Name: La supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés dans Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Découvrez la supplémentation en acides gras polyinsaturés chez Caenorhabditis elegans pour étudier leur rôle physiologique. Cette méthode permet d'analyser les effets sur la stérilité et la composition lipidique par chromatographie gazeuse.

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Nous remercions Chris Webster pour effectuer les expériences préliminaires de la figure 3 des résultats représentatifs et Jason Watts et Chris Webster des commentaires utiles sur le manuscrit. Le financement de cette étude a été fourni par une subvention des National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) à JLW. Certaines souches de nématodes utilisés dans ce travail ont été fournies par le Centre de Génétique Caenorhabditis, qui est financé par le Bureau NIH des programmes d&#39;infrastructure de recherche (P40 de OD010440).

Les acides gras polyinsaturés sont sensibles à la chaleur, la lumière et l&#39;oxygène. Par conséquent, des précautions doivent être prises lors de la préparation de plaques de supplémentation d&#39;acides gras tels que les acides gras ne sont pas exposés à une chaleur excessive et de la lumière. NGM support contenant 0,1% de Tergitol (NP-40) sont passés à l&#39;autoclave et partiellement refroidies, après quoi les sels de sodium d&#39;acides gras sont ajoutés sous agitation constante. Les plaques sont laissées à sécher à l&#39;obscurité. L&#39;absorption des acides gras par C. elegans cultivé sur ces plaques peut alors être surveillé par Chromatographie en phase gazeuse. Une. Préparation des acides gras Supplement médias <ol><li> Mesurer composants multimédia dans un ballon de taille appropriée. Par 1 L, ajouter 17 g de Bacto-agar, 2,5 g de tryptone, 3 g de NaCl, 1 ml 5 mg / ml de cholestérol dissous dans de l&#39;éthanol, et 10 ml de 10% Tergitol dissous dans l&#39;eau. </li><li> Ajouter 80% du volume final souhaité de l&#39;eau Millipore et l&#39;autoclave les médias ainsi que des bouteilles de verre vide (égal au nombre de différentsLes concentrations d&#39;acides gras à tester), ainsi que des éprouvettes graduées appropriées. </li><li> Médias refroidir dans un bain-marie réglé à 55 ° C. Bien que le milieu est refroidit à préparer la solution de travail de réserve de sel de sodium d&#39;acide gras en brisant ouvert le flacon de verre, en utilisant des mesures de sécurité et d&#39;assurer des particules de verre ne se mélangent pas avec les acides gras. Peser suffisamment d&#39;acide gras pour faire un stock de travail 100 mM. </li><li> Porter la solution d&#39;acide gras à une concentration finale de 100 mM avec de l&#39;eau purifiée. Dissoudre entièrement le sel de sodium d&#39;acide gras prend généralement environ 20 à 30 min. Purger le stock de travail d&#39;acide gras avec de l&#39;argon ou de l&#39;azote, parce que le contact avec un gaz inerte empêche l&#39;oxydation. Boucher le flacon et stocker le stock de travail dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce que les médias aient refroidi. </li><li> (Facultatif) Si ARNi médias est souhaitée, de mesurer l&#39;ampicilline et isopropilene β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) solutions ici. </li><li> Lorsque la gélose est refroidie à 55 ° C, ajouter par 1 L: 1ml de 1 M MgSO 4, 1 ml de 1 M de CaCl2, et de 25 ml de tampon phosphate (108,3 g KH 2 PO 4 et de 35,6 g de K 2 HPO 4 pour 1 L à l&#39;autoclave). Ajouter le filtre stérilisé ampicilline et solutions IPTG si la fabrication de plaques de RNAi. Pour tous les types de plaques, ajouter de l&#39;eau stérile pour porter le volume de médias final à 1 L. </li><li> Près d&#39;une flamme, transférer des médias à une autoclave et taille appropriée éprouvette graduée puis ajouter de l&#39;eau chaude stérile au volume désiré. Transfert médias