Name: Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Découvrez deux méthodes d'attribution des résonances RMN de la lysine N-terminale méthylée par réduction sur la lysozyme, utilisant la sélectivité pH et l'aminopeptidase. Ces techniques avancent l'analyse structurale des protéines.

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Cette recherche a été soutenue par le numéro de bourse R00RR024105 du National Center For Research Resources, National Institute of Health.

1. Méthylation réductrice du lysozyme
<ol>
	<li>Préparez 500 ml d’un tampon de phosphate de sodium de 50 mM à pH 7,5. Conserver à température ambiante.</li>
	<li>Étiquetez trois tubes de microcentrifugation de 1 ml pour un échantillon entièrement marqué (FLS), un échantillon partiellement marqué à faible pH (LpH) et un échantillon partiellement marqué à pH élevé (HpH).</li>
	<li>Peser 10 mg de lysozyme et le dissoudre dans 2 ml de tampon de phosphate de sodium pour créer une solution aqueuse à une concentration de 5 mg/ml. Couvrir les tubes d’une feuille d’aluminium pour protéger le formaldéhyde de la dégradation due à l’exposition à la lumière. Ajouter 500 μl de solution de lysozyme dans chaque tube.</li>
	<li>Préparez des solutions fraîches de 1,0 M de complexe de diméthylamine borane (DMAB) et de 13C-formaldéhyde. Conserver à 0 °C.</li>
	<li>Pour l’échantillon entièrement marqué, utilisez un rapport molaire de 1:10 (amine réactive : formaldéhyde), et pour les échantillons partiellement marqués, utilisez un rapport de 1:5. Alternativement, le rapport peut être optimisé. Par exemple, afin de voir la dominance du pic de C-diméthylamine α-13à faible pH, un rapport de 2:7 était nécessaire.</li>
	<li>Ajoutez 6,1 μl de DMAB 1,0 M à FLS, ajoutez 3,2 μl de DMAB 1,0 M à LpH et HpH, et agitez doucement. Ajoutez ensuite 12,3 μl de 1,0 M 13C-formaldéhyde à FLS et 6,1 μl de 1,0 M 13C-formaldéhyde à LpH et HpH. Agitez les mélanges réactionnels à 4 °C pendant 2 heures.</li>
	<li>Ajouter une autre aliquote de 1,0 M DMAB et de 13C-formaldéhyde comme à l’étape précédente et agiter le mélange réactionnel pendant une nuit à 4 °C pour un temps de réaction total de 18 à 24 heures.</li>
	<li>Remplacez le tampon de l'échantillon par du phosphate à pH 7,5 pour éliminer l'excès de réactifs et de produits secondaires à l'aide d'un filtre centrifuge (seuil de coupure de 3 kDa en poids moléculaire).</li>
	<li>Pour les échantillons partiellement marqués, méthyler de manière réductrice les échantillons à pH 7,5 avec du formaldéhyde d’abondance naturelle pour créer une protéine modifiée de manière homogène. Préparez de nouvelles solutions de 1,0 M de DMAB et de formaldéhyde en abondance naturelle.</li>
	<li>Couvrez les tubes d’échantillon avec du papier d’aluminium, ajoutez 6,1 μl de DMAB à LpH et HpH, et agitez doucement. Ajoutez ensuite 12,3 μl de formaldéhyde d’abondance naturelle. Agitez les mélanges réactionnels à 4 °C pendant 2 heures.</li>
	<li>Ajouter une autre aliquote de 1,0 M de DMAB et de formaldéhyde d’abondance naturelle comme à l’étape précédente et agiter les mélanges réactionnels pendant une nuit à 4 °C pour un temps de réaction total de 18 à 24 heures. Ensuite, échangez la mémoire tampon en suivant les étapes 2.5-2.6 et stockez les échantillons de 50 μg à -20 °C pour la MS.</li>
</ol>
2. Préparer l’échantillon pour l’analyse RMN
<ol>
	<li>Préparez une solution tampon de borate de sodium de 2,0 M à un pH de 8,5 po H2O.</li>
	<li>Ajouter 375 μl de solution tampon de borate de sodium 2,0 M dans quatre tubes coniques de 15 ml. Parafilmez les sommets et les trous de perforation. Placer le ballon dans un ballon lyophilisant et congeler l’échantillon.</li>
	<li>Placez l’échantillon congelé sur un lyophilisateur pour le faire sécher. Retirer une fois sec.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette, ajouter 15 ml de D2O dans chaque tube et mélanger.</li>
