Name: Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Découvrez la culture de cellules souches neurales à partir de régions cérébrales de rongeurs adultes. Cette méthode permet d'étudier l'auto-renouvellement et le potentiel de différenciation pour la recherche en neurosciences.

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Ce travail a été financé (en partie) par le Helmholtz Alliance ICEMED - imagerie et le traitement des maladies métaboliques de l&#39;environnement, à travers le Fonds de l&#39;Initiative et le Réseau de l&#39;Association Helmholtz, une subvention de la Fondation Else Kroener-Fresenius, et une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: Les cellules dans les tissus).

Le travail adhère à la Déclaration de Helsinski et l&#39;état des animaux ARVO. Les animaux ont été utilisés pour la collecte des tissus et toutes les méthodes pertinentes ont été suivies selon les instructions de l&#39;animalerie de l&#39;Université de Dresde. Les animaux ont été manipulés et logés selon les lignes directrices fédérales allemandes pour l&#39;utilisation et l&#39;entretien des animaux de laboratoire, et l&#39;étude a été approuvé par le Landesdirektion Dresde. S&#39;il vous plaît consulter la politique vétérinaire de votre établissement (IACUC ou autre conseil) en ce qui concerne la méthodologie de l&#39;euthanasie approprié. Concentrations de travail de réactifs actions spécifiques et peuvent être trouvés dans les tableaux accompagnant ce protocole réactif. Une. Culture vaisselle Préparation <ol><li> Manteau de plats avec un volume suffisant de 75 pg / ml de poly-L-ornithine (soit 2 ml / puits d&#39;une plaque à 6 puits) pendant une nuit dans l&#39;incubateur de culture de cellules 2 jours avant la date prévue de dissection. </li><li&gt; Aspirer le poly-L-ornithine le jour et laver chaque puits 2x avec 3 ml de PBS pendant 5 min suivant. </li><li> Retirez le lavage final, puis ajouter la fibronectine (dilué 1:250, 4 ug / ml dans PBS) à la plaque et placez les plats dans l&#39;incubateur pendant la nuit. </li><li> Aspirer la fibronectine, le jour de la dissection et de lavage des plats 2x avec du PBS. Remettre les plaques contenant encore la finale PBS laver à l&#39;incubateur jusqu&#39;à ce que le tissu dissocié est prêt pour la culture. À ce moment, retirer la PBS avant l&#39;étalement du tissu. </li><li> plaques de magasins recouvertes de poly-L-ornithinein l&#39;incubateur pendant jusqu&#39;à 3 semaines. Des plaques recouvertes de fibronectine peuvent être stockées pendant 1 semaine. revêtement de fibronectine peut être fait en aussi peu que 2 heures si urgent. La fibronectine est sensible à la dénaturation, ne pas agiter la solution ou laissez sécher la vaisselle. </li></ol> 2. Dissection / placage <ol><li> Ce protocole s&#39;applique à l&#39;utilisation de trois rats adultes (3-6 mois d&#39;âge). </li><li> Chill le cerveau sectionnement bloc sur la glace avant l&#39;euthanasie chez le rat. </li><li> Placer un tube Falcon de 15 ml contenant 5 ml de milieu N2 avec bFGF ajouté sur de la glace. </li><li> Euthanasier les rats conformément à la politique vétérinaire de votre institution. </li><li> Retirer le cerveau du crâne en faisant une incision de la ligne médiane vers le bas de la tête. Utilisez une pince à décoller de l&#39;os permettant au cerveau pour être soigneusement extrait. </li><li> Placez le cerveau dans une boîte de 10 cm de Pétri contenant glacée PBS. Cela permettra d&#39;éliminer tous les poils résiduelle et le sang. (Figure 1A) </li><li> Placer le cerveau dans le bloc de sectionnement réfrigérés. (Figure 1B) </li><li> Insérez une nouvelle lame de rasoir propre dans le bloc comme illustré à la figure 1C. </li><li> Insérer un second mm caudal rasoir propre pale 3 à la première, comme illustré sur la figure 1D. </li><li> Soulevez délicatement les lames du bloc, emportant avec