Name: Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Découvrez deux méthodes d'attribution des résonances RMN de la lysine N-terminale méthylée par réduction sur la lysozyme, utilisant la sélectivité pH et l'aminopeptidase. Ces techniques avancent l'analyse structurale des protéines.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été soutenue par le numéro de bourse R00RR024105 du National Center For Research Resources, National Institute of Health.

1. Méthylation réductrice du lysozyme
<ol>
	<li>Préparez 500 ml d’un tampon de phosphate de sodium de 50 mM à pH 7,5. Conserver à température ambiante.</li>
	<li>Étiquetez trois tubes de microcentrifugation de 1 ml pour un échantillon entièrement marqué (FLS), un échantillon partiellement marqué à faible pH (LpH) et un échantillon partiellement marqué à pH élevé (HpH).</li>
	<li>Peser 10 mg de lysozyme et le dissoudre dans 2 ml de tampon de phosphate de sodium pour créer une solution aqueuse à une concentration de 5 mg/ml. Couvrir les tubes d’une feuille d’aluminium pour protéger le formaldéhyde de la dégradation due à l’exposition à la lumière. Ajouter 500 μl de solution de lysozyme dans chaque tube.</li>
	<li>Préparez des solutions fraîches de 1,0 M de complexe de diméthylamine borane (DMAB) et de 13C-formaldéhyde. Conserver à 0 °C.</li>
	<li>Pour l’échantillon entièrement marqué, utilisez un rapport molaire de 1:10 (amine réactive : formaldéhyde), et pour les échantillons partiellement marqués, utilisez un rapport de 1:5. Alternativement, le rapport peut être optimisé. Par exemple, afin de voir la dominance du pic de C-diméthylamine α-13à faible pH, un rapport de 2:7 était nécessaire.</li>
	<li>Ajoutez 6,1 μl de DMAB 1,0 M à FLS, ajoutez 3,2 μl de DMAB 1,0 M à LpH et HpH, et agitez doucement. Ajoutez ensuite 12,3 μl de 1,0 M 13C-formaldéhyde à FLS et 6,1 μl de 1,0 M 13C-formaldéhyde à LpH et HpH. Agitez les mélanges réactionnels à 4 °C pendant 2 heures.</li>
	<li>Ajouter une autre aliquote de 1,0 M DMAB et de 13C-formaldéhyde comme à l’étape précédente et agiter le mélange réactionnel pendant une nuit à 4 °C pour un temps de réaction total de 18 à 24 heures.</li>
	<li>Remplacez le tampon de l'échantillon par du phosphate à pH 7,5 pour éliminer l'excès de réactifs et de produits secondaires à l'aide d'un filtre centrifuge (seuil de coupure de 3 kDa en poids moléculaire).</li>
	<li>Pour les échantillons partiellement marqués, méthyler de manière réductrice les échantillons à pH 7,5 avec du formaldéhyde d’abondance naturelle pour créer une protéine modifiée de manière homogène. Préparez de nouvelles solutions de 1,0 M de DMAB et de formaldéhyde en abondance naturelle.</li>
	<li>Couvrez les tubes d’échantillon avec du papier d’aluminium, ajoutez 6,1 μl de DMAB à LpH et HpH, et agitez doucement. Ajoutez ensuite 12,3 μl de formaldéhyde d’abondance naturelle. Agitez les mélanges réactionnels à 4 °C pendant 2 heures.</li>
	<li>Ajouter une autre aliquote de 1,0 M de DMAB et de formaldéhyde d’abondance naturelle comme à l’étape précédente et agiter les mélanges réactionnels pendant une nuit à 4 °C pour un temps de réaction total de 18 à 24 heures. Ensuite, échangez la mémoire tampon en suivant les étapes 2.5-2.6 et stockez les échantillons de 50 μg à -20 °C pour la MS.</li>
</ol>
2. Préparer l’échantillon pour l’analyse RMN
<ol>
	<li>Préparez une solution tampon de borate de sodium de 2,0 M à un pH de 8,5 po H2O.</li>
	<li>Ajouter 375 μl de solution tampon de borate de sodium 2,0 M dans quatre tubes coniques de 15 ml. Parafilmez les sommets et les trous de perforation. Placer le ballon dans un ballon lyophilisant et congeler l’échantillon.</li>
	<li>Placez l’échantillon congelé sur un lyophilisateur pour le faire sécher. Retirer une fois sec.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette, ajouter 15 ml de D2O dans chaque tube et mélanger.</li>
	<li>Étiquetez trois filtres centrifuges de 4 ml (poids moléculaire de coupure de 3 kDa) avec FLS, LpH et HpH. Ajoutez l’échantillon correspondant dans les tubes filtrants (~500 μl). Ajouter 3,0 ml de tampon de borate de sodium de 50 mM à pH 8,5 dans chaque tube. Fabriquer un tube d’équilibrage pour le troisième tube et concentrer les échantillons à 500 μl à l’aide d’une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe de 35° à 4 °C et 7 500 rcf.</li>
