ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) à l&#39;Université Northwestern. Les techniques chirurgicales et les conditions de protection des animaux ont été observés par le personnel vétérinaire et modifiées pour minimiser le stress ou la mortalité animale. Des institutions individuelles ont des exigences différentes et il est important de travailler avec IACUC et animale personnel lors de l&#39;élaboration et de l&#39;exécution de cette technique chirurgicale. Une. Préparation des cellules pour Injection <ol><li> Cette étape doit être effectuée le plus près possible de commencer à des interventions chirurgicales. Trypsiniser cellules utilisées pour l&#39;expérience, retirer de la plaque, et neutralisent avec les médias. La lignée cellulaire PC3-M humaine CaP transfectées de façon stable avec la GFP a été utilisé avec succès pour ces expériences, en raison de conditions de croissance rapide des cellules PC3-M. GFP a été ajouté pour faciliter supplémentaire de détection de la métastase pulmonaire dans des échantillons de tissus pulmonaires, et la détermination rapide deles cellules cancéreuses par rapport aux cellules immunitaires dans des cultures obtenues à partir de sang et de moelle osseuse pour identifier des cellules tumorales circulantes. Si la modification d&#39;un gène spécifique d&#39;intérêt, puis la création de lignées cellulaires stables avec cette modification génique est effectuée en premier, suivie par la transfection avec la GFP. Si GFP va modifier la fonction de ce gène d&#39;intérêt, la GFP peut être omise. Cela rendra la détection de métastases pulmonaires plus difficile, mais réalisable. En outre, si l&#39;on utilise la technologie d&#39;imagerie spécifique en utilisant des marqueurs fluorescents, tels que la luciférase basé IVIS-, d&#39;autres protéines fluorescentes peuvent être utilisées à la place. </li><li> Centrifugeuse pendant 5 min à 225 x g. </li><li> Isoler 2,5 x 10 5 cellules et centrifuger pendant 5 min à 225 x g. </li><li> Retirer le surnageant et remettre les cellules dans 20 ul de solution saline stérile. </li><li> Aspirer la suspension cellulaire dans une seringue de 0,5 ml avec un permanent 28 ½ aiguille G (recommandé: Kendall Monojet, que d&#39;autres marques ont causé des problèmes), en veillant à l&#39;air ne pénètre dans l&#39;al aiguilleong avec la suspension. </li><li> Envelopper dans une feuille seringue stérile et stocker sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Implantation orthotopique de cellules cancer de la prostate humaine <ol><li> 6-8 semaines c souris mâles Balb / thymoprives sont utilisés. Le poids idéal du corps de la souris pour la chirurgie est 19-21 g, et la souris devrait être autorisé à augmenter à au moins 18 g avant la chirurgie. Les petits animaux sont techniquement plus difficiles à opérer. Les plus gros animaux ont tendance à connaître une cinétique plus lente de la croissance tumorale et les métastases. Les animaux doivent être logés dans l&#39;animalerie au moins une semaine avant l&#39;intervention chirurgicale pour minimiser le stress de l&#39;animal. En fonction de la conception expérimentale, le traitement médicamenteux peut commencer une semaine avant l&#39;intervention chirurgicale. </li><li> Injecter des médicaments de la douleur préopératoire selon les instructions de l&#39;animalerie. 0,1 mg / kg de poids corporel Buprenex sous-cutanée en utilisant une aiguille de 30 G ½ attachée à une seringue de 1 ml est suggéré. </li><li> Placer les animaux dans la chambre de l&#39;isoflurane et attendre jusqu&#39;à ce que les animaux sont pleinement unenesthetized. Pas orteil réflexe du tonus musculaire devrait être présent à ce point. Cette méthode est recommandée, mais s&#39;il n&#39;est pas disponible, d&#39;autres méthodes d&#39;anesthésie peut être utilisé selon les instructions de l&#39;animalerie. </li><li> Déplacer l&#39;animal hors de la chambre d&#39;isoflurane dans une procédure hotte stérile. Placez l&#39;animal dans l&#39;appareil de cône de nez, et ré-veiller à ce que l&#39;animal est sous anesthésie complète avant de poursuivre. </li><li> Désinfecter la région Basse-abdominale avec un gommage de Betadine avec des boules de coton stérile, essuyer avec tampon imbibé d&#39;alcool, et de pulvérisation finale avec une solution de Betadine. Laisser sécher. </li><li> L&#39;aide d&#39;un scalpel stérile ou des ciseaux chirurgicaux stériles aiguisés, une faible incision abdominale médiane d&#39;environ 3-4 mm est faite. Soulevez doucement la vessie à l&#39;aide des pinces et identifier le lobe ventral de la prostate. Ces deux lobes sont situés directement en dessous de la vessie. Certaines souris ont une petite couche de graisse qui couvre la prostate qui peut être légèrement déplacé de côté à l&#39;aide d&#39;un coton-tige stérile. Minimisante tous les mouvements d&#39;organes et la musculature si possible. </li><li> Injecter 20 de la solution de volume de cellule ul dans la glande de la prostate, en minimisant les fuites et assurer une petite bulle n&#39;est observée. </li><li> Remplacer la vessie et fermer la couche musculaire en utilisant 4,0 résorbables sutures Vicryl monofilament dans un motif interrompu simple. </li><li> Fermez la couche de peau à l&#39;aide d&#39;agrafes stériles 9 mm. </li><li> Retirer l&#39;animal du isoflurane et surveiller jusqu&#39;à éveillé et déplacer normalement. Placez le coussin chauffant pendant la période de récupération. </li><li> Si de multiples interventions chirurgicales sont effectuées entre les cabinets, tous les outils propres à 70% d&#39;éthanol, et stériliser à l&#39;aide d&#39;un stérilisateur à billes de verre. Laisser refroidir complètement les outils avant animal suivant. Ne pas réutiliser des sutures, des boules de coton ou un écouvillon stérile. </li></ol> 3. Animaux de surveillance <ol><li> Administrer des médicaments de la douleur sur la base des instructions de l&#39;animalerie. 