retour au flacon initial et mélanger en remuant. </li><li> Près d&#39;une flamme, transférer médias dans un certain nombre de bouteilles égal au nombre de concentrations à tester en mesurant avec un autoclave et de taille appropriée éprouvette graduée. Maintenir les médias aliquotés comme liquide en utilisant un bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que le stock de travail d&#39;acide gras a entièrement dissous. </li><li> Placez une bouteille sur une plaque d&#39;agitation et remuer jusqu&#39;à ce que le support est chaud au toucher, mais pas chaud. Assurez-vous de vous laisser assez detemps à remuer dans la solution mère d&#39;acide gras et versez plaques devant les médias commence à se solidifier. Si la plaque d&#39;agitation a le contrôle de la température, réglez-le à 55 ° C. </li><li> Diluer le stock de travail d&#39;acide gras de 100 mM dans le milieu de la concentration finale souhaitée. médias Remuer jusqu&#39;à ce que le précipité blanc est en solution (environ 1 min). Les médias peuvent encore être légèrement nuageux par la suite. </li><li> (Facultatif) Si l&#39;on souhaite ARNi médias retenir l&#39;ampicilline à 0,1 mg / ml et 2 mM d&#39;IPTG à une concentration finale. </li><li> Verser médias utilisant une aide de la pipette automatique et une aiguille stérile de 25 ml pipette, en ajoutant 8 ml de milieu par 60 mm plaque ou 25 ml de milieu par plaque de 100 mm. Répéter addition d&#39;acide gras et de la plaque de coulée étapes pour les bouteilles restantes. </li><li> Après solidification de la gélose, couvrir les plaques d&#39;acides gras supplémenté avec une boîte ou un magasin à la température ambiante dans un tiroir bien ventilé à l&#39;abri de l&#39;oxydation de la lumière. </li><li> Graine E. coli OP50 sur des plaques, deux jours après les plaques ont séchées.Pour les plaques de 60 mm, une pipette 300 ul d&#39;une culture d&#39;une nuit OP50 (cultivée à 37 ° C). Si les plaques d&#39;ARNi ont été versés, semences avec 300 pi de bactéries ARNi après les plaques ont séché pendant quatre jours. Plate temps de séchage peut être nécessaire de modifier en raison des différences d&#39;humidité dans divers environnements de laboratoire. </li><li> Incuber les plaques dans un environnement sombre à la température ambiante pendant la pelouse bactérienne est le séchage. </li></ol> 2. Induire la destruction des cellules germinales par la supplémentation de DGLA <ol><li> C. elegans cultivées sur des plaques contenant mM DGLA 0,3 (20h03 n-6) deviennent stériles à cause de la destruction des cellules germinales dans les deux nématodes de la scène et adultes larvaires. <ol><li> Préparer une population synchronisée des larves L1 en traitant hermaphrodites gravides avec une solution d&#39;hypochlorite alcalin (pour une solution à 10 ml: 0,5 ml de NaOH 5M, 2,5 ml d&#39;eau de Javel, et 7 ml H 2 O). Secouez délicatement les hermaphrodites gravides dans cette solution jusqu&#39;à ce que le ver adultes dissoudre. Les œufs sont conservés, et peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation à faible vitesse. </li><li> Laver la préparation d&#39;oeuf 3 fois dans du tampon M9 (3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O de 1 L. Ajouter MgSO 4, après passage à l&#39;autoclave). Afin de fournir suffisamment d&#39;oxygène, de remettre en suspension les oeufs dans un tube en plastique de 15 ml à un volume final de 5 ml de tampon M9 et de la roche sur un agitateur pendant une nuit. </li><li> Larves L1 doit être ajouté aux plaques supplémenté deux jours après l&#39;ensemencement avec OP50, ou un jour après l&#39;étalement des bactéries d&#39;ARNi. Incuber les vers à 20 ° C pendant trois jours, ou jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade adulte. </li></ol></li><li> Les vers adultes peuvent être marqués de la stérilité en utilisant un microscope à dissection avec un grossissement assez