	<li>Videz le piège sous chaque filtre. Ajoutez encore 3,0 ml de tampon aux échantillons et concentrez à nouveau les échantillons à 500 μl. Répétez l’étape 2.5 4 fois.</li>
	<li>À l’aide du dosage de la protéine d’acide bicinchoninique (BCA)36, déterminez la concentration de chaque échantillon. Diluez les échantillons de lysozyme avec un tampon de borate de sodium de 50 mM pour obtenir des échantillons de 150 μM.</li>
	<li>Transfert de 530 μl dans un tube RMN de 5 mm ou de 250 μM dans un tube de 5 mm à susceptibilité magnétique</li>.
	<li>Préparer une solution mère de 80 mM de 1,2-dichloroéthane-13 C2 in D2O. Conserver cette solution mère à -80 °C. Diluer à 24 mM dans 80 μl et transférer dans un tube d’insertion coaxiale pour l’utiliser comme référence dans l’analyse RMN. Analysez les échantillons par RMN. Remarque : Exécutez un HSQC 1D 1 H-13C et intégrez les zones de crête pour chaque résonance. Les zones de pic doivent être les mêmes pour un échantillon entièrement étiqueté.</li>
</ol>
3. Dégradation du lysozyme par l’aminopeptidase
<ol>
	<li>Préparez une solution de lysozyme à 5 mg/ml dans de l’eau ultrapure.</li>
	<li>Ajouter 250 μl de la solution de lysozyme dans un tube à centrifuger propre de 1 ml.</li>
	<li>Ajouter 25 μl d’une solution de tricine 0,1 M, pH 8,0, et 6 μl d’une solution d’Aeromonas proteolytica aminopeptidase de 2,16 μg/ml.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 6 h.</li>
	<li>Ajouter 6 μl supplémentaires de la solution d’aminopeptidase à 2,16 μg/ml à l’échantillon pour un rapport molaire de 1:50 entre l’aminopeptidase et le lysozyme. Incuber pendant 20 heures supplémentaires à 37 °C.</li>
	<li>Dessaler 30 μl de l'échantillon à l'aide d'une colonne de spin en C18 (suivre le protocole du fabricant). Conserver à -20 °C pour l’analyse MALDI MS.</li>
	<li>Préparer l’échantillon de protéines restant pour la RMN comme décrit dans le protocole 2).</li>
</ol>
4. Préparer des échantillons pour la spectrométrie de masse
<ol>
	<li>À l’aide des 50 μg d’échantillon réservés à l’étape 2.3, remplacer le tampon à 100 mM de bicarbonate d’ammonium, pH 8,0 et concentrer à environ 50 μl à l’aide d’un filtre centrifuge de 1 ml (seuil de coupure de 3 kDa en poids moléculaire). Transférez l’échantillon dans un tube à centrifuger de 1 ml et enveloppez-le dans du papier d’aluminium.</li>
	<li>Ajouter 2,0 μl de 500 mM de dithiothréitol pour réduire les liaisons disulfure. Incuber la solution à 60 °C pendant 1 heure.</li>
	<li>Ajouter 2 μl d’iodoacétamide 500 mM fraîchement préparé pour alkyler les groupes thiols. Incuber à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Retirez la feuille et ajoutez 1,0 μl de la solution de dithiothréitol à 500 mM pour éteindre la réaction.</li>
	<li>Ajouter 2,0 μg de trypsine de séquençage pour digérer la protéine. Incuber le mélange à 37 °C pendant 16 à 24 heures.</li>
	<li>Ajoutez du TFA jusqu’à ce que le pH soit inférieur à 2 pour désaltérer la digestion. (Les acides formique et acétique peuvent également être utilisés)</li>
	<li>Dessalez l’échantillon sur une colonne de spin en C18 et éluez la protéine dans 80 % d’acétonitrile / 0,1 % d’AFT. Séchez l’échantillon à l’aide d’un concentrateur sous vide.</li>
	<li>Reconstituer l’échantillon en 5,0 μl d’acétonitrile à 50 % et de TFA à 0,1 % pour l’analyse MALDI MS. Mélanger des volumes égaux de l’échantillon reconstitué et une solution saturée de matrice d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque sur la plaque cible MALDI. Analysez les échantillons sur une MS MALDI. Remarque : Utilisez la MS en tandem pour confirmer l’identité des pics peptidiques. Lisser les spectres de masse et analyser. Pour chaque peptide contenant de la diméthylamine, déterminer l’intensité maximale et la surface maximale de chaque isotope du profil. Calculez le pourcentage de 13C-incorporation comme décrit précédemment34.</li>
</ol>