4 heures après la chirurgie administration d&#39;une dose de méloxicam sous-cutanée à 1 mg / kg de poids corporel uchanter une aiguille 30 G ½ attachée à une seringue de 1 ml est suggéré, suivie d&#39;une dose supplémentaire chaque 12-24 h pour les 48 heures suivantes. </li><li> Staples peuvent être enlevés d&#39;animaux 7-10 jours post-chirurgie, une fois la plaie est cicatrisée. </li><li> Surveiller le poids des animaux, la consommation alimentaire, et palper souris pour les tumeurs deux fois par semaine jusqu&#39;à la fin de l&#39;expérience. Augmenter la fréquence à chaque autre jour lorsque les tumeurs deviennent visibles pour vérifier pour les animaux sous la charge tumorale importante ou la contrainte. Une mort prématurée de ce modèle est dû à la grande charge de la tumeur primaire, comme les tumeurs primaires peuvent bloquer le débit urinaire, si les animaux avec une perte de plus de 15% du poids corporel ou une tumeur primaire atteignant un diamètre de 1,5 cm doit être autopsié immédiatement empêcher l&#39;obstruction urinaire et de la mort des animaux. </li><li> Surveillance de nécessité pour l&#39;enrichissement supplémentaire de l&#39;environnement des animaux. Le stress de la chirurgie augmente les luttes intestines des animaux. L&#39;ajout de deux cabanes en plastique par cage au lieu d&#39;un et un comportement supplémentaireenrichissement al peut diminuer ces incidents. Discutez avec les options du personnel vétérinaire disponibles à l&#39;installation, les animaux sont logés à. Compte tenu de l&#39;absence de cils sur cette souche de souris, des huttes et enrichissement en papier ne sont pas recommandés car ils peuvent irriter les yeux. </li></ol> 4. Procédures d&#39;autopsie <ol><li> Après 4-6 semaines, les tumeurs sont tout à fait évident et les animaux commencent à perdre du poids en raison de la charge tumorale accrue. Les tumeurs peuvent généralement être palpés et / ou sont visuellement apparente. L&#39;autopsie doit être effectuée à ce stade. Effectuez une injection intrapéritonéale de Nembutal à 260 mg / kg de poids corporel en utilisant une aiguille de calibre 30 ½ fixé à une seringue de 1 ml, et laisser les animaux deviennent totalement inconscient, sans réflexe de l&#39;orteil ou le tonus musculaire présente. </li><li> Une fois que l&#39;animal est anesthésié, l&#39;aide de ciseaux chirurgicaux stériles ou d&#39;un scalpel, découper horizontalement en travers du torse de l&#39;animal, directement sous la cage thoracique, puis verticalement à l&#39;aisselle le long du côté de l&#39;animal, Exposer le coeur. Effectuer une ponction cardiaque terminal en utilisant une aiguille de 30 G ½ attachée à une seringue de 1 ml rincé avec du citrate de sodium à 4% dans du DPBS pour empêcher la coagulation, l&#39;obtention d&#39;autant de sang que possible à partir de l&#39;animal. </li><li> Retirer les poumons de l&#39;animal en coupant la trachée avec des ciseaux chirurgicaux ou un scalpel et placer immédiatement dans une cassette de culture de tissu et dans 10% de formaline. </li><li> Enlever la tumeur primaire de la prostate à partir de l&#39;animal en coupant individuellement des vaisseaux sanguins attachés à la tumeur et d&#39;assurer pas d&#39;organes supplémentaires tels que les deferens de vas ou vésicules séminales sont attachés. </li><li> Noter le poids et la taille de la tumeur. Mesurer le poids de la tumeur en grammes à l&#39;échelle du laboratoire. Utilisation des étriers, de mesurer la longueur du plus long diamètre de la tumeur en centimètres, et l&#39;axe perpendiculaire correspondante. Multipliez ces valeurs pour obtenir la taille de la tumeur. Selon l&#39;utilisation prévue, casser immédiatement gel dans de l&#39;azote, et / ou le lieu de liquide danspour une cassette de tissus dans de la formaline à 10%. </li><li> Exposer la hanche et du genou avec des ciseaux chirurgicaux ou d&#39;un scalpel et d&#39;articulations déconnexion, en prenant soin de garder le fémur intact. Retirez les fémurs de l&#39;animal et le placer dans une solution saline stérile. </li><li> Obtenir d&#39;autres organes ou de matières d&#39;intérêt, et disposer de l&#39;animal selon les instructions de votre institut. En particulier, les ganglions lymphatiques régionaux ont tendance à avoir des métastases, ont tendance à être élargie si les héberger, et peuvent être récoltés. Cependant, il faut veiller à ce que peut être affectée par des variations de la pression hydrostatique provoquée par la procédure chirurgicale. </li></ol> 5. Traitement et Immunocoloration des échantillons de tissus pulmonaires <ol><li> 24-48 h de placer le tissu dans du formol 10% dans du PBS, incorporer les poumons dans la paraffine. </li><li> Section des poumons à 45 sections um d&#39;étape, prenant sections pulmonaires des tissus adjacents 2-3 4 pm. </li><li> Si les cellules GFP-positives ont été utilisés (recommandé), effectuer immunomarquagepour la GFP. Si non, effectuer Hematoxylin standard et l&#39;éosine (H &amp; E) coloration. </li></ol> REMARQUE: Le kit Dako Envision + combinée avec l&#39;anticorps de la GFP de Invitrogen a été utilisé avec succès selon les instructions du fabricant, mais cela peut être modifié à toute procédure d&#39;immunohistochimie. <ol start="4"><li> Note métastases en aveugle. Si GFP-positives, les cellules tumorales peuvent tacher brun en plus d&#39;avoir de grandes et distinctifs noyaux. Lors de la première métastase de notation, consulter un médecin afin de s&#39;assurer correct notation, et utiliser le tissu pulmonaire teinté H &amp; E pour confirmer la présence de cellules tumorales, et non infiltrant les cellules immunitaires. </li></ol> 6. Identification des cellules tumorales circulantes de sang et de moelle osseuse <ol><li> Ajouter tout le sang collecté à partir de la nécropsie à un tube à centrifuger de 1,5 ml. Centrifugeuse 5 min à 800 x g. </li><li> Retirez le plasma et ajouter 1 ml de tampon de lyse ACK (154,95 mM de chlorure d&#39;ammonium, 9,99 mM de potassium bicarbonateNate, mM EDTA 0,0995). Laisser le sang reposer à la température ambiante 3-5 min. </li><li> Centrifugeuse 5 min à 800 x g. </li><li> Eliminer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de culture cellulaire contenant des antibiotiques. Ajouter des cellules à un flacon T75 contenant 9 ml de milieu de culture cellulaire. </li><li> des cellules de culture à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 pendant 10 jours, la vérification de la présence de CTC tous les 2-3 jours. </li><li> Pour la moelle osseuse, enlever tout le tissu musculaire de fémurs aide d&#39;une paire de ciseaux, une lame de rasoir ou un scalpel. Retirer les extrémités de l&#39;os, au plus près des extrémités que possible. </li><li> En utilisant une aiguille 23 G ¾, éjectez doucement la moelle osseuse du fémur dans un tube de 1,5 ml de la centrifugeuse. