Name: Culture de tissus isolement de la plaque au sol et la production de milieu conditionné à évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux plancher Plate-publié (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Apprenez à produire un milieu conditionné par la plaque au sol à partir d'embryons de souris E12.5 pour étudier les signaux neuronaux dans le développement de la moelle épinière. Cette méthode permet d'analyser l'expression des marqueurs commissuraux.

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Nous remercions Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, et Florie Reynaud pour leur aide. Le travail est soutenu par le CNRS, le programme ANR YODA et Labex DevWeCan.

JOUR 1 Une. Dissection de la moelle épinière étage Plate (FP) de E12.5 embryons de souris Remarque: L&#39;ensemble de la procédure nécessite l&#39;utilisation de conditions stériles. Il est préférable d&#39;effectuer la dissection sous une hotte à dissection pour éviter la contamination. La surface de la hotte doit être nettoyé avec de l&#39;éthanol. Tous les instruments de dissection doivent être stérilisés et conservés dans une boîte de Pétri stérile. Les liquides (milieu, le milieu de dissection) doivent être maintenus fermés et mis dans un bain de glace. Chaque embryon doit être recueilli dans goutte frais individu. Ceci est important pour la préservation des tissus. La dissection est réalisée avec Dumont # 5 forceps. Pour transférer les embryons entre plats, saisir le cordon ombilical ou la tête sans aucun dommage pour le cerveau postérieur. Il est essentiel de ne pas endommager la moelle épinière pour mener à bien la dissection. Préparer froid tampon phosphate salin (PBS), solution saline équilibrée de Hank froide (HBSS) -6,5% de glucose et d&#39;une salle moyenne neurobasal de température. 1.1 vertébrale dissection du cordon Les animaux sont traités selon les directives de protection des animaux du Centre National de la Recherche Scientifique suivantes directives européennes. Le procédé de l&#39;euthanasie est dislocation cervicale, il consiste à appliquer une pression sur le col et la dislocation de la colonne vertébrale à partir du cerveau. Cette méthode est recommandée pour les modèles animaux de la souris, et peut être effectuée d&#39;une manière rapide et efficace. <ol><li> Euthanasier une souris enceinte à E12.5 de gestation (0,5 ME = nattes premier jour suivant). Placez la souris face ventrale. </li><li> Faire tremper l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Pincer la peau de l&#39;abdomen avec une pince Adson et couper à travers la peau et les couches péritonéale avec des ciseaux chirurgicaux. Faire une incision et l&#39;utiliser pour couper des deux côtés de la souris pour exposer la cavité abdominale. </li><li> Une chaîne d&#39;embryons est présent sur chaque côté de la souris. Saisissez une corne de l&#39;uterus dans le tissu entre les deux embryons et disséquer rupture à partir de la partie extérieure. Transférer l&#39;utérus intact pour une boîte de Pétri de 100 mm avec du PBS froid sur la glace. </li><li> Extraire les embryons à partir de tissus extra-embryonnaires. Saisissez le tissu placentaire (en rouge foncé) avec deux paires de pinces et tirez doucement pour déchirer le tissu et éliminer les embryons du sac de l&#39;utérus. </li></ol> Remarque: Pour une meilleure conservation, la collecte des embryons de leur utérus sac un par un. <ol