haut pour visualiser le développement des embryons dans l&#39;utérus. Succès la perte de cellules germinales apparaît comme un vide de l&#39;utérus clair des œufs. </li><li> Les vers peuvent également être marqués par la fixation et coloration avec l&#39;acide nucléique d&#39;uncid colorant diamindinophenylindole (DAPI), ce qui facilite la visualisation des noyaux dans les cellules germinales et les embryons en développement. Une tache de DAPI rapide est réalisé par la cueillette vers dans une goutte de tampon M9 sur un verre de montre 9. <ol><li> Flood verre de montre avec 1 ml de 0,2 ng / m. DAPI dans une solution d&#39;éthanol à 95%, laisser reposer pendant environ 5 min. </li><li> Choisissez vers dans une goutte de Vectashield sur une lame, puis couvrir avec une lamelle. </li><li> lamelle de Seal et conserver à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant une nuit pour la coloration optimale, mais les diapositives peuvent également être consulté immédiatement. Note pour la présence ou l&#39;absence de noyaux de cellules germinales à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence équipé d&#39;une lampe UV et filtre. </li></ol></li></ol> 3. Confirmant acides gras absorption par chromatographie en phase gazeuse Composition de C d&#39;acides gras globale elegans peuvent être déterminées par la production d&#39;esters méthyliques d&#39;acides gras (FAME) qui sont ensuite séparés et quantifiés à l&#39;aide de gaz chromatography 4. <ol><li> Recueillir 500-1000 vers adultes en les lavant hors des plaques avec de l&#39;eau et de transférer à un 13 mm x 100 mm tube supérieur de vis de verre silanisée. </li><li> Laissez vers déposent par gravité, puis retirez autant d&#39;eau que possible avec une pipette Pasteur en verre. </li><li> Laver avec de l&#39;eau une fois vers, puis retirez à nouveau autant d&#39;eau que possible. </li><li> FAMEs sont formées en ajoutant 1 ml de 2,5% de H 2 SO 4 dans le méthanol, puis chauffage à 70 ° C pendant 1 heure dans un bain d&#39;eau. </li><li> Enlever les tubes du bain d&#39;eau et de refroidir pendant 1 min. </li><li> Extrait FAMEs en ajoutant 1,5 ml d&#39;eau et 0,25 ml d&#39;hexane. </li><li> tubes de reboucher et agiter vigoureusement. </li><li> Tubes à centrifuger dans une centrifugeuse clinique de table pendant 1 min à vitesse maximale pour séparer l&#39;hexane de solvant aqueux. </li><li> Transfert hexane (couche supérieure) pour un insert GC flacon dans un flacon de GC, en faisant attention à ne pas transférer de la phase aqueuse. Pour un GCnalyse, 1-2 pi de FAME à l&#39;hexane est injecté sur une colonne de chromatographie en phase gazeuse capillaire polaire adapté pour l&#39;analyse des FAME. Injecteur de GC Agilent 7890 est fixée à 250 ° C, avec un débit de 1,4 ml / min, et le four de GC est programmé pour une température initiale de 130 ° C qui est maintenue pendant 1 min. Par la suite, la température est en rampe de 10 ° C / min jusqu&#39;à 190 ° C, puis de nouveau en rampe à 5 ° C / min jusqu&#39;à 210 ° C et maintenue pendant 1 min. </li><li> Pour faire en sorte que l&#39;absorption de DGLA a eu lieu, l&#39;analyse FAME de détection de ionisation de flamme (FID) ou la spectrométrie de masse (MS) la détection, en utilisant des étalons authentiques pour l&#39;identification de l&#39;C. elegans acides gras. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ici, nous décrivons une méthode de supplémentation de C. elegans avec des acides gras insaturés alimentaires. Comme mentionné ci-dessus, il faut prendre soin dans la préparation de plaques PUFA supplémenté en raison de la nature réactive des doubles liaisons dans les acides gras polyinsaturés des causes de ces acides gras pour être sensible à l&#39;oxydation par la chaleur et de la lumière 11. Pour éviter l&#39;oxydation, il est important d&#39;ajouter le PUFA dans le milieu de gélose de liquide aprè...

