Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

L’objectif global de cette procédure est d’attribuer la résonance RMN du carbone alpha et epsilon. 13 diméthylamine de la lysine terminale, résidu du lysozyme. Ceci est accompli en méthylant d’abord de manière réductrice le lysozyme à pH faible et élevé, avec une quantité sous-géométrique de formaldéhyde de carbone 13

La deuxième étape consiste à méthyler de manière réductrice les échantillons à pH faible et élevé avec une abondance naturelle excessive pour que le formaldéhyde complète la méthylation. La dernière étape consiste à échanger les échantillons méthylés de manière réductrice dans un tampon D deux O pour l’analyse RMN. Dans la deuxième méthode, l’objectif est atteint par la dégradation de l’amino-peptidase d’un échantillon de lysozyme.

La deuxième étape consiste à méthyler de manière réductrice l’échantillon de protéine tronquée avec un excès de formaldéhyde de carbone 13, suivi d’un échange de tampon pour l’analyse RMN. En fin de compte, la spectroscopie RMN est utilisée pour montrer l’absence de résonance méthyle du carbone 13 pour effectuer des affectations. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet d’attribuer sans ambiguïté les résonances alpha et SSON diméthyl lamine et ML de la lysine interne d’une protéine Marquage trois microtubes à centrifuger d’un millilitre avec F-L-S-L-P-H et HPH dissoudre trois échantillons de lysozyme dans une solution tampon préalablement préparée au pH six, 7,5 et 10 pour obtenir une concentration finale de cinq milligrammes par millilitre.

Couvrez les tubes d’une feuille d’aluminium pour les protéger de la dégradation due à l’exposition à la lumière. Ensuite, ajoutez 6,1 microlitres d’une solution complexe de forage de diméthylamine molaire préalablement préparée dans le tube FLS et 3,2 microlitres de la même solution dans les tubes LPH et HPH. Après avoir doucement tourbillonné les mélanges, ajoutez 12,3 microlitres d’une solution molaire de formaldéhyde de carbone 13 préalablement préparée à l’échantillon FLS et 6,1 microlitres de la même solution aux échantillons L-P-H-N-H-P-H.

Agitez les mélanges réactionnels à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Répétez les étapes précédentes en ajoutant les mêmes aliquotes de DMAB et de formaldéhyde de carbone 13 dans les tubes correspondants. Agiter les mélanges réactionnels pendant une nuit à quatre degrés Celsius pendant un temps de réaction total de 18 à 24 heures après l’agitation, remplacer le tampon de chaque échantillon par trois millilitres de tampon phosphate à pH 7,5 pour éliminer l’excès de réactifs et de produits secondaires à l’aide d’un filtre centrifuge à une coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons, concentrer les échantillons à 500 microlitres à l’aide d’une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe de 35 degrés à quatre degrés Celsius et 7, 500 RCF.

Répétez les étapes précédentes deux fois par la suite. Couvrez les tubes d’échantillon partiellement étiquetés avec une feuille d’aluminium et ajoutez-y 6,1 microlitres d’une solution DMAB molaire fraîchement préparée. Une fois que les échantillons ont été vortexés, ajoutez 12,3 microlitres d’une solution de formaldéhyde d’abondance naturelle d’une molaire fraîchement préparée dans les tubes.

Agitez les mélanges réactionnels à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Ajoutez les mêmes aliquotes de DMAB et de formaldéhyde d’abondance naturelle qu’à l’étape précédente, et agitez les mélanges réactionnels pendant une nuit à quatre degrés Celsius pour un temps de réaction total de 18 à 24 heures après l’échange de tampon avec un tampon de phosphate de sodium de 50 millimolaires. Transférez 10 aliquotes de microlitres de chaque échantillon dans des tubes de micro-centrifugeuse propres et stockez les échantillons à moins 20 degrés Celsius pour l’analyse MALDI MS.

Ensuite, ajoutez 375 microlitres d’une solution tampon de borate de sodium à deux molaires préalablement préparée dans quatre tubes coniques de 15 millilitres. Para filme le haut des tubes et perce des trous à travers le film para. Placez les tubes dans une fiole lyophilisée et congelez l’échantillon.

Une fois les échantillons congelés, placer une fiole sur un lyophilisateur pour sécher après avoir retiré l’échantillon de la pipette lyophilisateur 15 millilitres de D deux O dans chaque tube et mélanger en suivant cette étiquette, trois tubes coniques de quatre millilitres contenant des filtres centrifuges avec F-L-S-L-P-H et HPH. Ajoutez environ 500 microlitres de chaque échantillon dans les tubes filtrants correspondants. Ajoutez ensuite trois millilitres de tampon de sodium de 50 millimolaires.

Ajouter un pH de 8,5 dans chaque tube. Concentrez les échantillons à 500 microlitres à l’aide d’une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe de 35 degrés à quatre degrés Celsius et 7 500 RCF. Après avoir vidé le piège sous chaque filtre, ajoutez trois millilitres supplémentaires de tampon aux échantillons et concentrez-les à 500 microlitres.

Répétez les étapes précédentes quatre fois à l’aide du dosage des protéines d’acide bissy. Déterminez la concentration de chaque échantillon. Diluez les échantillons de lysozyme avec un tampon de vide sodique de 50 millimolaires pour obtenir une concentration finale de 150 micromolaires.