start="5"><li> Les prochaines étapes sont effectuées sous loupe binoculaire et dissection capot. Placez un embryon dans une goutte de froid HBSS-glucose 6,5%. </li><li> En utilisant des pinces, décapiter l&#39;embryon. </li></ol> Remarque: Couper entre la mâchoire inférieure et le cerveau postérieur, la partie postérieure de la rhombencéphale est important pour les prochaines étapes. <ol start="7"><li> Placez l&#39;embryon face ventrale vers le bas avec la partie antérieure face à l&#39;expérimentateur. </li><li> Pincer la peaude l&#39;embryon avec une paire de forceps et avec l&#39;autre paire se détacher de la peau. </li></ol> Remarque: Cette étape doit être répétée jusqu&#39;à ce que la peau est complètement retiré de la partie antérieure de l&#39;embryon. <ol start="9"><li> Tournez le côté embryon antérieure à la gauche. Avec une pince &quot;cerner&quot; l&#39;embryon dans la partie antérieure. Avec les autres pinces saisissent la peau et tirez vers le côté rostral de l&#39;embryon. La moelle épinière est alors accessible. </li><li> Utilisez un côté de la pince pour couper les méninges qui enveloppent encore la moelle épinière. La moelle épinière est maintenant ouvert. </li><li> Tournez le côté embryon antérieure à la droite. </li><li> Détacher le tissu de la moelle épinière à partir du côté du col de l&#39;embryon. Faites glisser la pince sous la moelle épinière (les pinces doivent être tenus fermés pour éviter d&#39;endommager la moelle épinière). Les pinces doivent être visibles dans la moelle épinière. Petits mouvements de rotation en vertu de la moelle épinière sont suffisantes pour détacher latissu et le ganglion de la racine dorsale (DRG) entourant. </li></ol> Remarque: Laisser les tissus environnants attaché ajouter du poids à la moelle épinière, ce qui augmente la probabilité de casser lors de l&#39;étape suivante. <ol start="13"><li> Placez la moelle épinière isolée dans une nouvelle goutte de froid HBSS-glucose 6,5%. </li><li> Placer la colonne vertébrale dans une position à plat, les méninges sur la face supérieure et antérieure à une distance à partir de l&#39;expérimentateur. </li><li> &quot;Cerner&quot; la moelle épinière à l&#39;aide du cerveau postérieur restant avec une pince, et avec les deuxièmes pinces saisissent les méninges. Décoller les méninges à partir du côté rostrale de la moelle épinière. </li></ol> Remarque: le mouvement doit être lente et constante afin d&#39;éviter toute rupture de la moelle épinière. Mouvements vibratoires peuvent faciliter le détachement des méninges. 1.2 FP dissection <ol><li> Pincez le cerveau postérieur avec une pince. </li><li> Le FP est la tra centralnsparent partie du tissu. Avec un scalpel découper la plaque de sol. </li></ol> Remarque: Pour couper les deux côtés avec la même qualité, commencer par la face rostrale et couper alternativement du côté droit et le côté gauche de la plaque de sol. <ol start="3"><li> Conserver la FP disséqué en milieu Neurobasal à la température ambiante. </li></ol> 2. FP Culture Remarque: Toutes les mesures doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte de culture de tissu. Utilisez milieu frais et les suppléments et les réactifs fraîchement décongelé. Préparer des lamelles de verre stériles, neurobasal chaud + B27, le plasma et HBSS-thrombine. 