eux la section d&#39;intérêt. </li><li> Faire flotter le section de la lame en l&#39;immergeant dans du PBS. (Figure 1E) </li><li> tissu de récolte de la zone d&#39;intérêt (dans cet exemple, nous avons utilisé la commissure antérieure, (antérieure) ACA, figure 1F) en utilisant # 5 forceps et recueillir dans un tube conique de 15 ml contenant 1 ml de milieu N2 contenant bFGF. </li><li> Déplacer le tube dans une hotte de culture de cellules à flux laminaire, en continuant le reste du protocole en conditions stériles. </li><li> Mécaniquement dissocier le tissu à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml attaché à une pipette P1000. Introduire à la pipette de haut en bas plusieurs fois (environ 20 fois à raison de 1 cycle de pipetage par seconde) tout en appuyant sur ​​l&#39;ouverture de la pointe de la pipette contre le fond du tube conique (figures 1G 1-3). Arrêtez trituration quand la solution devient homogène. </li><li> Laisser reposer la solution pendant 2 minutes pour permettre à tout le tissu non dissociée plus grande à se déposer au fond. (Figure 1G 4) </li><li> Recueillir le homogeneous surnageant et le placer dans un tube conique contenant 8,5 ml de milieu N2 plus 20 ng ml de bFGF /, 500 ng ml Dll4 /, 500 ng / ml Ang2, et 200 nMJAK inhibiteur. </li><li> Plate-les dans 3 puits d&#39;une plaque à 6 puits à l&#39;aide de 3 ml de solution cellulaire diluée / puits. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur humidifié de cellules à 37 ° C, 5% de CO 2, 5% d&#39;O 2. </li></ol> 3. Entretien quotidien <ol><li> Remplacez le support sur les boîtes de culture avec N2 milieu contenant bFGF, Ang2, Dll4, et JAK inhibiteur 24 heures après placage. </li><li> Ajouter un bolus de bFGF, Dll4, Ang2, et l&#39;inhibiteur de JAK le jour suivant. </li><li> Continuez ce processus alternatif de changements des médias et des ajouts de facteurs pour un total de 10-14 jours. </li></ol> 4. L&#39;induction de la différenciation <ol><li> Retirer bFGF, Dll4, Ang2, et JAK inhibiteur contenant du milieu et de le remplacer par un milieu N2 qui ne contient pas de facteurs supplémentaires. </li><li> Changez le milieu tous les deux jours. </li><li> Fixer les cellules après 10 jours et d&#39;effectuer immunocytochimie. </li></ol> 5. Détection immunocytochimique <ol><li> Aspirer le milieu et fixer des plaques de culture de cellules avec 2 ml de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min. </li><li> Laver 2 fois avec 3 ml de PBS pendant 5 min chacun. </li><li> Aspirer le PBS, puis bloquer et perméabiliser les cellules par addition de 2 ml de PBS contenant 5% de sérum normal d&#39;âne (NDS) et 0,1% de Triton X-100 pendant 20 min. </li><li> Préparer le mélange d&#39;anticorps primaire dans du PBS contenant 5% de NDS. Anticorps anti-nestine peut être utilisé pour identifier SC, tandis que Tuj1 (classe III β-tubuline), anticorps GFAP, et CNPase peut être utilisé pour un triple coloration de marqueurs de différenciation. </li><li> Aspirer la solution de blocage et ajouter 1,5 ml du mélange d&#39;anticorps primaire à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 90 min. </li><li> Retirez les anticorps primaires et laver 2 fois avec 3 ml de PBS, et 1x avec 3 ml de PBS contenant 5% de NDS pour 5 min chacun. </li><li> Prepare les anticorps secondaire dans du PBS contenant 5% de NDS. </li><li> Aspirer le lavage final et ajouter 1,5 ml de solution d&#39;anticorps secondaire dans chaque puits. Incuber dans l&#39;obscurité pendant 40 min à température ambiante. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps secondaire et ajouter 2 ml d&#39;une tache DAPI fraîchement préparé (500 ng / ml dans du PBS). Incuber pendant 3 min. </li><li> Aspirer la solution DAPI puis laver 3 fois avec 3 ml de PBS pendant 5 min chacun. Les cellules peuvent maintenant être visualisées avec un microscope à fluorescence. </li></ol>