Ensuite, transférez 530 microlitres de chaque échantillon dans un tube RMN de cinq millimètres. Préparez ensuite une solution mère de 80 millimolaires de carbone 13 marquée un deux DI CHLORO éthane dans D deux O. Diluez la solution à 24 millimolaires avec D deux O, puis transférez-la dans un tube d’insertion coaxiale pour l’utiliser comme référence RMN. Après avoir couru un proton carbone 1D H-S-Q-C-N-M-R intégrer les zones de pic pour chaque résonance.

Préparez une solution de lysozyme de cinq milligrammes par millilitre dans de l’eau ultrapure. Transférez 250 microlitres de la solution de lysozyme dans un tube à centrifuger propre d’un millilitre. Ajoutez ensuite 25 microlitres d’une solution de 0,1 molaire à pH huit et six microlitres d’un deux virgule 16 microgrammes par millilitre.

Une solution d’amino peptidase protéolytique romanis dans le tube de centrifugation. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant six heures. Après l’incubation, ajoutez six microlitres supplémentaires de la solution d’aminopeptidase à l’échantillon pour obtenir un rapport de une molaire à 50 molaires d’aminopeptidase à incuber pendant 20 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius.

Ensuite, DESALT 30 microlitres de l’échantillon à l’aide d’une colonne de spin C 18 et éluer l’échantillon dans un essai à 80 % d’acédonite par 0,1 % TFA stocke l’échantillon à moins 20 degrés Celsius. Pour l’analyse maldi MS, préparez l’échantillon de protéine restant pour la RMN comme décrit précédemment, Une réaction de méthylation réductrice sélective du carbone 13 induite par chimiothérapie induite par le pH a été démontrée sur le lysozyme à faible pH. La réaction préfère l’alphaamine terminale terminale à l’amine epsilon à chaîne latérale et vice versa à pH élevé, comme illustré dans les spectres RMN ici.

Le pic sept est absent pour l’échantillon de lysozyme qui a réagi à un pH de 10, ce qui indique que les pics un à six appartiennent aux groupes amino epsilon diméthyle et que le pic sept est le groupe amino alpha diméthyle terminal. Alpha Amin privilégie le carbone réducteur. La méthylation de la 13 à pH six a été observée lorsque la quantité de formaldéhyde de carbone 13 utilisée a été réduite à un rapport molaire de deux à sept, et que l’échantillon n’a pas réagi davantage avec le formaldéhyde d’abondance naturelle Comme illustré ici, la méthylation à faible pH est un mélange de monométhylamines et de diméthylamines.

Trois groupes aminés présentent une méthylation faible du carbone 13, ce qui indique que ces groupes ont réagi plus rapidement que les groupes présentant du carbone. 13 monométhyles des trois amines diméthyles de carbone 13. Le pic sept a l’intensité la plus élevée et a été attribué au groupe N termina alpha diméthylamine, corroborant l’attribution du pic sept.

L’utilisation de l’échantillon a réagi à un pH élevé avec la capacité de modifier le taux de méthylation réductrice du groupe alpha amino N-terminal. La méthode assistée par MS pour l’affectation du résident RMN peut être appliquée. L’échantillon de lysozyme qui a été méthylé par réduction au carbone 13 à un pH de 10 a été digéré avec de la trypsine et analysé avec maldi TOF MS, car le groupe alpha-amino n’était pas méthylé par réduction au carbone 13

Dans ces conditions, le profil isotopique MS du peptide N terminal tétraméthylé peut être utilisé pour quantifier le pourcentage de carbone 13 incorporé dans le groupe amino epsilon diméthyle N terminal. Le peptide terminal N méthylé DIM 6 6 6 2 marqué au carbone 13 a donné un pourcentage échelonné de carbone. 13 incorporation de 27 %L’analyse RMN du même échantillon de lysozyme a donné un pourcentage d’incorporation de carbone 13 de 33 % pour le pic six, indiquant que le pic six est l’extrémité terminale de la lysine epsilon carbone 13 diméthylamine Maldi, les spectres de masse TOF des échantillons de lysozyme non traités et traités à l’amino-peptidase sont illustrés ici.

L’insuline, qui a été utilisée comme contrôle positif, montre un changement vers un rapport de charge moyenne inférieur par rapport à sa forme native de 5731,2. Le lysozyme traité montre un décalage de 14305.8 à 13930.5, correspondant à la perte des trois premiers résidus terminaux finaux de lysozyme, de lysine, de valine et de phénylalanine. Voici les spectres RMN des échantillons de lysozyme méthylé au carbone 13 non traités et traités à l’aminopeptidase par rapport au spectre contrôlé, le spectre de l’échantillon traité à l’aminopeptidase montre une diminution de l’intensité pour les pics six et sept et un pic supplémentaire marqué sept A À partir de ces données, les pics six et sept peuvent être attribués par paires comme lysine, alpha et epsilon diméthylamine.

Avant de tenter cette procédure, il est important de tenir compte de la solubilité de votre protéine, des différents phs et d’ajuster le protocole en conséquence.