<ol><li>Bax, A., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+Advances+in+Protein+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological Advances in Protein NMR.</a> Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).</li>
<li>Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Labeling+of+Arbitrary+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins.</a> Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).</li>
<li>Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalomares%2C+L+%22Recombinant+Gene+Expression%22">Recombinant Gene Expression</a>. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Production+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein Production and Purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Structural+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Lessons from Structural Genomics.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).</li>
<li>Goto, N. K., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Developments+in+Isotope+Labeling+Strategies+for+Protein+Solution+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).</li>
<li>Lian, L., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+Approaches+for+Protein+Structural+Studies+by+Solution-State+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magn.+Reson.+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR.</a> Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).</li>
<li>Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Type+Selective+Isotope+Labelling+of+the+Multidrug+ABC+Transporter+LmrA+for+Solid-State+NMR+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies.</a> Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Amino-Acid-Type+Selective+Isotope+Labeling+of+Protein+Expressed+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3AStructure+Function+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris.</a> Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).</li>
<li>Means, G., Feeney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Alkylation+of+Amino+Groups+in+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins.</a> Biochem. 7 (6), 2192 (1968).</li>
<li>Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR-Studies+of+Ribonuclease-A+Methylated+With+Formaldehyde-C-13.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+alkylation+of+lysine+residues+to+alter+crystallization+properties+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Crystallography%2C+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins.</a> Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).</li>
<li>French, D., Edsall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reactions+of+Formaldehyde+with+Amino+Acids+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins.</a> Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).</li>
<li>Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+Proteins+by+Reductive+Methylation+Using+Sodium+Cyanoborohydride%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).</li>
<li>Walter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+Methylation+as+a+Routine+Rescue+Strategy+for+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Struct%22%5BJournal%5D)">Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization.</a> Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).</li>
<li>Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Consequences+of+Reductive+Methylation+of+Lysine+Residues+in+Hen+Egg-White+Lysozyme+-+An+X-ray+Analysis+at+1.8-Angstrom+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution.</a> Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).</li>
<li>Bokoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-specific+regulation+of+the+extracellular+surface+of+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor.</a> Nat. 463 (7277), (2010).</li>
<li>Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).</li>
<li>Sherry, A., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Studies+of+C-13-Methylated+Concanavalin+A+-+pH+and+Co2%2B-Induced+Nuclear+Magn.+Reson.+Shifts.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts.</a> J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).</li>
<li>Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+NMR+Studies+of+the+Lysyl+Residues+of+fd+Gene+5+Protein+-+Lysines+24%2C+46%2C+and+69+May+be+Involved+in+Nucleic+Acid+Binding.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding.</a> J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.</li>
<li>Moore, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-epsilon%2CN-epsilon-dimethyl-lysine+cytochrome+c+as+an+NMR+probe+for+lysine+involvement+in+protein-protein+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation.</a> Biochem. J. 332, 439-449 (1998).</li>
<li>Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+Active-Site+Lysine+of+Ribonuclease-A+By+C-13+NMR.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR.</a> Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).</li>
<li>Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Interactions+of+Amino+Groups+in+C-13+Reductively+Methylated+Hen+Egg-White+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme.</a> J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).</li>
<li>Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+of+Methylated+Lysines+of+fd+Gene-5+Protein+-+Evidence+for+A+Conformational+Change+Involving+Lysine-24+Upon+Binding+of+A+Negatively+Charged+Lanthanide+Chelate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate.</a> Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).</li>
<li>Gluck, M., Sweeney, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13-NMR+of+Clostridium-Pasteurianum+Ferredoxin+After+Reductive+Methylation+of+the+Amines+Using+C-13+Formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).</li>
<li>Jentoft, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+Nuclear-Magnetic-Resonance+in+Structure-Function+Studies+of+Fc+Fragment+and+Its+Subfragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments.</a> Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).</li>
<li>Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conformation+of+Apolipoprotein+A-I+in+Discoidal+and+Spherical+Recombinant+High+Density+Lipoprotein+Particles+-+C-13+NMR+Studies+of+Lysine+Ionization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization.</a> J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).</li>
<li>Ashfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Modification+of+a+Variant+of+Human+MIP-1+Alpha%2C+Implications+for+Dimer+Structure.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure.</a> Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).</li>
<li>Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+Inversion+in+Proteins+-+A+C-13-NMR+Study+of+Proton+Exchange+and+Nitrogen+Inversion+Rates+in+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha-%5BC-13%5DTetramethyllysine%2C+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha%5BC-13%5DTetramethyllysine+Methyl-Ester%2C+and+Reductively+Methylated+Concanavalin-A.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A.</a> Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).</li>
<li>Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+Motions+in+C-13+Methylated+Concanavalin-as+Studied+by+C-13+Magnetic-Resonance+Relaxation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques.</a> Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).</li>
<li>Huque, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+Studies+of+the+Lysine+Side+Chains+of+Calmodulin+and+Its+Proteolytic+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments.</a> Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).</li>
<li>Brown, L., Bradbury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-Magnetic-Resonance+Studies+of+Lysine+Residues+of+Ribonuclease-A%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A.</a> Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).</li>
<li>Zhang, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Side+Chain+pKa+Values+of+the+Lysine+Residues+in+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin.</a> J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).</li>
<li>Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrometry+Assisted+Assignment+of+NMR+Resonances+in+Reductively+C-13-Methylated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).</li>
<li>Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncovalent+Polycationic+Coatings+for+Capillaries+in+Capillary+Electrophoresis+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins.</a> Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+strategies+for+characterizing+protein+conformations+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomolec.+NMR%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR.</a> J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).</li>
<li>Bradbury, J. H., Brown, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Dissociation+Constants+of+Lysine+Residues+of+Lysozyme+by+Proton-Magnetic-Resonance+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy.</a> Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).</li>
<li>Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+the+Aminopeptidase+from+Aeromonas+proteolytica+on+Mg2%2B%2FAl3%2B+Layered+Double+Hydroxide+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl.+Mater.%2C+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles.</a> Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).</li>
<li>Poncz, L., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Resistance+to+Tryptic+Hydrolysis+of+Peptide-Bonds+Adjacent+to+N-epsilon%2CN-Dimethyllysyl+Residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues.</a> J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).</li>
</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