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu de culture cellulaire et délicatement la pipette et mélanger. </li><li> Ajouter des cellules à un flacon T75 contenant 9 ml de milieu de culture cellulaire. </li></ol> 7. Caractérisation moléculaire de tumeurs <ol><li> Par réaction de polymérisation en chaîne (PCR)s, des échantillons de tumeurs qui étaient pression congelés dans de l&#39;azote liquide sont d&#39;abord pulvérisés sur glace sèche et ensuite homogénéisés à l&#39;aide d&#39;un homogénéiseur de tissus pour 3-5 min avec 1 ml TRIzol. TRIzol extraction est effectuée selon les instructions du fabricant. Purifier l&#39;ARN en utilisant le kit d&#39;isolement d&#39;ARN RNeasy, selon les instructions du fabricant. Effectuer une synthèse d&#39;ADNc et la PCR quantitative en temps réel (qRT / PCR) en utilisant les réactifs TaqMan selon les instructions du fabricant est recommandé, mais peut être modifiée pour n&#39;importe quelle méthode PCR actuellement employé. </li><li> Pour les dosages Western blot, homogénéiser les tissus en utilisant un homogénéisateur de tissu à 3-5 min avec 1 ml de tampon de lyse: PBS (137 mM NaCl, 10 mM de phosphate de Na, mM KCl 2,7), 0,5% de Triton X-100, 1 mM EDTA, pyrophosphate de sodium à 2,5 mM, 1 mM de β-glycérophosphate, avec addition d&#39;un cocktail inhibiteur de protease, inhibiteurs de phosphate cocktails 2 et 3, le fluorure de sodium 10 mM et orthovanadate de sodium à 1 mM. Le mélange de lysat cellulaire est placée dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. </li><li> Centmélange de lysat cellulaire rifuge pendant 10 min à 13 000 x g. </li><li> Retirer le surnageant et le placer dans un nouveau tube de 1,5 ml de centrifugeuse et de nouveau centrifugé pendant 10 min à 13 000 x g. Si des débris de cellules est encore présent, une étape de centrifugation supplémentaire peut être effectuée. </li><li> Retirer le surnageant et effectuer un Western blot selon les conditions normales de laboratoire. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Dans cet article, nous proposons un nouveau modèle murin de métastases cancer de la prostate humaine. Dans ce modèle, le cancer de la prostate lignées de cellules PC3-M humaine est orthotopique implanté directement dans la prostate de souris Balb c thymoprives / et des tumeurs a permis de développer pendant 4-6 semaines. Dans la section des résultats représentatifs, nous montrons des exemples de données qui peuvent être collectées, y compris le poids de la souris et de la consommation alimentaire, la taille de la tumeur et le poids, les caractéristiques moléculaires de la tumeur, et la formation de métastases distincte au poumon. En outre, une grande variété de sorties supplémentaires peut être étudiée en fonction des intérêts particuliers de recherche. Un exemple en est la présence de CTC dans le sang et la moelle osseuse. Comme CTC sont un événement relativement rare (nous observons CTC dans environ 5-20% des animaux de contrôle), nous n&#39;avons pas été surpris qu&#39;aucun des cinq souris dans ces expériences développé CTC. Notre laboratoire a également utilisé ce modèle pour déterminer les changements dans l&#39;adhésion cellulaire par mesure de la morphologie nucléaire de cellules dans l&#39;tissu de la prostate 10. Nous avons également utilisé ce modèle pour évaluer l&#39;état de prolifération et de l&#39;apoptose de la tumeur primaire en utilisant Ki67 et coloration TUNEL de la tumeur de la prostate 14. En plus de la grande variété de sorties de données qui peuvent être obtenues, ce modèle peut être utilisé pour déterminer les effets des deux modifications de l&#39;expression de la protéine ainsi que des petites molécules thérapeutiques. Par rapport à de nombreux modèles spontanés et provoqués des métastases cancer de la prostate humain, il ya un délai d&#39;exécution plus élevé de seulement 4-6 semaines. D&#39;autres modèles avec un délai d&#39;exécution de haut, comme veine de la queue ou les modèles d&#39;injection intercardiac, ont des limites de non tumeur primaire, donc pas entièrement récapitulant la clinique cascade métastatique. Dans notre modèle, les cellules tumorales doivent échapper le principal site d&#39;origine, entrez et survivre le système circulatoire, et implanter dans un site secondaire. Ceci permet d&#39;obtenir des étapes supplémentaires au cours de laquelle une intervention thérapeutique ou d&#39;un changement dans l&#39;expression des protéines peuvent fournir un effet. Addilement, la présence de la tumeur primaire doit permettre une application facile de ce modèle aux nouvelles technologies d&#39;imagerie comme la base de la luciférase-SIIV 16-17. Malgré la grande diversité des avantages de ce modèle, il existe aussi plusieurs limites à prendre en considération. Un nombre croissant d&#39;études montrent l&#39;importance du système immunitaire dans le micro-environnement de la tumeur et le développement de métastases 18. Dans ce modèle, du fait de l&#39;utilisation d&#39;un rongeur athymiques, la capacité d&#39;évaluer les effets du système immunitaire n&#39;est pas possible. Une deuxième limite est le manque de réactivité des androgènes dans les cellules PC3-M. Lors du diagnostic initial de cancer de la prostate, les patients seront souvent suivre une thérapie androgènes comme traitement de première ligne. Cependant, les patients finiront par devenir androgènes résistant et tumeurs vont commencer à croître à nouveau. Comme les cellules PC3-M n&#39;ont pas le récepteur aux androgènes, ce modèle ne mesure que les effets du traitement de la toxicomanie ou de la protéine de modulation de post-androgène c résistanteancer. Bien que ce soit une limitation, androgéno-sensibles