	<li>Étiquetez trois filtres centrifuges de 4 ml (poids moléculaire de coupure de 3 kDa) avec FLS, LpH et HpH. Ajoutez l’échantillon correspondant dans les tubes filtrants (~500 μl). Ajouter 3,0 ml de tampon de borate de sodium de 50 mM à pH 8,5 dans chaque tube. Fabriquer un tube d’équilibrage pour le troisième tube et concentrer les échantillons à 500 μl à l’aide d’une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe de 35° à 4 °C et 7 500 rcf.</li>
	<li>Videz le piège sous chaque filtre. Ajoutez encore 3,0 ml de tampon aux échantillons et concentrez à nouveau les échantillons à 500 μl. Répétez l’étape 2.5 4 fois.</li>
	<li>À l’aide du dosage de la protéine d’acide bicinchoninique (BCA)36, déterminez la concentration de chaque échantillon. Diluez les échantillons de lysozyme avec un tampon de borate de sodium de 50 mM pour obtenir des échantillons de 150 μM.</li>
	<li>Transfert de 530 μl dans un tube RMN de 5 mm ou de 250 μM dans un tube de 5 mm à susceptibilité magnétique</li>.
	<li>Préparer une solution mère de 80 mM de 1,2-dichloroéthane-13 C2 in D2O. Conserver cette solution mère à -80 °C. Diluer à 24 mM dans 80 μl et transférer dans un tube d’insertion coaxiale pour l’utiliser comme référence dans l’analyse RMN. Analysez les échantillons par RMN. Remarque : Exécutez un HSQC 1D 1 H-13C et intégrez les zones de crête pour chaque résonance. Les zones de pic doivent être les mêmes pour un échantillon entièrement étiqueté.</li>
</ol>
3. Dégradation du lysozyme par l’aminopeptidase
<ol>
	<li>Préparez une solution de lysozyme à 5 mg/ml dans de l’eau ultrapure.</li>
	<li>Ajouter 250 μl de la solution de lysozyme dans un tube à centrifuger propre de 1 ml.</li>
	<li>Ajouter 25 μl d’une solution de tricine 0,1 M, pH 8,0, et 6 μl d’une solution d’Aeromonas proteolytica aminopeptidase de 2,16 μg/ml.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 6 h.</li>
	<li>Ajouter 6 μl supplémentaires de la solution d’aminopeptidase à 2,16 μg/ml à l’échantillon pour un rapport molaire de 1:50 entre l’aminopeptidase et le lysozyme. Incuber pendant 20 heures supplémentaires à 37 °C.</li>
	<li>Dessaler 30 μl de l'échantillon à l'aide d'une colonne de spin en C18 (suivre le protocole du fabricant). Conserver à -20 °C pour l’analyse MALDI MS.</li>
	<li>Préparer l’échantillon de protéines restant pour la RMN comme décrit dans le protocole 2).</li>
</ol>
4. Préparer des échantillons pour la spectrométrie de masse
<ol>
	<li>À l’aide des 50 μg d’échantillon réservés à l’étape 2.3, remplacer le tampon à 100 mM de bicarbonate d’ammonium, pH 8,0 et concentrer à environ 50 μl à l’aide d’un filtre centrifuge de 1 ml (seuil de coupure de 3 kDa en poids moléculaire). Transférez l’échantillon dans un tube à centrifuger de 1 ml et enveloppez-le dans du papier d’aluminium.</li>
	<li>Ajouter 2,0 μl de 500 mM de dithiothréitol pour réduire les liaisons disulfure. Incuber la solution à 60 °C pendant 1 heure.</li>
	<li>Ajouter 2 μl d’iodoacétamide 500 mM fraîchement préparé pour alkyler les groupes thiols. Incuber à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Retirez la feuille et ajoutez 1,0 μl de la solution de dithiothréitol à 500 mM pour éteindre la réaction.</li>
	<li>Ajouter 2,0 μg de trypsine de séquençage pour digérer la protéine. Incuber le mélange à 37 °C pendant 16 à 24 heures.</li>
	<li>Ajoutez du TFA jusqu’à ce que le pH soit inférieur à 2 pour désaltérer la digestion. (Les acides formique et acétique peuvent également être utilisés)</li>
	<li>Dessalez l’échantillon sur une colonne de spin en C18 et éluez la protéine dans 80 % d’acétonitrile / 0,1 % d’AFT. Séchez l’échantillon à l’aide d’un concentrateur sous vide.</li>
	<li>Reconstituer l’échantillon en 5,0 μl d’acétonitrile à 50 % et de TFA à 0,1 % pour l’analyse MALDI MS. Mélanger des volumes égaux de l’échantillon reconstitué et une solution saturée de matrice d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque sur la plaque cible MALDI. Analysez les échantillons sur une MS MALDI. Remarque : Utilisez la MS en tandem pour confirmer l’identité des pics peptidiques. Lisser les spectres de masse et analyser. Pour chaque peptide contenant de la diméthylamine, déterminer l’intensité maximale et la surface maximale de chaque isotope du profil. Calculez le pourcentage de 13C-incorporation comme décrit précédemment34.</li>
</ol>