L’attribution des signaux RMN de protéines 13C-méthylées réductrices est nécessaire pour utiliser pleinement cette méthode de marquage isotopique. L’utilisation de la spectrométrie de masse pour faciliter l’attribution des signaux RMN par corrélation des données partielles d’incorporation de 13C est une technique prometteuse. L’avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes d’attribution est que seule la séquence d’acides aminés primaire est nécessaire. La méthode d’assignation assistée...

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est un outil précieux d’élucidation de la structure des protéines1. La spectroscopie RMN peut être utilisée pour déterminer la structure de la solution d’une protéine dans son état natif. Pour pallier la faible abondance naturelle d’isotopes magnétiques stables, il est nécessaire d’incorporer le 13C et le 15N dans la protéine d’intérêt. La méthode la plus couramment employée est l’expression recombinante dans un hôte bactérien2-3. Cependant, deux inconvénients de la surexpression de l’hôte bactérien sont qu’elle ne peut pas produire de modifications post-traductionnelles et ne fonctionne pas pour toutes les protéines3-4. Lorsque l’expression bactérienne n’est pas une voie viable pour la production de protéines, la surexpression chez les hôtes non bactériens peut être utilisée, mais le marquage isotopique est difficile et coûteux5. D’autres méthodes d’expression pour incorporer les isotopes 13C et 15N dans les protéines pour l’analyse RMN comprennent des techniques de marquage clairsemé utilisant des précurseurs métaboliques pour le marquage méthylique6 et les acides aminés simples 13C et 15N7-9. Une approche chimique du marquage épars utilisée ici est la réaction réductrice de 13C-méthylation bien établie (Figure 1), où les groupes aminés primaires d’une protéine - la α-amine N-terminale et la lysine, ε-amines à chaîne latérale - sont méthylés. Une fois que les monométhylamines sont formées, l’amine subit facilement une méthylation à nouveau, en raison de la valeur pKa plus élevée, pour former des diméthylamines.
La méthylation réductrice a été introduite pour la première fois comme méthode de modification chimique des protéines par Means et Feeney10. Les avantages de cette réaction sont sa large applicabilité et ses conditions de réactions douces à un pH physiologique tamponné et à de basses températures11,12. En présence de formaldéhyde et d’un agent réducteur, tel que le complexe diméthylamine borane (DMAB), les groupes lysine ε-amino et le groupe N-terminal α-amino sont méthylés sélectivement pour produire des amines diméthylées. Bien que le formaldéhyde soit connu pour réticuler les protéines par la formation de ponts méthylène, ce processus est bloqué par l’agent réducteur13,14.
La méthylation réductrice a été utilisée avec succès pour étudier les protéines avec RMN et cristallographie aux rayons X. La méthylation réductrice est utilisée pour faciliter la cristallisation de protéines autrement intraitables15. Le lysozyme de blanc d’œuf de poule a été la première protéine cristallisée sous sa forme diméthylée. La différence quadratique moyenne entre les atomes lourds dans les structures de lysozyme méthylé et non méthylé est de 0,40 Å16. Cette comparaison démontre que la structure de la protéine peut être maintenue après une méthylation réductrice, ce qui fait de la réaction un outil de marquage viable pour l’élucidation de la structure.
En utilisant du formaldéhyde marqué au carbone 13dans la réaction de méthylation réductrice, des amines 13diméthylées en carbone sont produites. Les 13C-diméthylamines sont des sondes détectables par RMN qui ont été largement utilisées pour étudier la dynamique, la structure et la fonction des protéines. La RMN et la C-méthylation réductrice de la 13ont été utilisées pour étudier les interactions protéine-ligand et protéine-protéine pour le récepteur adrénergique β2 17, la ribonucléase A18, le lysozyme19, la protéine20 du gène FD 5 et le cytochrome C21. De même, les propriétés structurales et fonctionnelles de la ribonucléase C-méthylée A22 réductrice, du lysozyme23, de la protéine24 du gène fd 5, de la ferrédoxine25 de Clostridium pasteurianum, du fragment Fc d’IgG26, de l’apolipoprotéine A-I27 et de la MIP-1α28 La dynamique des 13groupes C-diméthylamino a été étudiée sur la concanavaline A29-30 et la calmoduline31.
Bien que la C-méthylation réductrice 13ait été largement utilisée pour étudier les protéines avec RMN, la méthode de marquage a toujours été limitée par les difficultés d’attribution des résonances RMN26. La plupart des stratégies d’attribution pour les protéines 13C-méthylées réductrices se sont appuyées sur un petit nombre de sites,20,28 propriétés structurelles connues11,19,23,26,31,32. ou modifications génétiques étendues33. Aucune de ces études n’a réussi à attribuer les 13pics de C-diméthylamine, à l’exception de l’étude de la calmoduline, où les pics ont été attribués par mutagénèse dirigée de chaque lysine33. Dans l’étude de la formation des dimères MIP-1α, l’utilisation de la spectrométrie de masse (MS) pour faciliter l’attribution RMN d’amines 13C-méthylées réductrices a été signalée pour la première fois28. La MS par désorption ionisation par ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) MS a été utilisée pour identifier la lysine à l’interface du dimère. Les lysines partiellement méthylées des peptides tryptiques MIP-1α humains ont été identifiées avec la MS et corrélées avec l’apparition de signaux mono- et diméthylamines de la protéine intacte observée dans les spectres RMN 2D 1 H-13C Hsqc28. Notre groupe a approfondi l'utilisation de la SEP et a présenté une méthode d'assignation qui ne nécessite aucune connaissance préalable de la structure ou des propriétés de la protéine autre que la séquence d'acides aminés34. Cette méthode est applicable à la plupart des protéines. Une exception est lorsqu’une protéine a une lysine N-terminale, car le profil isotopique MS de la lysine N-terminale α- et ε-13C-diméthylamines ne peut pas être mesuré indépendamment.
Ici, nous présentons deux méthodes, l’une chimique et l’autre enzymatique, pour identifier la α-diméthylamine N-terminale et les sites ε-diméthylamine à chaîne latérale d’un résidu de lysine N-terminal. La première méthode a été inspirée par Córdova et al.qui a utilisé le pH pour contrôler la sélectivité de l’acétylation des protéines35. La réaction favorise la α-amine N-terminale à faible pH et la chaîne latérale ε-amines à pH élevé, permettant de distinguer les groupes protéiques α- et ε-aminés, dans leurs études, par électrophorèse capillaire35. Nous démontrons comment un pH élevé et bas est utilisé pour modifier le marquage des groupes aminés protéiques en utilisant la réaction réductrice de méthylation 13C et pour permettre l’application de la stratégie d’assignation assistée par MS. La deuxième méthode d’attribution des C-diméthylamines N-terminales α- et ε-13-13tire parti de l’élimination sélective du ou des résidus N-terminaux à l’aide de la recombinante Aeromonas proteolytica aminopeptidase.