Les acides gras sont des composants structurels essentiels des membranes ainsi que des molécules de stockage d&#39;énergie efficace. En outre, les acides gras peuvent être clivés à partir de membranes cellulaires par des lipases et peuvent être modifiées par voie enzymatique pour produire des effecteurs de signalisation 1. D&#39;origine naturelle des acides gras polyinsaturés (AGPI) contiennent deux ou plusieurs doubles liaisons cis. Les acides gras oméga-3 acides gras et les acides gras oméga-6 se distinguent l&#39;une de l&#39;autre sur la base des positions des doubles liaisons par rapport à l&#39;extrémité méthyle de l&#39;acide gras. Une alimentation saine exigent à la fois acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras. Cependant, les régimes occidentaux sont particulièrement riches en acides gras oméga-6 acides gras et pauvres en oméga-3 acides gras. Une haute teneur en oméga-6 et oméga-3 ratio d&#39;acide gras est associée à un risque accru de maladies cardiovasculaires et inflammatoires, cependant, les fonctions bénéfiques et nuisibles précis d&#39;acides gras spécifiques ne sont pas bien comprises 2. Les ascaris elega Caenorhabditisns est utile pour étudier la fonction des acides gras, car il synthétise toutes les enzymes nécessaires pour produire une gamme d&#39;acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras, y compris une oméga 3 désaturase, une activité qui est absente dans la plupart des animaux 3,4. Mutants dépourvus enzymes désaturase d&#39;acide gras ne parviennent pas à produire des PUFA spécifiques, conduisant à une série de défauts de développement et neurologiques 4-6. Pour étudier les effets physiologiques des acides gras alimentaires, nous avons développé un dosage biochimique compatible avec l&#39;analyse génétique en utilisant les deux techniques knock-down ARNi mutant et C. elegans. La supplémentation avec des PUFA spécifiques est obtenue en ajoutant une solution de sel de sodium d&#39;acide gras dans le milieu d&#39;agar avant la coulée. Cela se traduit par l&#39;absorption par le PUFA E. source de nourriture coli, où il s&#39;accumule dans les membranes bactériennes. C. elegans ingèrent les bactéries contenant des AGPI, et ce complément alimentaire est suffisante pour sauver le défectueuxts de mutants déficients en AGPI. La supplémentation de la plupart des acides gras n&#39;a pas d&#39;effets néfastes sur les animaux de type sauvage, cependant, oméga-6 acides gras spécifiques, en particulier l&#39;acide dihomo-gamma-linolénique (DGLA, 20:03 n-6) causer une destruction permanente de C. elegans cellules germinales 7,8. Chromatographie en phase gazeuse est utilisé pour surveiller l&#39;absorption de l&#39;acide gras complétée dans la source de nourriture bactérienne (soit OP50 ou HT115), ainsi que dans les nématodes. L&#39;addition du Tergitol de détergent (NP-40) dans le support permet d&#39;obtenir une distribution uniforme des acides gras à travers toute la plaque et l&#39;utilisation plus efficace des acides gras par le E. coli et les nématodes. Nous avons découvert que les acides gras insaturés sont facilement absorbés par les bactéries et C. elegans, mais l&#39;absorption d&#39;acides gras saturés est beaucoup moins efficace. Cet article décrit étape par étape comment compléter les médias agar avec des acides gras, ainsi que la façon de contrôler l&#39;absorption des acides gras dans le ee nématode par chromatographie en phase gazeuse.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>(5 mg/mL dans de l’éthanol)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>Dihomogamma linolénate de sodium</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td> <td>Millipore stérile chaude</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau stérile pour la collecte des</td><td></td><td></td><td></td>vers</tr><tr><td>Eau sans nucléases pour solution mère DGLA</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml dans l’eau (pour les plaques ARNi)</td></tr><tr><td>Isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>1 M dans l’eau (pour les plaques ARNi)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>diamindinophénylindole (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles en verre autoclavables