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</ol>

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L’attribution des signaux RMN de protéines 13C-méthylées réductrices est nécessaire pour utiliser pleinement cette méthode de marquage isotopique. L’utilisation de la spectrométrie de masse pour faciliter l’attribution des signaux RMN par corrélation des données partielles d’incorporation de 13C est une technique prometteuse. L’avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes d’attribution est que seule la séquence d’acides aminés primaire est nécessaire. La méthode d’assignation assistée...

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est un outil précieux d’élucidation de la structure des protéines1. La spectroscopie RMN peut être utilisée pour déterminer la structure de la solution d’une protéine dans son état natif. Pour pallier la faible abondance naturelle d’isotopes magnétiques stables, il est nécessaire d’incorporer le 13C et le 15N dans la protéine d’intérêt. La méthode la plus couramment employée est l’expression recombinante dans un hôte bactérien2-3. Cependant, deux inconvénients de la surexpression de l’hôte bactérien sont qu’elle ne peut pas produire de modifications post-traductionnelles et ne fonctionne pas pour toutes les protéines3-4. Lorsque l’expression bactérienne n’est pas une voie viable pour la production de protéines, la surexpression chez les hôtes non bactériens peut être utilisée, mais le marquage isotopique est difficile et coûteux5. D’autres méthodes d’expression pour incorporer les isotopes 13C et 15N dans les protéines pour l’analyse RMN comprennent des techniques de marquage clairsemé utilisant des précurseurs métaboliques pour le marquage méthylique6 et les acides aminés simples 13C et 15N7-9. Une approche chimique du marquage épars utilisée ici est la réaction réductrice de 13C-méthylation bien établie (Figure 1), où les groupes aminés primaires d’une protéine - la α-amine N-terminale et la lysine, ε-amines à chaîne latérale - sont méthylés. Une fois que les monométhylamines sont formées, l’amine subit facilement une méthylation à nouveau, en raison de la valeur pKa plus élevée, pour former des diméthylamines.
La méthylation réductrice a été introduite pour la première fois comme méthode de modification chimique des protéines par Means et Feeney10. Les avantages de cette réaction sont sa large applicabilité et ses conditions de réactions douces à un pH physiologique tamponné et à de basses températures11,12. En présence de formaldéhyde et d’un agent réducteur, tel que le complexe diméthylamine borane (DMAB), les groupes lysine ε-amino et le groupe N-terminal α-amino sont méthylés sélectivement pour produire des amines diméthylées. Bien que le formaldéhyde soit connu pour réticuler les protéines par la formation de ponts méthylène, ce processus est bloqué par l’agent réducteur13,14.
La méthylation réductrice a été utilisée avec succès pour étudier les protéines avec RMN et cristallographie aux rayons X. La méthylation réductrice est utilisée pour faciliter la cristallisation de protéines autrement intraitables15. Le lysozyme de blanc d’œuf de poule a été la première protéine cristallisée sous sa forme diméthylée. La différence quadratique moyenne entre les atomes lourds dans les structures de lysozyme méthylé et non méthylé est de 0,40 Å16. Cette comparaison démontre que la structure de la protéine peut être maintenue après une méthylation réductrice, ce qui fait de la réaction un outil de marquage viable pour l’élucidation de la structure.