cancer de la prostate est actuellement bien maniable et a une variété d&#39;options de traitement efficaces, et donc le cancer androgéno-résistant est devenu plus visible étudié. Ce modèle utilise également spécifiquement une souche pure de souris, ce qui minimise la souris à la variabilité de la souris. Cependant, cette souche peut être particulièrement sensible aux protéines particulières ou de petites molécules, les soins doivent donc être prises lors de l&#39;extrapolation de ces données à la clinique. Bien que ce modèle fournit une mesure efficace de l&#39;efficacité des médicaments dans un délai d&#39;exécution rapide de 4-6 semaines, cela peut ne pas prendre en considération les effets des médicaments de dosage à long terme. Après une exposition prolongée à de nombreux traitements actuellement disponibles, les patients peuvent retourner à des cancers résistants aux médicaments de nombreuses années après le traitement. La rotation rapide de cette technique ne permet pas une modélisation efficace de la capacité d&#39;une tumeur à acquérir une résistance à un traitement. Cependant, avec la modulation de cette exrience, les cellules cancéreuses prostatiques humaines résistantes aux traitements peuvent être implantés, et l&#39;efficacité d&#39;une thérapeutique de deuxième génération dans la prévention de la croissance tumorale et la métastase PCa peuvent être modélisés. En outre, si un groupe a tenté d&#39;étudier les changements moléculaires dans une tumeur primaire dans le temps, un modèle plus long terme telles que le modèle TRAMP sera probablement plus efficace pour ces études. Une autre limitation de ce modèle est la dissémination de métastases distinct seulement pour les ganglions lymphatiques et les poumons des animaux. Ces deux sites sont des sites fréquents et cliniquement pertinentes de métastases, comme l&#39;a démontré par des études d&#39;autopsie chaudes humains 19. Cependant, cliniquement métastase osseuse constitue une caractéristique importante de cancer de la prostate humain, et donc des modèles récapitulant ce sont d&#39;intérêt. Malheureusement, ceux-ci sont difficiles à résumer dans un modèle de souris, avec très peu de modèles montrant des métastases osseuses sans queue veine, injection intercardial, ou implantation directe dansà l&#39;os 20. Ainsi, si le ciblage de l&#39;os est la clé importance expérimentale, un autre modèle peut être plus efficace. Toutefois, ce modèle ne donne une mesure de la circulation de l&#39;os sous la forme de la moelle osseuse de cellules tumorales circulantes. Malgré ces limites, cette technique est un puissant modèle de cancer de la prostate humaine. La capacité de mesurer les effets à la fois sur la tumeur primaire ainsi que la formation métastatique dans un court délai offre une grande variété d&#39;applications. Dans ce modèle, les cellules doivent échapper à l&#39;organe principal, entrer et de survivre dans le sang, et l&#39;implant dans un site secondaire, récapitulant le processus chez les humains. La mesure supplémentaire de caractéristiques moléculaires de la tumeur primaire, les changements dans la morphologie des cellules, et la présence de cellules tumorales circulantes fournit une large souffle de l&#39;information d&#39;un modèle. Cette procédure peut être utilisée à la fois dans le contexte de la découverte de médicaments ainsi que pour étudier les changements dans la biologie tumorale.

Cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes, et la deuxième cause de décès par cancer aux États-Unis 1. La mort de PCa n&#39;est pas due à la formation de la tumeur primaire, mais plutôt la formation de métastases. Par conséquent, la prévention de métastases chez les patients est d&#39;une grande importance. Des modèles murins de cancer de la prostate offrent une diversité d&#39;options pour découvrir l&#39;information biologique critique sur cette maladie. Une variété de modèles de souris de cancer de la prostate existent, chacune avec des avantages et des limites inhérentes. Bien que la fréquence de cancer de la prostate chez l&#39;homme est élevé, naturellement cancer de la prostate est extrêmement rare chez les souris 2, malgré l&#39;égalité de sensibilité de souris global de cancer 3. Une exception de rongeur est le développement de cancer de la prostate chez les rats Wistar Lobund, qui peut atteindre des taux de cancer de la prostate de 90% en 12 mois par induction de méthylnitrosourée et testostérone 4. Pour cette raison, induit des systèmes modèles, comme le clochard(Adénocarcinome de la prostate transgénique souris) modèle sont couramment utilisés. Le modèle TRAMP peut induire l&#39;expression du transgène spécifiquement dans la prostate, et subit la progression normale du cancer de la prostate, de l&#39;hyperplasie de néoplasie intra-épithéliale prostatique (PIN) à lymphatique et la métastase pulmonaire 5-6. Ces modèles fournissent des avantages d&#39;être capable de mesurer la totalité de la progression tumorale, ainsi que contenir un système immunitaire intact. Cependant, les événements moléculaires qui sous-tendent le développement CaP peuvent différer entre les souris et les humains, et les corrélations entre les souris et les études cliniques humaines ont montré la variabilité. En outre, ces deux modèles sont de temps, par exemple, le modèle TRAMP nécessite environ 28 semaines, afin de développer des métastases. En étudiant les métastases, souvent un ventricule modèle d&#39;injection queue veine ou gauche est utilisé. Ce modèle bénéficie de temps de réponse rapide, et peut en outre mesurer la présence de metastas osseusesest en utilisant des lignes et des conditions spécifiques de cellules. Yang et al. Ont rapporté que l&#39;injection sous-cutanée de cellules PC3 GFP-positives largement diffusées peut provoquer des métastases osseuses 7, et la veine caudale et les injections intercardiac ont également généré le développement de la métastase osseuse 8-9. Les principales limites de ces modèles sont liés à l&#39;absence d&#39;une tumeur primaire qui réside à l&#39;intérieur de la glande de la prostate lui-même. En outre, pour les modèles Reliant lors de