avec agitateurs</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre gradué en verre autoclavable</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’agitation</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie à 55+ &deg ; C</td><td>Precision Scientific Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon à vis Flacon en verre brun</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr>Réservoir <td></td><td></td><td></td>de<td>gaz argon</td></tr><tr><td>Aide à la pipette automatisée</td><td>Pipette-Aid</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques stériles (25 ml)</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Bec Bunsen</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Leica</td><td></td><td></td>TLB3000</tr><tr><td>Tube en verre silanisé</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>pour la dérivation des EMAG</td></tr><tr><td>Bouchons à vis PTFE Kimble-Chase</td><td></td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table clinique</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Flacon à sertir</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC Insert de flacon</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC Bouchon de flacon</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>Chromatographe en phase gazeuse</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de spectrométrie de masse</td><td>Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>Colonne pour chromatographie en phase gazeuse</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m x 0,25 mm colonne capillaire en silice fondue</td></tr></tbody></table>

la supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés dans<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Les acides gras sont essentiels pour de nombreuses fonctions cellulaires. Ils servent molécules de stockage d&#39;énergie efficaces, forment le noyau hydrophobe des membranes, et de participer à diverses voies de signalisation. Caenorhabditis elegans synthétise toutes les enzymes nécessaires pour produire une gamme d&#39;acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras. Ceci, combiné avec la simple anatomie et la gamme d&#39;outils génétiques disponibles, en font un modèle intéressant pour étudier la fonction des acides gras. Afin d&#39;étudier les voies génétiques qui assurent la médiation des effets physiologiques des acides gras alimentaires, nous avons mis au point un procédé pour compléter l&#39;C. alimentation elegans avec des acides gras insaturés. La supplémentation est un moyen efficace pour modifier la composition en acides gras de vers et peut également être utilisé pour sauver les défauts de mutants déficients en acides gras. Notre méthode utilise la croissance à moyen agar nématode (NGM) additionné de sels gras de acidsodium. Les acides gras présents dans les plaques deviennent incorporation complétéested dans les membranes de la source d&#39;alimentation bactérienne, qui est ensuite reprise par le C. elegans qui se nourrissent de bactéries complétées. Nous décrivons également un protocole de Chromatographie en phase gazeuse pour contrôler les changements dans la composition d&#39;acide gras qui se produisent dans les vers complétés. C&#39;est un moyen efficace de compléter les régimes de grandes et de petites populations de C. elegans, permettant une gamme d&#39;applications de cette méthode.

La supplémentation de la C. elegans alimentation est limitée par la capacité de la source d&#39;alimentation à l&#39;absorption de bactéries et d&#39;incorporer des acides gras dans la membrane bactérienne. Pour déterminer la capacité de E. coli OP50 à assimiler différents acides gras dans ses membranes, OP50 a été plaqué sur des supports sans supplément, 0,1 mM et les concentrations mM 0,3 d&#39;acide stéarique (18h00), l&#39;oléate de sodium (18:1 n-9), et le sodium DGLA (20 : 3n-6). Les plaques ont ...

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; est un modèle utile pour explorer les fonctions d&#39;acides gras polyinsaturés dans le développement et la physiologie. Ce protocole décrit une méthode efficace de compléter la &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; alimentation avec des acides gras polyinsaturés.

La supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser des moyens diététiques pour modifier la composition en acides gras de l’élégance marine afin d’étudier la fonction et la régulation des acides gras. Ceci est réalisé en cultivant la source de nourriture du nématode en présence d’acides gras insaturés. Ensuite, l’élégance de la mer est nourrie avec les bactéries supplémentées, ce qui permet l’absorption de l’acide gras et son incorporation dans le ver.Les lipides changent alors dans l’élégance marine. La composition en acides gras est confirmée par chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse. Enfin, après s’être nourris d’acides gras insaturés, les vers sont marqués pour leur stérilité.On obtient des résultats qui montrent les effets physiologiques de la modification de la composition en acides gras par le développement, le comportement et les changements dans l’expression des gènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’élégance marine, du développement et de la physiologie, car nous pouvons utiliser à la fois la manipulation génétique et les contributions diététiques pour modifier la composition en acides gras et surveiller les conséquences. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode doivent être prudentes et prudentes, car il est difficile d’obtenir des résultats cohérents en raison de la sensibilité des acides gras insaturés à l’oxygène et aux températures élevées.Pour préparer un litre de milieu supplémenté en acides gras, mesurez les composants suivants dans un flacon. Ajoutez de l’eau milliporeuse jusqu’à 800 millilitres et autoclavez le milieu avec une bouteille en verre vide pour chaque concentration d’acide gras à tester, ainsi que des cylindres gradués appropriés pendant que le milieu refroidit à 55 degrés Celsius. Préparez la solution mère de travail du sel de sodium d’acide gras en ouvrant soigneusement le flacon en verre afin de ne pas introduire de particules de verre dans la poudre et en pesant suffisamment pour faire une solution mère de 100 millimolaires, ajoutez la quantité nécessaire d’eau purifiée.Ensuite, à l’aide d’argon ou d’azote gazeux, purgez la solution pour prévenir l’oxydation des acides gras. Ensuite, bouchez le flacon et conservez le flacon dans l’obscurité pendant que l’acide gras, le sel de sodium, se dissout. Lorsque l’agri s’est refroidi à 55 degrés Celsius à la suivante, puis près d’une flamme, transférez la solution dans un cylindre gradué stérile.Avant d’ajouter de l’eau stérile jusqu’à un litre, transférez le milieu dans le ballon et continuez à mélanger. À l’aide d’un cylindre gradué stérile, transvaser une aliquote de milieu dans un flacon autoclavé pour chaque concentration d’acide gras à tester. Ensuite, gardez les bouteilles au chaud sur une plaque à mélanger.Incorporer la concentration appropriée de solution mère d’acides gras avant d’utiliser une pipette stérile de 25 millilitres pour verser les plaques une fois que les plaques se sont solidifiées, et conservez-les à température ambiante dans un endroit bien contrôlé et dans l’obscurité. Deux jours plus tard, utilisez e coli OP 50 pour ensemencer les plaques, puis incubez les plaques dans un environnement sombre à température ambiante pendant que la pelouse bactérienne sèche. Préparez une population synchronisée de larves de L one en traitant Ravi Hermaphrodites avec une solution d’hypochlorite alcaline.Bercez doucement les hermaphrodites GR dans cette solution jusqu’à ce que les vers adultes se dissolvent. Puis centrifuger à basse vitesse pour granuler les œufs. Utilisez le tampon M nine pour laver les œufs trois fois.Ensuite, dans un tube de 15 millilitres, mettez-les en suspension dans cinq millilitres de tampon M nine et basculez-les pendant la nuit. Ajoutez les larves L one à des plaques ensemencées OP 50 qui ont été complétées avec 0,3 millimolaire d’acide di homo gammalin ou DGLA et incubez-les à 20 degrés Celsius pendant trois jours ou jusqu’à ce que les larves atteignent le stade adulte. Utilisez un microscope à dissection pour évaluer la stérilité des vers adultes.Une perte de germes réussie se manifestera par un utérus clair et dépourvu d’ovules. Vous pouvez également marquer les vers en les choisissant dans une goutte de tampon M neuf sur un verre de montre. Ensuite, utilisez un millilitre de solution de dappy de 0,2 nanogramme par millilitre pour inonder le verre de la montre et incuber pendant environ cinq minutes.Après l’incubation, prélevez les vers dans une goutte de milieu de montage sur une lame avant de les recouvrir d’une lamelle, scellez la lamelle et stockez-la à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant la nuit ou observez-la immédiatement sous un microscope fluorescent pour produire des esters méthyliques d’acides gras ou des