2.1 FP culture <ol><li> Placer plusieurs lamelles stériles dans une boîte de Petri de 100 mm et la pipette 20 ul de plasma dans le centre de chaque lamelle. </li><li> Transfert de deux à quatre FP dans chaque goutte de plasma et d&#39;ajouter 20 ul de HBSS-thrombine à côté de la chute de plasma et mélanger soigneusement. Gardez les lamellespendant au moins dix minutes à température ambiante pour permettre la coagulation du plasma. </li></ol> Remarque: Le transfert de deux MF en cas de dissection complète et plus en cas de dissection partielle. Mélanger doucement avec une pipette et éviter tout contact avec des explants de PF. Le caillot de plasma se rétracte quelques um comme un signe de la coagulation. La coagulation ne doit pas être interrompue prématurément, afin d&#39;éviter le détachement du caillot de plasma. <ol start="3"><li> Transférer chaque lamelle dans une plaque de 24 puits et ajouter 500 ul de Neurobasal + B27. Incuber 48 heures à 37 ° C. </li></ol> JOUR 3 3. FP milieu conditionné (FP cm) récolte Remarque: La récolte doit être effectuée dans des conditions stériles dans une hotte de culture de tissu. Si le surnageant est contaminé ou si les plaques de sol sont flottantes (ce qui signifie qu&#39;ils aurait pu mourir pendant les péri de la cultureod) alors ne pas récolter la FP cm à partir de ce bien. 3.1 FP cm récolte <ol><li> Récolter soigneusement le milieu de chaque puits. </li></ol> Note: Ne pas pipeter le mélange plasma-thrombine polymérisé ou des fragments de PF. <ol start="2"><li> Stocker des aliquotes de 100 ul à -80 ° C. </li></ol> JOUR 4 4. Dissection de la moelle épinière Commissural neurones de E12.5 embryons de souris Remarque: Cette préparation n&#39;a pas besoin d&#39;être effectuées dans des conditions stériles. Suivez la procédure décrite ci-dessus pour recueillir les embryons. Préparer PBS froid, froid HBSS-6.5% de glucose et neurobasal froid. 4.1 vertébrale dissection du cordon <ol><li> En utilisant des pinces, décapiter l&#39;embryon. </li></ol> Remarque: Couper entre la mâchoire inférieure et le cerveau postérieur, la partie postérieure du cerveau postérieur est important pour l&#39;prochaines étapes. <ol start="2"><li> Placez l&#39;embryon face ventrale dans une nouvelle chute avec la partie antérieure face à l&#39;expérimentateur. </li><li> Pincer la peau de l&#39;embryon avec une pince et l&#39;autre se détacher de la peau. </li></ol> Remarque: Cette étape doit être répétée jusqu&#39;à ce que la peau est complètement retiré de la partie antérieure de l&#39;embryon. <ol start="4"><li> Tournez le côté embryon antérieure à la gauche. Avec une pince &quot;cerner&quot; l&#39;embryon dans la partie antérieure. Avec les autres pinces, saisir la peau et tirez vers le côté rostral de l&#39;embryon, d&#39;exposer la moelle épinière. </li><li> Utilisez un côté de la pince pour couper les méninges qui enveloppent encore la moelle épinière. La moelle épinière est maintenant exposée et ouverte. </li><li> Placez la face antérieure de l&#39;embryon vers la droite. </li><li> Détacher le tissu de la moelle épinière à partir du côté du col de l&#39;embryon. Faites glisser la pince sous la moelle épinière (maintenir la pince fermée). Pourcèpes doivent visible sous la moelle épinière. Petits mouvements de rotation en vertu de la moelle épinière sont suffisantes pour détacher le tissu adjacent et le ganglion de la racine dorsale (DRG). </li><li> Transférer la moelle épinière isolée dans une nouvelle goutte de froid HBSS-glucose 6,5%. </li><li> Placer la colonne vertébrale dans une