l&#39;injection des cellules cancéreuses dans la circulation, ce contourne toute la première moitié de la cascade métastatique. Il empêche ainsi l&#39;examen des premières étapes, y compris l&#39;invasion par l&#39;organe principal, qui sont biologiquement mesures cruciales de transformation métastatique. De nombreux organismes de réglementation de la transformation métastatique affectent directement l&#39;invasion des cellules tôt. Les premières étapes de la cascade métastatique constituent des sites hautement prioritaires pour le ciblage thérapeutique, car une fois que les cellules cancéreuses diffusent variation clonale augmente considérablement, ce qui accroît biologiquediversité et al diminuer ciblage thérapeutique efficace. Dans une tentative de répondre à bon nombre des limites de ces modèles, notre laboratoire a développé un modèle orthotopique de cancer de la prostate humaine dans laquelle la lignée cellulaire cancer de la prostate PC3-M humaine est directement implanté dans la prostate de souris BALB / c athymiques. Après 4-6 semaines, la taille des tumeurs, la présence de cellules tumorales circulantes (CTC), et des métastases dans les poumons et les ganglions lymphatiques peuvent tous être quantifiés. Nous avons effectivement utilisé ce modèle pour évaluer l&#39;efficacité de la 4 &#39;,5,7-trihydroxyisoflavone (génistéine) pour inhiber la métastase humain PCa 10. La consommation alimentaire de la génistéine a été liée à la diminution de la prostate métastatique de cancer et de décès 11-12, mais auparavant, aucune étude n&#39;avait déterminer si l&#39;administration de la génistéine pourrait modifier cancer de la prostate métastatique chez les animaux ou les hommes. Dans cette étude, nous avons démontré que le traitement avec la génistéine a considérablement réduit le nombre de métastases pulmonaires. De plus, nous avons déterminé la génistéine altation de l&#39;activation et l&#39;expression de plusieurs protéines pro-métastatiques représentées dans la tumeur primaire, y compris la kinase d&#39;adhésion focale (FAK), la protéine kinase p38 activée par le mitogène (MAPK p38), et de protéine de choc thermique 27 (HSP27). Ces résultats correspondent aux observations de la clinique. Utilisation de sang obtenu à partir de la souris, nous avons pu mesurer avec précision les concentrations sanguines de la génistéine et observé ceux-ci soient semblables aux niveaux chez l&#39;homme avec la consommation alimentaire régulière de la génistéine. En outre, une étude de phase II réalisée par notre groupe a déterminé que lors du traitement avec la génistéine, les hommes diminue rencontrées dans l&#39;ARNm de la prostate de l&#39;expression tissulaire de gènes associés à l&#39;invasion cellulaire et la métastase, la matrice métalloprotéinase spécifique de type 2 (MMP-2) 13. Nous avons également utilisé ce modèle pour évaluer l&#39;effet de l&#39;expression altérée du gène produit dans la tumeur primaire sur les métastases cancer de la prostate humaine 14. Le suppr de tumeuressor endogline est un membre de la superfamille TGFß et supprime l&#39;invasion cellulaire humaine in vitro via PCa altération de signalisation Smad 15. Nous avons étendu ces études pour déterminer l&#39;effet de endoglin sur les métastases cancer de la prostate humaine. Stable knockdown de l&#39;endogline, le contrôle de vecteur ou de l&#39;endogline sur des lignées de cellules d&#39;expression ont été implantées dans des souris. cellules knockdown de l&#39;endogline montré le plus grand nombre de métastases du poumon, ainsi que les CTC dans 38% des souris. Souris implantées avec le vecteur de contrôle ont montré une réponse moyen, avec moins de métastases pulmonaires par souris, et CTC dans seulement 18% des souris. Souris haut endoglin implantés ont montré une élimination presque complète des métastases pulmonaires, et la suppression complète des CTC. Ce ne sont que deux exemples de la grande variété d&#39;applications de cette technique a. De la découverte de médicaments, à des changements de la modélisation de la biologie moléculaire, ce modèle offre une méthode d&#39;évaluation des effets de diverses fonctions sur la croissance tumorale et la taupe à haut débitchangements vasculaires, la présence de CTC et de formation de métastases dans les ganglions distincte du poumon et les ganglions lymphatiques.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr>1 <tr><td>ml Seringue, tuberculine, Slip-Tip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>23 g 3/4 Precison Glide Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305143</td><td></td></tr><tr><td>30 g 1/2 Precision Glide Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes imbibées d’alcool</td><td>Triad</td><td>10-3001</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Applicateur, 9mm, Acier inoxydable</td><td>Becton Dickinson</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Clips, 9mm</td><td>VWR</td><td>15431-673</td><td></td></tr><tr><td>Convertors Polyline Towel (Stérile)</td><td>Cardinal Health</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs à pointe de coton, 6 pouces, Stérile, Arbre en bois</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Curad Boules de coton stériles</td><td>VWR</td><td>500043-544</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille Drf, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4")</td><td>VWR</td><td>95039-192</td><td></td></tr><tr><td>Duraprene SMT Gants chirurgicaux stériles en néoprène non poudrés</td><td>Cardinal Health</td><td>2D72PN70</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Cell Point Scientific</td><td>SN 7030</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles Kendall Monojet, seringue 1/2 cc avec aiguille permanente 28 G 1/2</td><td>Tyco</td><td>1180528012</td><td></td></tr><tr><td>Medium Heating Pad </td><td>VWR</td><td>100229-094</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris Merit, Sklar, 11,4 cm (4 1/2 »)</td><td>VWR</td><td>94000-000</td><td></td></tr><tr><td>Métrique/Anglais Vernier Caliper</td><td>VWR</td><td>19155-057</td><td></td></tr><tr><td>PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27"</td><td>Ethicon</td><td>Z304H</td><td></td></tr><tr><td>VetEquip