<table><tbody><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 ml filtre centrifuge (3k MWCO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC800308 (8pk)</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidase</td><td>Creative Biomart</td><td>Aminopeptidase-86A</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Complexe borane-diméthylamine</td><td>Sigma</td><td>180238</td><td>Préparez une solution fraîche de 1 M avant utilisation.</td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Pancréas bovin</td><td>insuline Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 Colonnes de centrifugation</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dichloroéthane-13C2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>Solution mère de 80 mM stockée à -80 °C. Utilisée comme référence dans les spectres RMN à 24 mM.</td></tr><tr><td>Formaldéhyde (36,5 % en poids/poids)</td><td>Sigma</td><td>33220</td><td>Préparez une solution fraîche de 1 M avant utilisation.</td></tr><tr><td>13C-formaldéhyde (99 %)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-806-1</td><td>Préparez une solution fraîche de 1 M avant utilisation.</td></tr><tr><td>Lysozyme (blanc d’œuf de poule)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium (heptahydraté dibasique)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium (monobasique)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS avec sonde HCN 5922 de 5 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes d’identification des résonances rmn de l’amine 13c-diméthyl n-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique éprouvée pour l’étude de la structure et de la dynamique des protéines. Pour étudier les protéines avec RMN, les isotopes magnétiques stables sont généralement incorporés métaboliquement pour améliorer la sensibilité et permettre l’attribution séquentielle de la résonance. La 13-C-méthylation réductrice est une méthode alternative de marquage pour les protéines qui ne se prêtent pas à la surexpression de l’hôte bactérien, la méthode la plus courante d’incorporation d’isotopes. La 13-C-méthylation réductrice est une réaction chimique réalisée dans des conditions douces qui modifie les principaux groupes aminés d'une protéine (lysine ε-groupes aminés et le groupe N-terminal α-amino) en 13groupes C-diméthylamine. La structure et la fonction de la plupart des protéines ne sont pas modifiées par la modification, ce qui en fait une alternative viable au marquage métabolique. Étant donné que la 13-C-méthylation réductrice ajoute des marqueurs isotopiques clairsemés, les méthodes traditionnelles d’attribution des signaux RMN ne sont pas applicables. Une autre méthode d’assignation utilisant la spectrométrie de masse (MS) pour faciliter l’assignation des signaux RMN de la protéine 13C-diméthylamine a été développée. La méthode repose sur des quantités partielles et différentes de marquage 13C à chaque groupe d’acides aminés primaires. L'une des limites de la méthode survient lorsque le résidu N-terminal de la protéine est une lysine, car les groupes α- et ε-diméthylamino de Lys1 ne peuvent pas être mesurés individuellement avec MS. Pour contourner cette limitation, deux méthodes sont décrites pour identifier la résonance RMN des 13C-diméthylamines associées à la fois à la N-terminale α-amine et à la chaîne latérale ε-amine. Les signaux RMN de la α-diméthylamine N-terminale et de la chaîne latérale ε-diméthylamine du lysozyme de blanc d’œuf de poule, Lys1, sont identifiés dans les spectres hétéronucléaires de cohérence quantique unique 1 H-13C.