fames. Pour quantifier l’absorption d’acides gras, prélevez 500 à 1000 vers adultes en utilisant de l’eau pour les laver des plaques et les transférer sur des vers siliconés. Tubes à vis en verre de 13 x 100 millimètres.Laissez les vers se déposer par gravité, puis utilisez un verre au-delà de la pipette pour retirer autant d’eau que possible. Ajoutez un millilitre d’acide sulfurique à 2,5 % dans du méthanol et chauffez les tubes dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant une heure après refroidissement pendant une minute sous le capot, extrayez les cadres en ajoutant 1,5 millilitre d’eau et 0,25 millilitre d’hexane. Rebouchez les tubes et secouez vigoureusement.Ensuite, centrifugez les tubes dans une centrifugeuse clinique de table pendant une minute pour séparer l’hexane du solvant aqueux. Transférez la couche supérieure d’hexane dans une chromatographie en phase gazeuse ou un insert de flacon GC à l’intérieur d’un flacon GC. Pour l’analyse par gc, injecter un à deux microlitres de fames sur une colonne de chromatographie en phase gazeuse capillaire polaire adaptée à l’analyse de fame.Réglez l’injecteur à 250 degrés Celsius avec un débit de 1,4 millilitre par minute. Programmez le four pour une température initiale de 130 degrés Celsius maintenue pendant une minute. Ensuite, augmentez la température de 10 degrés Celsius par minute jusqu’à ce qu’elle atteigne 190 degrés Celsius, puis augmentez-la à nouveau à cinq degrés Celsius par minute jusqu’à 210 degrés Celsius, puis maintenez pendant une minute supplémentaire pour vous assurer que l’absorption de DGLA a eu lieu.Analysez les membrures par détection par ionisation de flamme ou par spectrométrie de masse ou détection MS en utilisant des normes authentiques pour l’identification de l’élégance de la mer. La supplémentation en acides gras du régime d’élégance marine est limitée par la capacité de la source de nourriture bactérienne à absorber et à incorporer les acides gras dans la membrane bactérienne pour déterminer la capacité d’E coli OP 50 à assimiler divers acides gras dans ses membranes. L’OP 50 a été appliqué sur un milieu sans supplément, avec des concentrations de 0,1 millimolaire et de 0,3 millimolaire d’acide stérique, de sodium ate et de sodium DGLA, comme le montre cette figure. L’analyse de l’OPG par le GCMS démontre que les acides gras insaturés, y compris l’oléate et le DGLA, s’incorporent à l’OP 50 à des concentrations plus élevées que l’acide stérique, un acide gras saturé.De plus, la mesure des quantités d’acides gras chez les vers adultes révèle que la supplémentation en acides gras saturés n’a aucun effet sur la quantité relative d’acides gras saturés dans les tissus des vers. Cependant, la supplémentation en acides gras insaturés a augmenté les quantités relatives de ces graisses prises ensemble. Ces données indiquent que l’accumulation relative d’acides gras supplémentés dans l’élégance est directement corrélée à l’accumulation relative d’acides gras dans l’alimentation.Comme nous l’avons démontré précédemment, ce graphique illustre la relation dose-réponse de l’induction de la stérilité par DGLA dans l’élégance marine. La concentration de DGLA dans les lipides des vers, dans lesquels 50 % de la population sera stérile, est d’environ 12 %Et il est intéressant de noter que la réponse à DGLA peut être modifiée par des mutations génétiques chez les vers. Sur la base d’une découverte récente selon laquelle les voies de stress dépendantes du facteur de croissance de l’insuline peuvent influencer la destruction des cellules germinales induite par la DGLA.Nous avons complété l’alimentation de vers contenant des mutations délétères dans le récepteur IGF de l’insuline DAF deux ou le facteur de transcription FOXO DAF 16 Avec DGLA, Un score de stérilité dans chaque souche a montré que les deux mutants DAF étaient fertiles avec peu ou pas de perte de cellules germinales induite par rapport aux vers de type sauvage aux deux concentrations de DGLA. En revanche, les vers supplémentés en DGLA avec du vox O inactif présentaient un pourcentage plus élevé de vers stériles par rapport au type sauvage lorsqu’ils étaient nourris sur des plaques contenant 0,15 millimolaire de l’acide gras. En suivant cette procédure, les chercheurs peuvent effectuer de nombreux tests avec l’élégance marine supplémentaire, tels que des études d’expression génique, des tests comportementaux ou des analyses de développement ou de reproduction.Ces tests révéleront le rôle d’acides gras spécifiques dans ces processus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer régulièrement des milieux supplémentés en acides gras qui peuvent être utilisés pour modifier la composition en acides gras de l’élégance marine.

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