Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des cultures de cellules souches neurales à partir de différentes zones du cerveau des rongeurs adultes. Ceci est réalisé en prélevant du tissu dans une région d’intérêt pour examiner la présence et le potentiel de cellules souches neurales. Dans un deuxième temps, transformez le tissu en une suspension cellulaire pour le placage en tant que culture monocouche.

Ensuite, utilisez des conditions de culture définies pour propager sélectivement les cellules souches neurales, validant ainsi leur potentiel d’auto-renouvellement. Des résultats in vitro sont obtenus montrant que les cellules souches neurales sont multipotentes en fonction de leur potentiel de différenciation, et comment divers facteurs peuvent influencer leur auto-renouvellement et leur destin. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des neurosciences et de la médecine régénérative, telles que l’emplacement des cellules souches neurologiques endogènes et la façon de les manipuler.

Nous avons d’abord pensé à cette technique lorsque nous avons découvert des voies de réduction des signaux. Cela nous a permis à la fois d’identifier les cellules souches neurologiques endogènes présumées et de réguler leur nombre. Nous avons donc appliqué ces connaissances pour établir des cultures robustes de ces cellules dans différentes zones du cerveau.

Étudiez leurs propriétés et posez-vous la question suivante : sont-ils vraiment des cellules souches ? Une bonne préparation de la boîte de culture est essentielle deux jours avant la dissection programmée : enduisez les boîtes avec de la poly L ornithine à 75 microgrammes par millilitre. Ensuite, incubez les plaques pendant la nuit du lendemain, aspirez la poly L ornithine ine et lavez bien chacune deux fois avec trois millilitres de PBS pendant cinq minutes par lavage.

Les plaques peuvent ensuite être stockées dans un incubateur jusqu’à trois semaines Après avoir retiré le lavage final, ajoutez de la fibre diluée à 250 dans du PBS par pipetage doux. Attention à ne pas trop agiter la solution. Ensuite, incubez les plaques pendant la nuit le jour de la dissection.

Aspirez la fibronectine et lavez la vaisselle deux fois avec du PBS. Remettez les plaques avec le lavage final PBS dans l’incubateur et attendez que les tissus se dissocient. Les plaques inutilisées peuvent être conservées dans l’incubateur jusqu’à une semaine, mais ne les laissez pas sécher et ne les agitez pas.

La démonstration de ce protocole est portée à l’échelle de trois rats adultes. Tout d’abord, assurez-vous de refroidir le bloc de section du cerveau sur de la glace avant d’euthanasier le premier rat. Préparez ensuite un tube conique de 15 millilitres sur de la glace avec cinq millilitres de N deux FGF moyens et basiques.

Après avoir retiré le cerveau d’un rat euthanasié, placez le cerveau dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du PBS glacé. Transférez ensuite le cerveau dans une deuxième boîte de PBS sans aucun résidu de cheveux ou de sang. Placez maintenant le cerveau dans le bloc de section réfrigéré et insérez une nouvelle lame de rasoir propre dans le bloc à proximité de la région d’intérêt à partir de laquelle les cellules seront générées.

Ensuite, insérez une deuxième lame de rasoir propre. Trois millimètres dorlotent la première lame de rasoir. Soulevez avec précaution les lames du bloc en emportant avec elles la section d’intérêt.

Faites flotter la section de la lame en l’immergeant dans du PBS. Récoltez maintenant la zone d’intérêt à l’aide de la pince numéro cinq. Dans cet exemple, la section contient la commissure antérieure. Sûr.

Recueillir la section dans le tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu N deux avec FGF basique. Réduisez ensuite le volume de la solution à un à deux millilitres. Ensuite, dans une hotte de culture cellulaire, immergez une pointe de pipette d’un millilitre au fond de la conique et utilisez environ 20 flux de solution pour dissocier mécaniquement le tissu.

Arrêtez la tation lorsque la solution devient homogène et laissez-la reposer pendant quelques minutes afin que les tissus plus gros non associés se déposent au fond. Transférez maintenant le surnageant homogène sans aucun morceau de tissu dans un tube conique contenant 8,5 millilitres de milieux supplémentés et deux milieux. Mélangez le contenu du tube et préparez-en six préparés.