Méthylation réductrice et pH
Une réaction de méthylation réductrice chimiosélective au 13C induite par le pH a été démontrée sur la lysozyme. À pH bas, la réaction préfère l’amine α du groupe N-terminal aux amines ε des chaînes latérales, et inversement à pH élevé. En solution, les groupes amines de la protéine existent en équilibre entre l’amine libre et l’acide conjugué, équilibre que l’on peut ajuster en fonction du pH. La plage de pH optimale pour cette réaction dépend du ...

Deux méthodes d’attribution des signaux de résonance magnétique nucléaire α- et ε-diméthylamine d’une lysine N-terminale 13C-méthylée réductrice sont décrites. Une méthode utilise la sélectivité induite par le pH de la réaction de méthylation réductrice, et l’autre utilise l’aminopeptidase pour éliminer sélectivement la lysine N-terminale.

Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

L’objectif global de cette procédure est d’attribuer la résonance RMN du carbone alpha et epsilon. 13 diméthylamine de la lysine terminale, résidu du lysozyme. Ceci est accompli en méthylant d’abord de manière réductrice le lysozyme à pH faible et élevé, avec une quantité sous-géométrique de formaldéhyde de carbone 13.La deuxième étape consiste à méthyler de manière réductrice les échantillons à pH faible et élevé avec une abondance naturelle excessive pour que le formaldéhyde complète la méthylation. La dernière étape consiste à échanger les échantillons méthylés de manière réductrice dans un tampon D deux O pour l’analyse RMN. Dans la deuxième méthode, l’objectif est atteint par la dégradation de l’amino-peptidase d’un échantillon de lysozyme.La deuxième étape consiste à méthyler de manière réductrice l’échantillon de protéine tronquée avec un excès de formaldéhyde de carbone 13, suivi d’un échange de tampon pour l’analyse RMN. En fin de compte, la spectroscopie RMN est utilisée pour montrer l’absence de résonance méthyle du carbone 13 pour effectuer des affectations. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet d’attribuer sans ambiguïté les résonances alpha et SSON diméthyl lamine et ML de la lysine interne d’une protéine Marquage trois microtubes à centrifuger d’un millilitre avec F-L-S-L-P-H et HPH dissoudre trois échantillons de lysozyme dans une solution tampon préalablement préparée au pH six, 7,5 et 10 pour obtenir une concentration finale de cinq milligrammes par millilitre.Couvrez les tubes d’une feuille d’aluminium pour les protéger de la dégradation due à l’exposition à la lumière. Ensuite, ajoutez 6,1 microlitres d’une solution complexe de forage de diméthylamine molaire préalablement préparée dans le tube FLS et 3,2 microlitres de la même solution dans les tubes LPH et HPH. Après avoir doucement tourbillonné les mélanges, ajoutez 12,3 microlitres d’une solution molaire de formaldéhyde de carbone 13 préalablement préparée à l’échantillon FLS et 6,1 microlitres de la même solution aux échantillons L-P-H-N-H-P-H.Agitez les mélanges réactionnels à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Répétez les étapes précédentes en ajoutant les mêmes aliquotes de DMAB et de formaldéhyde de carbone 13 dans les tubes correspondants. Agiter les mélanges réactionnels pendant une nuit à quatre degrés Celsius pendant un temps de réaction total de 18 à 24 heures après l’agitation, remplacer le tampon de chaque échantillon par trois millilitres de tampon phosphate à pH 7,5 pour éliminer l’excès de réactifs et de produits secondaires à l’aide d’un filtre centrifuge à une coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons, concentrer les échantillons à 500 microlitres à l’aide d’une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe de 35 degrés à quatre degrés Celsius et 7, 500 RCF.Répétez les étapes précédentes deux fois par la suite. Couvrez les tubes d’échantillon partiellement étiquetés avec une feuille d’aluminium et ajoutez-y 6,1 microlitres d’une solution DMAB molaire fraîchement préparée. Une fois que les échantillons ont été vortexés, ajoutez 12,3 microlitres d’une solution de formaldéhyde d’abondance naturelle d’une molaire fraîchement préparée dans les tubes.Agitez les mélanges réactionnels à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Ajoutez les mêmes aliquotes de DMAB et de formaldéhyde d’abondance naturelle qu’à l’étape précédente, et agitez les mélanges réactionnels pendant une nuit à quatre degrés Celsius pour un temps de réaction total de 18 à 24 heures après l’échange de tampon avec un tampon de phosphate de sodium de 50 millimolaires. Transférez 10 aliquotes de microlitres de chaque échantillon dans des tubes de micro-centrifugeuse propres et stockez les échantillons à moins 20 degrés Celsius pour l’analyse MALDI MS.Ensuite, ajoutez 375 microlitres d’une solution tampon de borate de sodium à deux molaires préalablement préparée dans quatre tubes coniques de 15 millilitres. Para filme le haut des tubes et perce des trous à travers le film para. Placez les tubes dans une fiole lyophilisée et congelez l’échantillon.Une fois les échantillons congelés, placer une fiole sur un lyophilisateur pour sécher après avoir retiré l’échantillon de la pipette lyophilisateur 15 millilitres de D deux O dans chaque tube et mélanger en suivant cette étiquette, trois tubes coniques de quatre millilitres contenant des filtres centrifuges avec F-L-S-L-P-H et HPH. Ajoutez environ 500 microlitres de chaque échantillon dans les tubes filtrants correspondants. Ajoutez ensuite trois millilitres de tampon de sodium de 50 millimolaires.Ajouter