Système d’anesthésie</td><td></td><td></td> par inhalation <td>Contactez votre animalerie pour connaître la disponibilité</td></tr><tr><td>VWR Premium Tissue Cassettes VWR</td><td></td><td>18000-010</td><td></td></tr><tr><td>VWR Pince à échantillons, dentelée, droite, 114 mm (4 1/2 »)</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Betadine Surgical Scrub</td><td>Fisher Healthcare</td><td>19-027132</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex</td><td></td><td></td><td>Controlled Substance - Obtenir d’un établissement</td></tr> <tr><td>pour animauxDako DAB + Chromagen</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision + Système HRP Marqué Polymère, Anti-Lapin</td><td>Dako</td><td>K4003</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Kit Bloc Protéique</td><td>Dako</td><td>X0909</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>VWR</td><td>95042-908</td><td></td></tr><tr><td>GFP Anticorps</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline</td><td>Mayer</td><td>MH580-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Meloxican</td><td></td><td></td><td>Obtenir de l’animalerie</td></tr><tr><td>Nembutal</td><td></td><td></td><td>Substance contrôlée - Obtenir de l’animalerie</td></tr><tr><td>Rneasy Kit d’isolement de l’ARN</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td></td><td></td> stérile <td>Obtenir de l’animalerie</td></tr><tr><td>Taqman Réactifs de transcription inverse</td><td>Life Technologies</td><td>N8080234</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>10296</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Notre laboratoire a développé un nouveau modèle d&#39;implantation orthotopique de cancer de la prostate humaine (cancer de la prostate). Comme PCa mort n&#39;est pas dû à la tumeur primaire, mais plutôt la formation de métastases distinct, l&#39;aptitude à modéliser efficacement cette progression pré-clinique est de grande valeur. Dans ce modèle, les cellules sont directement implantés dans le lobe ventral de la prostate chez les souris Balb / c athymiques, et on les laisse évoluer pendant 4-6 semaines. A la terminaison de l&#39;expérience, plusieurs points de terminaison distincts peuvent être mesurés, tels que la taille et la caractérisation moléculaire de la tumeur primaire, la présence et la quantification de cellules tumorales circulantes dans le sang et la moelle osseuse, et la formation de métastases dans les poumons. En plus d&#39;une variété de paramètres, ce modèle offre une image d&#39;une capacité des cellules à envahir et échapper à l&#39;organe principal, entrez et survivre dans le système circulatoire, et l&#39;implant et de grandir dans un site secondaire. Ce modèle a été utilisé efficacement pour mesurer métastatiqueréponse à la fois des changements dans l&#39;expression des protéines ainsi que de la réponse à petites molécules thérapeutiques, en un temps de traitement court.

Pour cette expérience, on montre un groupe représentatif de souris obtenus au cours de ces interventions chirurgicales. Cinq souris ont été implantées avec des cellules PC3-M GFP-positives contenant un vecteur de commande. Les tumeurs ont été laissées en croissance pendant six semaines, puis plusieurs paramètres ont été évalués. Sur les figures 1A et 1B, on montre la variation de poids corporel et la consommation alimentaire des souris, respectivement. Il ya un petit plongeon dans le poids corporel et la consommation alimentaire autour de la date de la chirurgie en raison de l&#39;anesthésie. Pendant le cours de l&#39;expérience, le poids corporel augmente lentement après la chirurgie, puis commence à diminuer vers la fin de l&#39;expérience en tant que charge de la tumeur atteint un niveau critique. Ceci est compensé par la consommation de nourriture chez ces souris. Sur les figures 2A et 2B, les dimensions des tumeurs représentatifs obtenus sont présentés. Tailles tumorales individuelles varient, mais en moyenne, nous atteignons des tumeurs d&#39;environ 1 gramme, avecvariance normale entre 0,5 à 1,5 g, et une taille de la tumeur de 1 cm 2, avec un écart normal de 0,5 à 1,5 cm 2. Bien que la taille des tumeurs est variable, celles-ci ne sont pas en corrélation avec le nombre de métastases résultante, représentée à la fois dans le présent document et les travaux précédemment publiés 10. Cependant, à partir de ce modèle, on peut déterminer l&#39;effet d&#39;un traitement médicamenteux ou modifications moléculaires sur le poids de la tumeur et de la taille. Une considération importante dans ce modèle est approprié lorsque le point de terminaison de l&#39;expérience est. Dans les figures 2C et 2D, nous montrons les changements de poids de la tumeur et la taille de la tumeur dans une ligne de cellules PC3-M particulier transfectées de façon stable avec la GFP et un vecteur de commande à 4 semaines et à 6 semaines. Dans les deux dernières semaines, le poids moyen de la tumeur a augmenté de 2,7 fois, et la taille de la tumeur de 1,9 fois. Cela montre l&#39;ajout de 1-2 semaines supplémentaires sur l&#39;expérience peut considérablement influencer les résultats. Comme un grand nombre de facteurs peuvent modifier la croissance des tumeurs, y comprisl&#39;âge et la taille de la souris, le nombre de passages des cellules, etc, nous recommandons de ne pas mettre fin expériences jusqu&#39;à ce que les tumeurs visibles sont observées dans la majorité des souris. Sur les figures 3A à 3C, le nombre de métastases est quantifiée de trois manières différentes. Sur la figure 3A, le nombre total de cellules humaines PCa GFP-positives sont représentés. Sur la figure 3B, le nombre de locus de la cellule, ou des endroits où les dépôts métastatiques sont présents, est représenté. Enfin, sur la figure 3C, le nombre de métastases distinct, tel qu&#39;il est défini par un groupe clairement lié de cellules montrant cinq ou plus de cellules humaines PCa GFP-positives, est affiché. Images représentatifs de ces différentes conditions sont présentés dans les Figures 4A-4D. Sur la figure 4A, une cellule individuelle à 40x amplitude est mis en évidence