position à plat, les méninges sur la face supérieure et antérieure à une distance à partir de l&#39;expérimentateur. </li><li> &quot;Cerner&quot; la moelle épinière à l&#39;aide du cerveau postérieur restant avec une pince, avec les deuxièmes pinces saisissent les méninges. Décoller les méninges à partir du côté rostrale de la moelle épinière. </li></ol> 4.2 Commissural Neuron dissection <ol><li> Pincez le cerveau postérieur avec une pince. </li><li> Les neurones commissurales sont situés dans la partie la plus latérale de la moelle épinière (le côté dorsal). Découpez cette partie latérale avec un scalpel fin. </li></ol> Remarque: La partie dorsale de la moelle épinière peut être distinguée de la partie ventrale par la différence de cellule densité, la partie ventrale est plus opaque. Remarque: Pour couper les deux côtés avec la même qualité, commencer par la face rostrale et couper alternativement une petite longueur du côté droit et du côté gauche. <ol start="3"><li> Conserver le tissu disséqué en milieu Neurobasal sur la glace pour une utilisation immédiate. </li></ol> 5. Traitement des tissus Commissural avec le FP cm Remarque: Cette procédure ne nécessite pas de conditions stériles. Le tissu doit être prélevé dans les différents tubes de 1,5 ml. La gelée FP cm doit être utilisé qu&#39;une seule fois. Évitez regel multiples. Préparer chaud FP cm (37 ° C). 5.1 Traitements de neurones commissure <ol><li> Dilacerate la commissure tissu avec de petits ciseaux. </li></ol> Remarque: couper le tissu le plus petit possible, afin de potentialiser l&#39;accessibilité des cellules. <ol start="2"><li> Répartir équitablement le tissu entre les différents expérimental de traitement des conditions de contrôle et FP cm traitement. </li><li> Centrifuger les fragments de tissus à 800 x g pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Vérifiez la répartition entre les tubes. </li></ol> Remarque: Si nécessaire redistribuer et centrifuger à nouveau jusqu&#39;à ce que les fragments sont répartis de manière égale. <ol start="5"><li> Retirer le surnageant. </li><li> Ajouter les PF cm et de contrôle des traitements chauds pour les tissus. </li></ol> Remarque: le volume doit être ajustée à la quantité de la pastille et doit être au moins deux fois le volume du culot. <ol start="7"><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li></ol> Remarque: Secouer doucement toutes les 10-15 min <ol start="8"><li> Centrifuger à 800 g pendant 1 min et retirez le traitement. </li><li> Ajouter le tampon de lyse </li></ol> Remarque: Le volume doit être ajusté à l&#39;unmontage de la pastille et doit être au moins deux fois le volume du culot. <ol start="10"><li> Introduire à la pipette de haut en bas pour remettre en suspension le culot. </li></ol> Remarque: un tourbillon peut également être utilisé. <ol start="11"><li> Incuber 15 min sur la glace. </li><li> Centrifuger à 14 000 g pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Gardez le surnageant et mesurer la quantité de protéine avec un dosage de Bradford 9. </li><li> Ajouter 6x Laemmli tampon. </li><li> Incuber à 95 ° C pendant 5 min pour dénaturer la teneur en protéines. </li></ol> Note: Les échantillons peuvent être utilisés immédiatement ou sont conservés à -80 ° C. <ol start="16"><li> Évaluer les effets du traitement par Western blot 10. </li></ol> Remarque: Au moins 50 pg de protéines totales devraient être chargés pour chaque voie.