un pH de 8,5 dans chaque tube. Concentrez les échantillons à 500 microlitres à l’aide d’une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe de 35 degrés à quatre degrés Celsius et 7 500 RCF. Après avoir vidé le piège sous chaque filtre, ajoutez trois millilitres supplémentaires de tampon aux échantillons et concentrez-les à 500 microlitres.Répétez les étapes précédentes quatre fois à l’aide du dosage des protéines d’acide bissy. Déterminez la concentration de chaque échantillon. Diluez les échantillons de lysozyme avec un tampon de vide sodique de 50 millimolaires pour obtenir une concentration finale de 150 micromolaires.Ensuite, transférez 530 microlitres de chaque échantillon dans un tube RMN de cinq millimètres. Préparez ensuite une solution mère de 80 millimolaires de carbone 13 marquée un deux DI CHLORO éthane dans D deux O. Diluez la solution à 24 millimolaires avec D deux O, puis transférez-la dans un tube d’insertion coaxiale pour l’utiliser comme référence RMN. Après avoir couru un proton carbone 1D H-S-Q-C-N-M-R intégrer les zones de pic pour chaque résonance.Préparez une solution de lysozyme de cinq milligrammes par millilitre dans de l’eau ultrapure. Transférez 250 microlitres de la solution de lysozyme dans un tube à centrifuger propre d’un millilitre. Ajoutez ensuite 25 microlitres d’une solution de 0,1 molaire à pH huit et six microlitres d’un deux virgule 16 microgrammes par millilitre.Une solution d’amino peptidase protéolytique romanis dans le tube de centrifugation. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant six heures. Après l’incubation, ajoutez six microlitres supplémentaires de la solution d’aminopeptidase à l’échantillon pour obtenir un rapport de une molaire à 50 molaires d’aminopeptidase à incuber pendant 20 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius.Ensuite, DESALT 30 microlitres de l’échantillon à l’aide d’une colonne de spin C 18 et éluer l’échantillon dans un essai à 80 % d’acédonite par 0,1 % TFA stocke l’échantillon à moins 20 degrés Celsius. Pour l’analyse maldi MS, préparez l’échantillon de protéine restant pour la RMN comme décrit précédemment, Une réaction de méthylation réductrice sélective du carbone 13 induite par chimiothérapie induite par le pH a été démontrée sur le lysozyme à faible pH. La réaction préfère l’alphaamine terminale terminale à l’amine epsilon à chaîne latérale et vice versa à pH élevé, comme illustré dans les spectres RMN ici.Le pic sept est absent pour l’échantillon de lysozyme qui a réagi à un pH de 10, ce qui indique que les pics un à six appartiennent aux groupes amino epsilon diméthyle et que le pic sept est le groupe amino alpha diméthyle terminal. Alpha Amin privilégie le carbone réducteur. La méthylation de la 13 à pH six a été observée lorsque la quantité de formaldéhyde de carbone 13 utilisée a été réduite à un rapport molaire de deux à sept, et que l’échantillon n’a pas réagi davantage avec le formaldéhyde d’abondance naturelle Comme illustré ici, la méthylation à faible pH est un mélange de monométhylamines et de diméthylamines.Trois groupes aminés présentent une méthylation faible du carbone 13, ce qui indique que ces groupes ont réagi plus rapidement que les groupes présentant du carbone. 13 monométhyles des trois amines diméthyles de carbone 13. Le pic sept a l’intensité la plus élevée et a été attribué au groupe N termina alpha diméthylamine, corroborant l’attribution du pic sept.L’utilisation de l’échantillon a réagi à un pH élevé avec la capacité de modifier le taux de méthylation réductrice du groupe alpha amino N-terminal. La méthode assistée par MS pour l’affectation du résident RMN peut être appliquée. L’échantillon de lysozyme qui a été méthylé par réduction au carbone 13 à un pH de 10 a été digéré avec de la trypsine et analysé avec maldi TOF MS, car le groupe alpha-amino n’était pas méthylé par réduction au carbone 13.Dans ces conditions, le profil isotopique MS du peptide N terminal tétraméthylé peut être utilisé pour quantifier le pourcentage de carbone 13 incorporé dans le groupe amino epsilon diméthyle N terminal. Le peptide terminal N méthylé DIM 6 6 6 2 marqué au carbone 13 a donné un pourcentage échelonné de carbone. 13 incorporation de 27 %L’analyse RMN du même échantillon de lysozyme a donné un pourcentage d’incorporation de carbone 13 de 33 % pour le pic six, indiquant que le pic six est l’extrémité terminale de la lysine epsilon carbone 13 diméthylamine Maldi, les spectres de masse TOF des échantillons de lysozyme non traités et traités à l’amino-peptidase sont illustrés ici.L’insuline, qui a été utilisée comme contrôle positif, montre un changement vers un rapport de charge moyenne inférieur par rapport à sa forme native de 5731,2. Le lysozyme traité montre un décalage de 14305.8 à 13930.5, correspondant à la perte des trois premiers résidus terminaux finaux de lysozyme, de lysine, de valine et de phénylalanine. Voici les spectres RMN des échantillons de lysozyme méthylé au carbone 13 non traités et traités à l’aminopeptidase par rapport au spectre contrôlé, le spectre de l’échantillon traité à l’aminopeptidase montre une diminution de l’intensité pour les pics six et sept et un pic supplémentaire marqué sept A À partir de ces données, les pics six et sept peuvent être attribués par paires comme lysine, alpha et epsilon diméthylamine.Avant de tenter cette procédure, il est important de tenir compte de la solubilité de votre protéine, des différents phs et d’ajuster le protocole en conséquence.