Assiette de puits. Retirez le PBS des puits, puis ajoutez trois millilitres de mélange cellulaire par puits dans trois puits au cours des 10 à 14 prochains jours de culture. Remplacez le milieu par du N deux supplémenté frais tous les deux jours, en commençant 24 heures après le placage tous les deux jours, ajoutez un volume frais de suppléments dans le N deux.

Milieu au milieu déjà présent sur les cellules. La diligence aux conditions du milieu est essentielle pour maintenir les cellules indifférenciées et permettre leur expansion. Après le premier changement de milieu, une grande quantité de débris cellulaires est restée avec les vaisseaux sanguins.

Cependant, au cours des jours suivants, des colonies de cellules souches proliférantes distinctes sont devenues visibles. Des populations cellulaires plus allongées ressemblant à des fuseaux étaient également présentes. Ce ne sont pas des cellules souches neurales et ont finalement été dépassées par la prolifération des cellules souches neurales.

Au cours des deux semaines suivantes, les cellules souches neurales se sont développées plus densément jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence. Ces cultures ont donné des résultats positifs pour un certain nombre de marqueurs de cellules souches, notamment SOX deux, hesi et nest. En donnant ainsi confiance que les populations cellulaires qui ont été sélectionnées et développées sont bien des cellules souches neurales.

Une confirmation supplémentaire est venue après le retrait du FGF du milieu, ce qui a permis aux cellules de se différencier pendant 10 jours en neurones, astrocytes et tous les cytes du cendra. Pour induire la différenciation. Remplacez le milieu supplémenté en N deux par du N deux non supplémenté, milieu et cultivez les cellules de cette façon pendant 10 jours, en remplaçant le N deux toutes les 48 heures après 10 jours, aspirez le milieu et fixez les cellules avec deux millilitres de 4 % de para formaldéhyde par puits pendant 20 minutes.

Lavez le fixateur avec trois millilitres de PBS deux fois pendant cinq minutes par lavage. Après avoir aspiré le deuxième lavage, ajoutez deux millilitres de PBS contenant 5 % de sérum d’ânesse normal et 0,1 % de tritton X 100 pour perméer et bloquer les cellules pendant que les cellules incubent à température ambiante pendant 20 minutes. Préparez le mélange d’anticorps primaires dans du PBS contenant 5 % de PDN.

Dans cet exemple, l’anticorps anti T UJ one est utilisé pour identifier les neurones, tandis que les anticorps GFAP et CPA sont utilisés pour visualiser respectivement les astrocytes et les oligodendrocytes. Après 20 minutes, aspirez la solution bloquante et ajoutez 1,5 millilitre du mélange d’anticorps primaires à chacune. Bien incuber les cellules.

Ajoutez la température ambiante pendant 90 minutes après 90 minutes, lavez les cellules avec deux bains de PBS, suivis d’une application de PBS contenant 5 % de NDS utilisez trois millilitres de solution et des bains de cinq minutes. Après avoir retiré le lavage final, appliquez 1,5 millilitre d’anticorps secondaires dans du PBS contenant 5 % de PDN à chacun. Ensuite, mettez l’assiette dans l’obscurité, ajoutez la température ambiante et attendez 40 minutes.

Après 40 minutes, remplacez le secondaire par deux millilitres d’une teinture DPI fraîchement préparée et attendez trois minutes. Après avoir aspiré la solution DPI, lavez les cellules trois fois avec trois millilitres de PBS pendant cinq minutes par lavage. Les cellules sont ensuite prêtes pour la microscopie après cette procédure.

D’autres méthodes, comme les transferts Western, peuvent être effectuées pour examiner les changements dans l’expression et la phosphorylation des protéines qui résultent de traitements pharmacologiques ou au cours de la différenciation cellulaire. Après le développement de cette technique, elle a en fait ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour tester de nouvelles méthodes qu’ils ont mises en œuvre dans la recherche sur plusieurs espèces différentes, y compris les souris, les rats et même les primates.