En utilisant du formaldéhyde marqué au carbone 13dans la réaction de méthylation réductrice, des amines 13diméthylées en carbone sont produites. Les 13C-diméthylamines sont des sondes détectables par RMN qui ont été largement utilisées pour étudier la dynamique, la structure et la fonction des protéines. La RMN et la C-méthylation réductrice de la 13ont été utilisées pour étudier les interactions protéine-ligand et protéine-protéine pour le récepteur adrénergique β2 17, la ribonucléase A18, le lysozyme19, la protéine20 du gène FD 5 et le cytochrome C21. De même, les propriétés structurales et fonctionnelles de la ribonucléase C-méthylée A22 réductrice, du lysozyme23, de la protéine24 du gène fd 5, de la ferrédoxine25 de Clostridium pasteurianum, du fragment Fc d’IgG26, de l’apolipoprotéine A-I27 et de la MIP-1α28 La dynamique des 13groupes C-diméthylamino a été étudiée sur la concanavaline A29-30 et la calmoduline31.
Bien que la C-méthylation réductrice 13ait été largement utilisée pour étudier les protéines avec RMN, la méthode de marquage a toujours été limitée par les difficultés d’attribution des résonances RMN26. La plupart des stratégies d’attribution pour les protéines 13C-méthylées réductrices se sont appuyées sur un petit nombre de sites,20,28 propriétés structurelles connues11,19,23,26,31,32. ou modifications génétiques étendues33. Aucune de ces études n’a réussi à attribuer les 13pics de C-diméthylamine, à l’exception de l’étude de la calmoduline, où les pics ont été attribués par mutagénèse dirigée de chaque lysine33. Dans l’étude de la formation des dimères MIP-1α, l’utilisation de la spectrométrie de masse (MS) pour faciliter l’attribution RMN d’amines 13C-méthylées réductrices a été signalée pour la première fois28. La MS par désorption ionisation par ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) MS a été utilisée pour identifier la lysine à l’interface du dimère. Les lysines partiellement méthylées des peptides tryptiques MIP-1α humains ont été identifiées avec la MS et corrélées avec l’apparition de signaux mono- et diméthylamines de la protéine intacte observée dans les spectres RMN 2D 1 H-13C Hsqc28. Notre groupe a approfondi l'utilisation de la SEP et a présenté une méthode d'assignation qui ne nécessite aucune connaissance préalable de la structure ou des propriétés de la protéine autre que la séquence d'acides aminés34. Cette méthode est applicable à la plupart des protéines. Une exception est lorsqu’une protéine a une lysine N-terminale, car le profil isotopique MS de la lysine N-terminale α- et ε-13C-diméthylamines ne peut pas être mesuré indépendamment.
Ici, nous présentons deux méthodes, l’une chimique et l’autre enzymatique, pour identifier la α-diméthylamine N-terminale et les sites ε-diméthylamine à chaîne latérale d’un résidu de lysine N-terminal. La première méthode a été inspirée par Córdova et al.qui a utilisé le pH pour contrôler la sélectivité de l’acétylation des protéines35. La réaction favorise la α-amine N-terminale à faible pH et la chaîne latérale ε-amines à pH élevé, permettant de distinguer les groupes protéiques α- et ε-aminés, dans leurs études, par électrophorèse capillaire35. Nous démontrons comment un pH élevé et bas est utilisé pour modifier le marquage des groupes aminés protéiques en utilisant la réaction réductrice de méthylation 13C et pour permettre l’application de la stratégie d’assignation assistée par MS. La deuxième méthode d’attribution des C-diméthylamines N-terminales α- et ε-13-13tire parti de l’élimination sélective du ou des résidus N-terminaux à l’aide de la recombinante Aeromonas proteolytica aminopeptidase.