<ol><li>Cajal, R. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCajal%2C+RY+%22Comparative+Study+of+Sensory+Areas+of+the+Human+Cortex%22">Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex</a>. , Harvard University. (1899).</li>
<li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).</li>
<li>Kaplan, M. S., Hinds, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+rat%3A+electron+microscopic+analysis+of+light+radioautographs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs.</a> Science. 197, 1092-1094 (1977).</li>
<li>Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement in adulthood.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).</li>
<li>Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+neocortex+of+adult+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the neocortex of adult primates.</a> Science. 286, 548-552 (1999).</li>
<li>Kornack, D. R., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuation+of+neurogenesis+in+the+hippocampus+of+the+adult+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+proliferation+and+migration+of+postnatally+generated+neurons+derived+from+the+forebrain+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone.</a> Neuron. 11, 173-189 (1993).</li>
<li>Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+cells+express+a+new+class+of+intermediate+filament+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.</a> Cell. 60, 585-595 (1990).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+precursors+in+the+adult+brain+rescues+injured+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+dentate+subgranular+zone+and+rostral+subventricular+zone+after+focal+cerebral+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).</li>
<li>Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone.</a> Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+MSCs+therapeutic%3F+New+data%3A+new+insight%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Why are MSCs therapeutic? New data: new insight.</a> J. Pathol. 217, 318-324 (2009).</li>
<li>Goldman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+of+the+human+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.</a> Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).</li>
<li>Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-based+therapy%3A+considerations+before+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications.</a> Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, e1000029(2009).</li>
<li>Lindvall, O., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapeutics+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell therapeutics in Parkinson's disease.</a> Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).</li>
<li>Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+eNSCs+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mo.l+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease.</a> Mo.l Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Cattaneo, E., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+manipulating+neuronal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identifying and manipulating neuronal stem cells.</a> Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li>
<li>Duarte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage-sensitive+requirement+for+mouse+Dll4+in+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development.</a> Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).</li>
<li>Maisonpierre, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2%2C+a+natural+antagonist+for+Tie2+that+disrupts+in+vivo+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.</a> Science. 277, 55-60 (1997).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li>
<li>Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+increases+survival+and+differentiated+functions+of+rat+septal+cholinergic+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture.</a> Neuron. 5, 297-306 (1990).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+display+an+inherent+mechanism+for+rescuing+dysfunctional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).</li>
<li>Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+attenuate+inflammatory+reactivity+and+neuronal+loss+in+an+animal+model+of+inflamed+AD+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain.</a> J. Neuroinflammation. 6, 39(2009).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+factors+stimulate+growth+of+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells.</a> PLoS One. 5, e9414(2010).</li>
<li>Park, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes3+regulates+cell+number+in+cultures+from+glioblastoma+multiforme+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics.</a> Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).</li>
<li>Poser, S. W., et al. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoser%2C+SW+%22Cancer+Stem+Cells+-+The+Cutting%22">Cancer Stem Cells - The Cutting</a>. Shostak, S. , InTech. Europe, Rijeka, Croatia. 89-110 (2011).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+controlling+neural+stem+cells+slow+progressive+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Un grand nombre des étapes critiques de l&#39;isolement, de l&#39;expansion et la différenciation des cellules souches neuronales du cerveau adulte sont partagées en commun par des techniques de culture tissulaire standard. L&#39;objectif de garder à l&#39;esprit est que les CNS isolés du cerveau adulte devrait maintenir le plus grand nombre de leurs caractéristiques in vivo que possible (Figure 2J). Souvent un équilibre entre la prudence nécessaire et la vitesse appropriée doit être trouvé. Un...