par une flèche. Notez la coloration brun et grands noyaux distincts. Une section de poumon adjacent colorées à l&#39;aide coloration H &amp; Eest représenté sur la figure 4B, confirmant que sans GFP, la détection de cellules cancéreuses est toujours aisément réalisables. Cette photo est prise à 40x ampleur et la cellule est mise en évidence par une flèche. Sur la figure 4C, plusieurs loci de faire varier le nombre de cellules à 10x magnitude sont affichés et chaque locus mis en évidence par une flèche. . Enfin, la figure 4D, un dépôt métastatique de 10 cellules est affichée. Comment ces méthodes influencent les données sont affichées par des différences de souris 1 et souris 3. Une souris a un plus faible nombre de cellules totales dans le poumon, avec une moyenne de 21,5 cellules par section de poumon, par rapport aux souris 3, qui a une moyenne de 700 cellules par section du poumon. Cependant, souris 3 a moins loci, ou des endroits où les cellules sont présentes que la souris 1. Souris 3 a relativement peu de sites de métastase, mais le nombre de cellules par unité de surface est très élevée à 82 cellules par raison de plusieurs loci très grands nombres de métastases de cellules. En revanche, les souris 1 a plus locus unique, mais significativement fcellules aiguière par emplacement à seulement une moyenne de deux cellules par emplacement. Ces différents paramètres peuvent faire la lumière sur la cinétique de cellules trafic au poumon et leur capacité à commencer à se développer et proliférer. En outre, la figure 3D, nous montrons l&#39;évolution du total des cellules métastatiques par poumon chez la souris autopsiés à quatre contre six semaines. Comme décrit dans les figures 2C et 2D, des changements importants sont observés dans le poids de la tumeur et la taille dans les deux dernières semaines d&#39;une expérience. Ceci est récapitulé dans la figure 3D. Souris autopsiés quatre semaines n&#39;ont montré aucun développement métastatique, alors que les souris à six semaines ont montré les cellules métastatiques chez toutes les souris évaluées. Cela démontre également l&#39;importance d&#39;assurer des autopsies souris sont effectuées à un point de terminaison à un stade avancé pour assurer la formation de métastases s&#39;est produite. Une mesure supplémentaire dans ce modèle est modifications moléculaires qui se produisent à l&#39;intérieur de l&#39;<html> tumeur primaire. Dans les figures 5A-5C nous montrons trois expériences qRT / PCR exemple la mesure de trois gènes d&#39;intérêt dans la progression métastatique, le type de métalloprotéinase matricielle 2 (MMP-2), de type matrice métalloprotéinase 9 (MMP-9), et la protéine de choc thermique 27 (HSP27) respectivement. Tout gène d&#39;intérêt mesuré par qRT / PCR peut être détectée en utilisant cette technique. En outre, les niveaux de protéines peuvent être quantifiés en utilisant des procédures de Western blot. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig1.jpg" /> Figure 1. Poids corporel observée et la consommation alimentaire chez les animaux. AB) Poids en grammes, ou la consommation alimentaire moyenne par souris par jour en grammes, est enregistrée tout au long de l&#39;expérience et montré en A) et B) respectivement. fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. La taille des tumeurs et le poids de la tumeur chez des particuliers et des groupes de souris. AB) du poids de la tumeur en grammes et la taille de la tumeur en centimètres carrés de cinq souris témoins représentatifs et la moyenne des cinq souris au bout de six semaines sont présentées dans A) et B) respectivement. CD) La comparaison des poids de la tumeur en grammes et taille de la tumeur en centimètres carrés entre les groupes de souris autopsié à quatre et six semaines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50873/50873fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50873/50873fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig3.jpg" /> Figure 3. Dissémination métastatique en individuel et groupes de souris. AS) sprea métastatique moyennej par section du poumon pendant cinq souris individuelles et de la moyenne des cinq souris au bout de six semaines représentés comme étant soit le nombre total de cellules (A), les emplacements des cellules métastatiques (B), ou d&#39;une métastase distincte telle que définie par 5 + cellules dans Une comparaison du nombre moyen de cellules métastatiques par section du poumon par la souris entre les souris un groupe clairement défini (C). D) autopsié à quatre et six semaines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50873/50873fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50873/50873fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig4.jpg" /> Figure 4. Des images représentatives de métastases pulmonaires. A) Une cellule du poumon individuelle de la GFP positif à 40X objectif est mis en évidence par une flèche. B) Un poumon adjacentsection de A), montrant la même cellule sous coloration H &amp; E. C) Une section du poumon à 10X objectif avec sept locus individuel contenant un nombre variable de cellules. D) Une métastase distincte à 10X objectif contenant 10 cellules cancéreuses clairement définis comme un groupe. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50873/50873fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;analyse par PCR de trois gènes métastatiques d&#39;intérêt. QRT / PCR a été réalisée sur des échantillons de tumeurs individuelles collectées à partir de souris à six semaines. Niveaux de transcrits d&#39;ARNm relatives de la MMP-2 (A), MMP-9 (B), et HSP27 (C) sont mesurées, normalisées à GAPDH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50873/50873fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

Ce modèle orthotopique de cancer de la prostate humain permet la quantification de la taille de la tumeur, les cellules tumorales circulantes, et la formation de métastases dans le poumon distinct. Comme les cellules doivent échapper à l&#39;organe principal, entrer dans la circulation sanguine, et implanter dans un site secondaire, ce modèle reprend effectivement le scénario chez les humains.