<table><tbody><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 ml filtre centrifuge (3k MWCO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC800308 (8pk)</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidase</td><td>Creative Biomart</td><td>Aminopeptidase-86A</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Complexe borane-diméthylamine</td><td>Sigma</td><td>180238</td><td>Préparez une solution fraîche de 1 M avant utilisation.</td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Pancréas bovin</td><td>insuline Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 Colonnes de centrifugation</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dichloroéthane-13C2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>Solution mère de 80 mM stockée à -80 °C. Utilisée comme référence dans les spectres RMN à 24 mM.</td></tr><tr><td>Formaldéhyde (36,5 % en poids/poids)</td><td>Sigma</td><td>33220</td><td>Préparez une solution fraîche de 1 M avant utilisation.</td></tr><tr><td>13C-formaldéhyde (99 %)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-806-1</td><td>Préparez une solution fraîche de 1 M avant utilisation.</td></tr><tr><td>Lysozyme (blanc d’œuf de poule)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium (heptahydraté dibasique)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium (monobasique)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS avec sonde HCN 5922 de 5 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes d’identification des résonances rmn de l’amine 13c-diméthyl n-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique éprouvée pour l’étude de la structure et de la dynamique des protéines. Pour étudier les protéines avec RMN, les isotopes magnétiques stables sont généralement incorporés métaboliquement pour améliorer la sensibilité et permettre l’attribution séquentielle de la résonance. La 13-C-méthylation réductrice est une méthode alternative de marquage pour les protéines qui ne se prêtent pas à la surexpression de l’hôte bactérien, la méthode la plus courante d’incorporation d’isotopes. La 13-C-méthylation réductrice est une réaction chimique réalisée dans des conditions douces qui modifie les principaux groupes aminés d'une protéine (lysine ε-groupes aminés et le groupe N-terminal α-amino) en 13groupes C-diméthylamine. La structure et la fonction de la plupart des protéines ne sont pas modifiées par la modification, ce qui en fait une alternative viable au marquage métabolique. Étant donné que la 13-C-méthylation réductrice ajoute des marqueurs isotopiques clairsemés, les méthodes traditionnelles d’attribution des signaux RMN ne sont pas applicables. Une autre méthode d’assignation utilisant la spectrométrie de masse (MS) pour faciliter l’assignation des signaux RMN de la protéine 13C-diméthylamine a été développée. La méthode repose sur des quantités partielles et différentes de marquage 13C à chaque groupe d’acides aminés primaires. L'une des limites de la méthode survient lorsque le résidu N-terminal de la protéine est une lysine, car les groupes α- et ε-diméthylamino de Lys1 ne peuvent pas être mesurés individuellement avec MS. Pour contourner cette limitation, deux méthodes sont décrites pour identifier la résonance RMN des 13C-diméthylamines associées à la fois à la N-terminale α-amine et à la chaîne latérale ε-amine. Les signaux RMN de la α-diméthylamine N-terminale et de la chaîne latérale ε-diméthylamine du lysozyme de blanc d’œuf de poule, Lys1, sont identifiés dans les spectres hétéronucléaires de cohérence quantique unique 1 H-13C.

Méthylation réductrice et pH
Une réaction de méthylation réductrice chimiosélective au 13C induite par le pH a été démontrée sur la lysozyme. À pH bas, la réaction préfère l’amine α du groupe N-terminal aux amines ε des chaînes latérales, et inversement à pH élevé. En solution, les groupes amines de la protéine existent en équilibre entre l’amine libre et l’acide conjugué, équilibre que l’on peut ajuster en fonction du pH. La plage de pH optimale pour cette réaction dépend du ...

Deux méthodes d’attribution des signaux de résonance magnétique nucléaire α- et ε-diméthylamine d’une lysine N-terminale 13C-méthylée réductrice sont décrites. Une méthode utilise la sélectivité induite par le pH de la réaction de méthylation réductrice, et l’autre utilise l’aminopeptidase pour éliminer sélectivement la lysine N-terminale.

Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

L’objectif global de cette procédure est d’attribuer la résonance RMN du carbone alpha et epsilon. 13 diméthylamine de la lysine terminale, résidu du lysozyme. Ceci est accompli en méthylant d’abord de manière réductrice le lysozyme à pH faible et élevé, avec une quantité sous-géométrique de formaldéhyde de carbone 13.La deuxième étape consiste à méthyler de manière réductrice les échantillons à pH faible et élevé avec une abondance naturelle excessive pour que le formaldéhyde complète la méthylation. La dernière étape consiste à échanger les échantillons méthylés de manière réductrice dans un tampon D deux O pour l’analyse RMN. Dans la deuxième méthode, l’objectif est atteint par la dégradation de l’amino-peptidase d’un échantillon de lysozyme.La deuxième étape consiste à méthyler de manière réductrice l’échantillon de protéine tronquée avec un excès de formaldéhyde de carbone 13, suivi d’un échange de tampon pour l’analyse RMN. En fin de compte, la spectroscopie RMN est utilisée pour montrer l’absence de résonance méthyle du carbone 13 pour effectuer des affectations. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet d’attribuer sans

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Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyle N-terminale sur des protéines méthylées réductivement

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Détermination de la structure et de la coordination de complexes peptides-métalliques à l’aide de la RMN 1D et 2D 1H

Découvrez deux méthodes d'attribution des résonances RMN de la lysine N-terminale méthylée par réduction sur la lysozyme, utilisant la sélectivité pH et l'aminopeptidase. Ces techniques avancent l'analyse structurale des protéines.

Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice (Vidéo) | JoVE Journal

Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine ¹³C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

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