Le dogme central de la neurobiologie, prévue par les observations fondamentales de la cytoarchitecture de cerveau fait par Ramón Y. Cajal il ya plus d&#39;un siècle, a estimé que la neurogenèse est peu probable après l&#39;adolescence étant donné la complexité des réseaux de neurones présents dans le système nerveux central 1. Malgré les travaux de Altman dans les années 1960, et plus tard Kaplan, ce qui démontre que la 3H-thymidine pourrait être trouvée dans les neurones matures indiquant que, en fait, les neurones ont été générés dans des zones distinctes du cerveau adulte, le dogme a continué à tenir deux, trois. La preuve a continué à monter avec la recherche de Nottebohm décrivant les changements saisonniers dans le nombre de neurones présents dans le cerveau des oiseaux chanteurs 4. Ce n&#39;était pas jusqu&#39;en 1999, quand Gould et al travail. Publié sur la génération de neurones dans l&#39;hippocampe augmente avec l&#39;exécution des tâches d&#39;apprentissage associatif chez le rat, ainsi que les observations de Kornack et Rakic ​​démonstrationTing a continué la neurogenèse chez le macaque adulte que le concept d&#39;un cerveau moins rigide, plus plastique, a été reconnu 5, 6. La recherche de la source cellulaire de ces neurones générés de novo conduit à la découverte d&#39;une population distincte de cellules souches (CS) qui résident dans les zones du cerveau appelée niches 7. La zone sous-ventriculaire et la zone granulaire sous de l&#39;hippocampe sont considérés comme les deux principales régions neurogènes 8,9. Cellules isolées à partir de ces endroits présentent la caractéristique classique de CS dérivés embryonnaires ou fœtales, l&#39;auto-renouvellement et potentiel de différenciation. Dans le cas des cellules souches neurales (NSC), ils peuvent être différenciées en neurones, astrocytes et oligodendrocytes,. En outre, ces SCs tache positive pour les marqueurs du CNS tels que la foetales intermédiaire nestine de protéine de filament 10. Des travaux plus récents souligne que les conseils sectoriels pourraient ne pas se limiter à ces Two domaines, et sont en fait localisée dans le cerveau comme une population en grande partie de repos de cellules étroitement associés à la vascularisation 11. Les observations que les CS sont mobilisés en réponse à une blessure suggère la possibilité d&#39;être en mesure d&#39;utiliser ces cellules à des fins de régénération pour aider à la récupération de maladie neurodégénérative et course 12, 13. Cela n&#39;est pas sans rappeler le rôle que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) jouent dans la cicatrisation des tissus conjonctifs, qui sont présents sous forme de cellules périvasculaires qui ont le potentiel de devenir des ostéoblastes, les chondrocytes, les cellules adipeuses et 14. Cependant, les CNS ne peuvent être récoltées de la même manière que les cellules souches mésenchymateuses à partir de la moelle osseuse par aspiration de routine et les techniques de centrifugation à gradient de densité et par la suite utilisées dans les thérapies à base de cellules autologues. En conséquence, d&#39;autres sources de cellules, telles que l&#39;utilisation de NNC foetales ou des précurseurs neuronaux issus de embcellules souches ryonic ont été largement explorée dans la maladie de modèles animaux et de blessures avec différents degrés de succès 15. Technologies de cellules souches pluripotentes induites utilisant des sources de cellules somatiques offrent un autre moyen potentiel pour produire des thérapies à base de cellules thérapeutiquement utiles pour un large éventail d&#39;applications, en surmontant la disponibilité limitée et des préoccupations éthiques concernant l&#39;utilisation des cellules embryonnaires et les tissus fœtaux 16. Cependant, la traduction clinique de ces résultats s&#39;est avéré être une tâche difficile, comme l&#39;a démontré dans les luttes de traitement de divers troubles neurologiques avec thérapeutiques à base SC approches 17,18, ainsi que d&#39;un chemin tortueux à l&#39;autorisation réglementaire. Comme une approche alternative, l&#39;introduction de traitements pharmacologiques spécifiques peut moduler le nombre de CSN et de faciliter la récupération dans les modèles de la maladie de Parkinson et les AVC 19. Quelle que soit la stratégie pourrait être, de comprendre comment manipuler efficacement ces cellulesexige un système in vitro accessible. Cultures du CNS peuvent être réalisés soit sous forme de cultures globales, aussi appelées neurosphères, ou comme une monocouche 8,20. Les deux techniques ont été largement utilisés, ce qui permet l&#39;établissement de conditions de culture définies, à savoir l&#39;utilisation de facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) en tant que source de mitogène, qui assurent l&#39;expansion de précurseurs multipotentes. Bien que les cultures de neurosphères peuvent être mieux adaptés à l&#39;étude de la capacité de propagation clonale d&#39;un type de cellule isolée, le système a été montré pour produire une population mixte de cellules lors de la détente 21. En outre, la structure fermée de neurosphères rend la manipulation pharmacologique des cellules peu pratique, et l&#39;interprétation de l&#39;influence de ces facteurs peuvent avoir pourrait être confondue en raison du microenvironnement établi dans la neurosphère lui-même. Des cultures monocouches, d&#39;autre part, peuvent êtreutilisé dans les écrans à haut débit de banques de petites molécules, en fournissant un outil puissant pour explorer les mécanismes de transduction du signal qui régulent la croissance et la différenciation SC et ouvre la possibilité de découvrir de nouveaux composés qui ciblent spécifiquement cette population de cellules. En conséquence, la capacité de générer de manière reproductible des cultures de NNC adultes provenant de différentes régions d&#39;intérêt dans le cerveau peut être utilisée dans un large éventail d&#39;applications de recherche, allant d&#39;études sur le développement du système nerveux central (SNC) à explorer de nouvelles approches de la médecine régénérative . Le protocole présenté ici montre comment disséquer et évaluer le potentiel de différenciation de SNC Centres isolés du cerveau de rongeur adulte.