methods-to-identify-nmr-resonances-13c-dimethyl-n-terminal-amine-on

Research

Recherche

JoVE Journal

Chemistry

Chimie

Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyle N-terminale sur des protéines méthylées réductivement

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l'analyse des mélanges de protéines à l'aide de l'approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type d'échantillon.

Protéomique quantitative à l&#39;aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

La neurochimie du cerveau des mammifères est modifiée dans de nombreuses maladies neurologiques et systémiques. Des profils caractéristiques des métabolites cérébraux peuvent être obtenus efficacement à partir d’extraits bruts de tissu cérébral. À cette fin, la spectroscopie RMN à haute résolution est utilisée, permettant une analyse quantitative détaillée des concentrations de métabolites (métabolomique).

Analyse métabolomique de cerveau de rat par la Résolution nucléaire Haute spectroscopie par résonance magnétique d&#39;extraits de tissus

Nous décrivons ici une méthode pour identifier les phosphorylations multiples d’une protéine intrinsèquement désordonnée par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), en utilisant la protéine Tau comme étude de cas. La protéine Tau recombinante est enrichie isotopiquement et modifiée in vitro par une kinase avant l’acquisition et l’analyse des données.

Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l&#39;identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

Structures des assemblages supramoléculaires protéine à résolution atomique sont de grande importance en raison de leur rôle crucial dans une variété de phénomènes biologiques. Ici, nous présentons un protocole pour effectuer des études structurales à haute résolution sur des ensembles de protéines macromoléculaire insoluble et non cristalline par magie-angle spinning spectroscopie RMN à l’état solide (MAS SSNMR).

Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

La méthylation de l’arginine (R) est une modification post-traductionnelle généralisée régulant de multiples voies biologiques. La spectrométrie de masse est la meilleure technologie pour établir le profil global du R-méthyl-protéome, lorsqu’elle est couplée à des approches biochimiques pour l’enrichissement peptidique modifié. Le flux de travail conçu pour l’identification à haut niveau de confiance de la R-méthylation globale dans les cellules humaines est décrit ici.

Une approche protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour l’analyse globale et à haut niveau de confiance de la R-méthylation des protéines

Cet article décrit une méthode de préparation d’échantillons basée sur l’inactivation thermique pour préserver les peptides endogènes en évitant la dégradation post-mortem, suivie d’une quantification relative utilisant le marquage isotopique plus LC-MS.

Préparation des échantillons et quantification relative à l’aide de la méthylation réductrice des amines pour les études peptidomiques

Un protocole pour l’application de la spectroscopie RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter les interactions inter- et intramoléculaires faibles et transitoires dans les protéines intrinsèquement désordonnées est présenté.

Amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter et caractériser des auto-associations de protéines intrinsèquement désordonnées

Le présent protocole décrit la préparation et la mesure quantitative de l’arginine libre et liée aux protéines et des méthyl-arginines par spectroscopie RMN 1H.

Exploration du méthylome d’arginine par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire

Nous présentons ici un protocole détaillant l’acquisition, le traitement et l’analyse d’une série d’expériences RMN visant à caractériser les interactions protéine-glycane en solution. Les méthodologies les plus courantes basées sur les ligands et les protéines sont décrites, qui contribuent sans aucun doute aux domaines de la glycobiologie structurale et des études de reconnaissance moléculaire.

Démêler les interactions glycanes-protéines : la résonance magnétique nucléaire (RMN) à la rescousse

La structure en solution RMN d’un peptide modèle de métallopérone avec Cu (I) a été déterminée, et un protocole détaillé allant de la préparation de l’échantillon et de la collecte de données 1D et 2D à une structure tridimensionnelle est décrit.

Détermination de la structure et de la coordination de complexes peptides-métalliques à l’aide de la RMN 1D et 2D 1H

Découvrez deux méthodes d'attribution des résonances RMN de la lysine N-terminale méthylée par réduction sur la lysozyme, utilisant la sélectivité pH et l'aminopeptidase. Ces techniques avancent l'analyse structurale des protéines.

Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice (Vidéo) | JoVE Journal

Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine ¹³C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

Explorer plus de vidéos