Un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de quantifier la taille de la tumeur primaire, la formation de métastases pulmonaires et le nombre de cellules tumorales circulantes dans un modèle murin de cancer de la prostate humain. Ceci est réalisé par l’implantation directe de cellules cancéreuses de la prostate humaine dans le lobe ventral de la prostate d’une souris athymique babsi. Une fois que les tumeurs se sont développées, les fémurs et le sang cardiaque sont retirés de l’animal, ce qui permet d’identifier les cellules tumorales circulantes.Enfin, les tumeurs primaires et les poumons sont retirés pour analyse. En fin de compte, les changements dans la taille de la tumeur primaire, le poids et les caractéristiques moléculaires, ainsi que la formation de métastases pulmonaires peuvent être mesurés. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres techniques, telles qu’une veine de la queue ou une injection intercardiaque, est qu’avec cette technique, l’étendue complète des métastases peut être mesurée à partir de la formation de l’extravasation tumorale primaire et de la survie dans la circulation sanguine et de l’arrivée et de la formation d’une métastase secondaire dans un nouveau site.Les implications de cette technique concernent le traitement des métastases du cancer de la prostate humaine. Nous avons utilisé ce modèle pour tester les effets de plusieurs petites molécules thérapeutiques sur l’inhibition des métastases du cancer de la prostate humaine. De plus, le modèle peut être utilisé pour valider des cibles thérapeutiques potentielles pour inhiber les métastases du cancer de la prostate humaine Commencez par utiliser des boules de coton stériles et de la bétadine pour frotter la région abdominale inférieure d’une souris bopsy athymique anesthésiée âgée de six à huit semaines.Ensuite, tamponnez la zone avec une lingette imbibée d’alcool, puis essuyez l’animal avec une solution de bétadine. Après avoir laissé la zone sécher, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux stériles aiguisés pour faire une incision abdominale médiane de trois à quatre millimètres de profondeur. Ensuite, à l’aide d’une pince, soulevez doucement la vessie sans bouger d’autres organes ou muscles, et identifiez le lobe ventral de la prostate situé directement sous la vessie.Injectez maintenant la population de cellules tumorales d’intérêt avec une seringue de 0,5 cc équipée d’une aiguille de calibre 28 et demi dans la prostate ventrale, en minimisant les fuites et en veillant à ce qu’une petite bulle soit observée dans le tissu. Ensuite, remplacez la vessie et utilisez des sutures monofilament de Vicryl 4.0 résorbables pour fermer la couche musculaire selon un simple schéma interrompu. Fermez la couche de peau avec des agrafes stériles de neuf millimètres.Après quatre à six semaines, les tumeurs sont visuellement apparentes ou peuvent être palpées après l’euthanasie. Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper horizontalement directement sous la cage thoracique, puis verticalement jusqu’à l’aisselle pour exposer le cœur, prélevez le sang de l’animal à l’aide d’une ponction cardiaque terminale à l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez la trachée, puis retirez les poumons et placez immédiatement les poumons dans une cassette de tissus, puis dans un récipient contenant 10 % de formol. Ensuite, individuellement, coupez tous les vaisseaux sanguins attachés à la tumeur primitive de la prostate en prenant soin de vous assurer qu’aucun organe supplémentaire n’est attaché, notez le poids et la taille de la tumeur.Ensuite, cassez immédiatement, congelez le tissu dans de l’azote liquide ou placez le tissu dans une cassette de tissu, puis dans un récipient contenant 10 % de formine. Enfin, utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour exposer les articulations de la hanche et du genou. Débranchez ensuite les pattes en prenant soin de garder le fémur intact avant de les placer dans une solution saline stérile.Dans cette première figure, les changements dans le poids corporel et la consommation alimentaire de souris six semaines après l’inoculation de la tumeur sont montrés. Notez qu’il y a une petite baisse du poids corporel et de la consommation alimentaire autour de la date de la chirurgie en raison de l’anesthésie. Au cours de l’expérience, le poids corporel et la consommation de nourriture augmentent lentement après l’opération, puis commencent à diminuer vers la fin de l’expérience.Lorsque la charge tumorale atteint un niveau critique dans ces graphiques, des tailles de tumeurs représentatives sont indiquées. La taille des tumeurs varie d’un individu à l’autre, mais en moyenne, des tumeurs d’environ un gramme de poids et d’un centimètre cube sont obtenues, comme illustré. Ici, il est important de considérer les changements de poids et de taille de la tumeur qui se produisent entre quatre et six semaines.Lors de la planification du point final de l’expérience dans cette expérience représentative au cours des deux dernières semaines, le poids moyen de la tumeur a été multiplié par 2,7 et la taille de la tumeur a été multipliée par 1,9 de façon spectaculaire. Influençant les résultats expérimentaux, des changements dans le nombre total de cellules métastatiques par poumon et une nécropsie de souris à quatre semaines contre six semaines peuvent être observés, ainsi qu’illustrés dans ce graphique. Les souris sacrifiées à quatre semaines n’ont montré aucun développement métastatique tandis que les souris à six semaines après l’inoculation tumorale ont montré des cellules métastatiques chez toutes les souris.L’évaluation a été menée en soulignant l’importance que les nécropsies des souris soient effectuées à un stade avancé pour s’assurer que les métastases se sont produites. Ces délais peuvent varier selon la lignée cellulaire ou les modifications génétiques. Le nombre de métastases peut être quantifié de trois manières différentes.Par exemple, le nombre total de cellules cancéreuses de la prostate humaine positives à la GFP peut simplement être compté à l’aide de la coloration immunohistochimique pour la GFP ou à l’aide de la coloration h et e comme dans ces images où une cellule individuelle de magnitude 40 x est mise en évidence par une flèche. Notez que la coloration brune dans la section pulmonaire colorée à la GFP et les grands noyaux distincts. Une autre façon de quantifier le nombre de métastases est de considérer le nombre d’endroits où les dépôts métastatiques sont présents.Par exemple, dans cette image à magnitude 10 x, plusieurs loci de numéros de cellules variables, chacun mis en évidence par une flèche, peuvent être observés dans cette image de magnitude accrue, un loci avec trois cellules distinctes est également mis en évidence. Enfin, le nombre de métastases distinctes définies par un groupe de cellules clairement liées montrant cinq cellules cancéreuses de la prostate humaine positives ou plus à la GFP peut également être quantifié comme dans cette image où un dépôt métastatique de 10 cellules est montré dans ces trois derniers graphiques, des expériences représentatives de QR TPCR R mesurant l’expression de trois gènes d’intérêt dans la métalloprotéinase matricielle de progression métastatique de type deux, La métalloprotéinase matricielle de type neuf et la protéine de choc thermique 27 dans des échantillons tumoraux individuels prélevés sur des souris à six semaines sont présentées. Lors du développement initial de cette technique, il est important de travailler avec votre animalerie et le personnel vétérinaire afin d’administrer correctement l’anesthésie, les analgésiques et de minimiser la contrainte chirurgicale.

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