<table><tbody><tr><td>Boîtes de culture tissulaire à 6 puits</td><td>BD Biosciences</td><td>353934</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3655</td><td> 5 mg/ml solution mère préparée dans de l’eau doublement distillée (Stable pendant plusieurs mois à -20 &deg ; C). Concentration de travail 0,5 mg/ml dans l’eau (Stable pendant 1 mois à 4 &deg ; C). </td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>R& D Systems</td><td>1030-Fn</td><td>Ne pas agiter la solution mère</td></tr><tr><td>Appareil de filtration</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-090-CV</td><td>Voir la remarque ci-dessous pour la préparation complète du milieu N2</td></tr><tr><td>Apo-transferrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0516</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td>1 M solution mère en ddH2O (stable à 20 &deg ; C pour 6 mois)</td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5261</td><td>500 &micro ; M solution mère dans ddH2O (stable à -20 &deg ; C pendant 6 mois)</td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>100 & micro ; M solution mère dans l’éthanol (stable à -20&deg ; C pendant 6 mois)</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>Concentration de travail 20 ng/ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Delta4 (Dll4)</td><td>R& D Systems</td><td>1389-D4</td><td>Concentration de travail 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Angiopoétine 2 (Ang2)</td><td>R& D Systems</td><td>623-AN</td><td>Concentration de travail 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Inhibiteur</td> de <td>JAK Calbiochem</td><td>420099</td><td>Concentration de travail 200 nM&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2058</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 et 50 ml</td><td>Corning Life</td><td>Sciences 430053, 430829</td><td></td></tr><tr><td>Les autres articles nécessaires comprennent : Instruments de dissection générale, y compris une lame de rasoir et une pince, Rat adulte (3-6 mois ; Sprague-Dawley ou Long Evans), chambre d’intoxication au CO2, hotte à flux laminaire pour la culture cellulaire et incubateur Incubateur (humidifié, 37 &deg ; C, 5 % CO2, 5 % O2). Remarque : Pour une préparation complète du milieu N2, ajoutez à un flacon de DMEM/F-12 (500 ml) 0,05 g d’apotransférine, 0,0125 g d’insuline (fraîchement prédissoute dans 1 ml de 10 mM de NaOH), 50 &mu ; l de putrescine, 30 &mu ; l de sélénite de sodium, 100 &mu ; l de stocks de progestérone et 5 ml de solution de pénicilline/streptomycine. Ajustez le pH à 7,2, si nécessaire. Filtrer-stériliser et stocker à 4 &deg ; C jusqu’à 3 semaines et protéger de la lumière.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunofluorescence Table</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8417</td><td>5 mg/ml stock solution dans le méthanol</td></tr><tr><td colspan="4">Table d’anticorps primaires</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon</td><td>MAB353</td><td> Facteur de dilution : 1:400 Espèce : Souris IgG1 </td></tr><tr><td>Hes3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25393</td><td> Facteur de dilution : 1:100 Espèce : IgG de lapin </td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td> Facteur de dilution : 1:100 Espèce : Souris IgG2a </td></tr><tr><td>CNPase</td><td>Chemicon</td><td>MAB326</td><td> Facteur de dilution : 1:200 Espèce : Souris IgG1 </td></tr><tr><td>&beta ;-tubuline III (TUJ1)</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1195</td><td> Facteur de dilution : 1:500 Espèce : Souris IgG2a </td></tr><tr><td>Protéine acide fibrillaire gliale (GFAP)</td><td>Dako North America</td><td>Z0334</td><td> Facteur de dilution 1:500 Espèce : Lapin </td></tr><tr><td colspan="4">Table d’anticorps secondaires</td></tr><tr><td>Alexa&nbsp ; &nbsp ; 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21124</td><td> Facteur de dilution : 1:200 Espèce : Chèvre anti souris IgG1 </td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21131</td><td> Facteur de dilution : 1:200 Espèce : Chèvre anti souris IgG2a </td></tr><tr><td>Cy5</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>59883</td><td> Facteur de dilution : 1:200 Espèce : Chèvre anti Lapin </td></tr></tbody></table>

grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Des travaux récents montrent que le système nerveux central (SNC), la régénération et la tumorigenèse implique des populations de cellules souches (SC) résidant dans le cerveau adulte. Cependant, les mécanismes de ces cellules normalement quiescentes emploient pour assurer le bon fonctionnement des réseaux de neurones, ainsi que leur rôle dans la récupération de blessures et d&#39;atténuation des processus neurodégénératifs sont peu compris. Ces cellules se trouvent dans les régions appelées «niches» qui offrent un environnement maintien impliquant des signaux modulateurs à la fois le système vasculaire et le système immunitaire. L&#39;isolement, l&#39;entretien et la différenciation des CS CNS dans des conditions de culture définies qui excluent facteurs inconnus, qui les rend accessibles à un traitement par des moyens pharmacologiques ou génétiques, fournissant ainsi un aperçu de leur comportement in vivo. Nous vous proposons ici des informations détaillées sur les méthodes pour générer des cultures de Centres de SNC régions distinctes du cerveau adulte et approches pour évaluer leur dpotentiel de ifferentiation dans les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes et in vitro. Cette technique donne une population cellulaire homogène d&#39;une culture en monocouche qui peut être visualisée à étudier SC individuel et leur descendance. En outre, il peut être appliqué sur différents systèmes de modèles animaux et des échantillons cliniques, utilisé précédemment pour prédire des réactions de régénération dans le système nerveux adulte endommagé.

L&#39;identification de la région d&#39;intérêt à partir de laquelle la récolte de cellules souches neurales est la première étape critique et définir la quantité de temps qu&#39;il faut pour obtenir une plaque de cellules confluentes. Par exemple, la SVZ est une région neurogène classique et a une proportion relativement plus élevée de cellules souches neurales donc. Cependant, la technique présentée ici peut être utilisé avec d&#39;autres régions pas souvent reconnus comme ayant un potentiel neurogène robuste à l&#39;...

Les cellules souches neurales récoltés dans le cerveau adulte sont de plus en plus utilisés dans des applications allant de la recherche fondamentale du développement du système nerveux à l&#39;exploration des applications cliniques potentielles en médecine régénérative. Cela rend le contrôle rigoureux des conditions d&#39;isolement et de culture utilisés pour cultiver ces cellules essentielles au son des résultats expérimentaux.

Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des cultures de cellules souches neurales à partir de différentes zones du cerveau des rongeurs adultes. Ceci est réalisé en prélevant du tissu dans une région d’intérêt pour examiner la présence et le potentiel de cellules souches neurales. Dans un deuxième temps, transformez le tissu en une suspension cellulaire pour le placage en tant que culture monocouche.Ensuite, utilisez des conditions de culture définies pour propager sélectivement les cellules souches neurales, validant ainsi leur potentiel d’auto-renouvellement. Des résultats in vitro sont obtenus montrant que les cellules souches neurales sont multipotentes en fonction de leur potentiel de différenciation, et comment divers facteurs peuvent influencer leur auto-renouvellement et leur destin. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des neurosciences et de la médecine régénérative, telles que l’emplacement des cellules souches neurologiques endogènes et la façon de les manipuler.Nous avons d’abord pensé à cette technique lorsque nous avons découvert des voies de réduction des signaux. Cela nous a permis à la fois d’identifier les c

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Ce protocole vidéo illustre la méthode de dosage Neurosphère de générer et de développer des cellules souches neurales de la région périventriculaire souris adulte, et donne un aperçu technique afin de garantir l'on peut obtenir des cultures Neurosphère reproductibles.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Cette vidéo présente une méthode pour isoler les cellules souches neurales/progénitrices du tissu périventriculaire de la moelle épinière chez des rats adultes. La technique comprend l’incubation des fragments de tissu dans une solution contenant des enzymes protéolytiques pour perturber la matrice extracellulaire et libérer les cellules. Par la suite, les cellules libérées sont plaquées dans un milieu contenant des facteurs de croissance spécifiques qui favorisent la prolifération des souches...

Isolement de cellules progénitrices souches neurales de la région périventriculaire de la moelle épinière d’un rat adulte

Ce protocole décrit un procédé de découpage mécanique nouvelle qui permet l'expansion de souches et de cellules progénitrices neurales agrégats sphériques sans dissociation d'une suspension cellulaire unique. Maintenir le contact cellule / cellule permet une croissance rapide et stable depuis plus de 40 passages.

Une méthode d&#39;extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la production simultanée de cultures de cellules de précurseur de neurones, soit comme des monocouches ou des neurosphères adhérentes, à partir de la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de souris individuels adultes.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

La moelle épinière de mammifère adulte contient des cellules souches neurales/progénitrices (NSPC) qui peuvent être isolées et développées en culture. Ce protocole décrit le prélèvement, l’isolement, la culture et le passage de NSPC générés à partir de la région périventriculaire de la moelle épinière adulte à partir de rats et de donneurs d’organes humains.

Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine

Nous rapportons une méthode basée sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler les cellules souches neurales (NSC) et leur descendance de la zone sous-ventriculaire (SVZ) du cerveau de souris adulte. Appliqué aux souris transgéniques FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), il permet l’étude de la progression du cycle cellulaire par imagerie en direct.

Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

La mise en place de systèmes de culture pour l’expansion des cellules souches neurales adultes (CSNa) permet l’examen et l’application des CSNa à des fins thérapeutiques. La zone sous-calleuse (SCZ) a récemment été reconnue comme une nouvelle région formant des neuroblastes chez les souris adultes. Ici, les méthodes d’isolement, d’expansion et de différenciation des SCZ-aNSC sont décrites.

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Le cerveau canin est un modèle précieux pour étudier la neurogenèse adulte. Présenté ici sont des protocoles d'isolement et de l'expansion des cellules adultes canines hippocampiques précurseurs neurales à partir de tissus du cerveau primaire.

Isolement et expansion des adultes Canine hippocampiques Neural Précurseurs

Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Une méthode d’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes à partir du cerveau de rats vivants est présentée ici en détail expérimental. Il permet de multiples prélèvements de ces cellules chez les mêmes animaux sans compromettre leur bien-être.

La méthode de « traite cérébrale » pour l’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes provenant de rats vivants

Ici, nous décrivons un système de nucléofection conçu pour améliorer l’efficacité de l’administration de gènes dans les cellules souches neurales (NSC) élargies isolées de la zone sous-ventriculaire murine adulte. Les résultats démontrent que cette méthode améliore considérablement la perturbation des gènes dans les CSN, surpassant l’efficacité des protocoles de transfection traditionnels et augmentant le taux de survie cellulaire.

Isolement, expansion et nucléofection de cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire murine adulte

Découvrez la culture de cellules souches neurales à partir de régions cérébrales de rongeurs adultes. Cette méthode permet d'étudier l'auto-renouvellement et le potentiel de différenciation pour la recherche en neurosciences.

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