<ol><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system%3A+how+to+cross+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li>
<li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+floor+plate%3A+multiple+cells%2C+multiple+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li>
<li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li>
<li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li>
<li>Ruiz de Almodovar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+mediates+commissural+axon+chemoattraction+through+its+receptor+Flk1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1.</a> Neuron. 70, 966-978 (2011).</li>
<li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li>
<li>Kiecker, C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+organizers+in+patterning+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of organizers in patterning the nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).</li>
<li>Le Dreau, G., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube%3A+a+tale+of+three+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+collaborates+with+netrin-1+to+guide+axons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord.</a> Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).</li>
<li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler

La production de plaque de sol milieu conditionné fournit un moyen simple et efficace pour évaluer les propriétés biologiques des signaux libérés de la plaque de sol. La matrice de plasma-thrombine offre une excellente condition de la survie de tissu. Néanmoins, cet environnement enrichi pourrait être une limitation pour certains types d&#39;expériences. Ainsi, le tissu de la plaque de fond peut également être cultivé dans une matrice d&#39;agarose. La qualité de la plaque de sol milieu cond...

La plaque de sol est un centre de formation de motif bien connu de la moelle épinière en développement, jouent un rôle clé dans la spécification des progéniteurs et les lignées de cellules post-mitotiques et contrôler la navigation des axones 7,8. La procédure expérimentale décrite ici pour produire FP cm permet aux enquêteurs d&#39;évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux de plaque dérivé étage dans un des contextes différents des processus de développement, de la structuration et la survie cellulaire à cellulaire et la migration des axones. Pour illustrer l&#39;utilisation de tels FP cm, les tissus de la moelle épinière dorsale contenant des neurones commissurales sont disséqués, dilacérées et stimulées avec du FP cm. Les tissus peuvent ensuite être traitées pour l&#39;analyse Western blot. Cela permet d&#39;instruction des règlements de la machine de guidage axonal par des signaux libérés plancher plat. Procédé de traitement de tissu frais dilacérées maintient le grand avantage de conserver le micro-environnement des cellules au sein de ee tissu. Ainsi, les conséquences du traitement par FP cm ou n&#39;importe quels types de traitement sont évaluées de façon plus physiologique que dans des conditions de culture cellulaire et tissulaire.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactifs requis</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Ca2+/Mg2+- sans</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Sigma</td><td>P-3266</td><td>1 mg/ml (Reconstituer en H2O et filtrat)</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T-4648</td><td>10 mg/ml(Reconstituer en H2O et filtrat)</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>50x</td></tr><tr><td>HEPES (260 g/mol)</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5513</td><td>0,5 m, pH 8</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Euromedex</td><td>2189</td><td>1M</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>VWR</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur complet de protéase Cocktail</td><td>Tablets Roche</td><td>04 693 116 001</td><td></td></tr><tr><td>Orthovanadate de sodium (Na3VO4)</td><td>Sigma</td><td>S-6508</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H 2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tableau 1.Réactifs requis. </td></tr><tr><td colspan="4">Tools and Materials</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince à pointes fines</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Microcouteaux</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>10136-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fort>Tableau 2. Outils et matériaux. </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">Dissection et culture FP</td> </tr> <tr> <td>Ethanol 70 %</td> <td></td> </tr><tr> <td>capot de dissection</td> <td></td> </tr><tr> <td>microscope de dissection</td> <td></td> <tr><> <td>boîtes de Pétri</td> <td></td> </tr><tr> <td> lamelles de verre</td> <td>18 mm x 18 mm</td> </tr><tr> <td> Brûleur à gaz Bunsen</td> <td></td> </tr><tr> <td>Plaque à 24 puits</td> <td></td> <tr><tr> <td>incubateur de culture tissulaire (37 &deg ; C, 5 % CO2, humidité contrôlée)</td> <td></td> <tr><tr> <td>Centrifugeuse</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Recipes</td> </tr> <tr> <td colspan="2 » Milieux de culture >FP</td> </tr> <tr> <td>Neurobasal</td> <td></td> <tr><tr> <td>B27</td> <td>1/50e dilution à partir de la division </td> </tr><tr> <td colspan="2">HBSS-thrombine </td> </tr> <tr> <td>HBSS</td> <td>1 ml </td> </tr><tr> <td>Thrombine 10 mg/ml</td> <td>30 &mu ; l</td> </tr><tr> <td colspan="2">Tampon de lyse pH 7,4</td> </tr> <tr> <td>HEPES (260 g/mol) </td> <td>25 mM</td> </tr><> <td>EDTA (pH 8) </td> <td>5 mM</ td> </tr><tr> <td>MgCl2 </td> <td>1 mM</td> <tr><tr> <td>Glycérol </td> <td>10 %</td> </tr><tr> <td>IGEPAL (NP40) </td> <td>0,10 %</td> </tr>< tr> <td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase </td> <td>1x</td> <tr><tr> <td>orthovanadate de sodium </td> <td>0.2 M</td> <tr><tr> <td>H2O</td> <td><td> <tr><tr> <td colspan="2">Laemmli Tampon</td> </tr> <tr> <td>Tris 0,5 M, pH 6,8 </td> <td>375 mM</td> <tr><tr> <td>SDS</td> <td>6 %</td> <tr><tr> <td>Glycérol</td> < td>60 %</td> </tr><tr> <td>DTT</td> <td>0.6 M</td> <tr><tr> <td>Bleu de bromophénol</td> <td></td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </ tr></tbody> </table></td></tr></tbody></table>

culture de tissus isolement de la plaque au sol et la production de milieu conditionné à évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux plancher plate-publié

Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

Au cours du développement, les progéniteurs et les neurones post-mitotiques reçoivent des signaux de territoires adjacents qui régulent leur sort. La plaque de sol est un groupe de cellules gliales tapissant le canal épendymaire en position ventrale. La plaque de sol exprime morphogènes clés contribuant à la structuration de lignées de cellules dans la moelle épinière. À des stades de développement plus tard, la plaque de sol réglemente la navigation des axones de la moelle épinière, agissant comme une barrière pour empêcher le passage des axones homolatéraux et franchissement de la ligne médiane de contrôle par les axones commissure 1. Ces fonctions sont réalisées grâce à la sécrétion de diverses signaux de guidage. Certains de ces indices agir comme attractifs et répulsifs pour les axones en croissance tandis que d&#39;autres réglementent les récepteurs d&#39;orientation et de signalisation en aval de moduler la sensibilité des axones aux 2,3 signaux de guidage locales. Nous décrivons ici une méthode qui permet l&#39;étude des propriétés des signaux provenant du sol plaque dans une variété de dévecontextes lopmental, sur la base de la production de support de plancher Plate conditionné (FP cm) 4-6. Nous illustrons ensuite l&#39;utilisation de ce FP cm dans le cadre de guidage axonal. Tout d&#39;abord, la moelle épinière est isolé à partir d&#39;embryons de souris à E12.5 et de la plaque de fond est disséqué et cultivées dans une matrice plasma-thrombine (figure 1). Deuxième deux jours plus tard, le tissu commissure sont disséqués à partir d&#39;embryons E12.5, trituré et exposé à la FP cm. Troisièmement, le tissu est traité pour analyse par Western blot de marqueurs commissure.

Commissurales tissus ont été traités par le FP cm et les échantillons ont été traités pour l'analyse des niveaux des récepteurs de Western blot. Application de la FP cm a été montré pour augmenter les niveaux d'un récepteur d'orientation, PlexinA1, qui médiatise la sensibilité des axones commissure de la ligne médiane répulsif Semaphorin3B après avoir traversé (Figure 2). Cette étude a révélé que les signaux libérés par la FP régulent les niveaux PlexinA1 4,6. <p cla...

Le plancher est une structure essentielle des neurones de la moelle épinière en développement, fournissant des signaux diffusibles de progéniteurs et la différenciation. Nous décrivons une méthode pour produire des varangues milieu conditionné, à appliquer au tissu de la moelle épinière frais, et d&#39;évaluer les conséquences sur les protéines d&#39;intérêt par la biochimie.

Culture de tissus isolement de la plaque au sol et la production de milieu conditionné à évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux plancher Plate-publié

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

L’objectif général de cette procédure est d’étudier les propriétés des signaux dérivés des plaques de sol dans une variété de contextes de développement basés sur la production de milieux conditionnés par les plaques de sol. Pour ce faire, on isole d’abord la moelle épinière de l’embryon de souris en E 12,5 et on dissection la plaque de sol. La deuxième étape consiste à cultiver la plaque de sol dans une matrice de thrombine plasmatique pour produire des milieux conditionnés par plaque de sol.Ensuite, les moelles épinières d’embryons de souris en E 12,5 sont isolées et le tissu dorsal contenant des neurones vocaux et choraux est disséqué. La dernière étape est l’exposition de tissus de communication disséqués à des échantillons de milieu conditionné par des plaques de sol. En fin de compte, le tissu est traité pour une analyse biochimique telle que le western blot afin de montrer l’expression des marqueurs commissurals.Cette méthode peut aider zuki question dans le domaine de la biologie du développement. Les signaux libérés par la plaque de sol jouent un rôle crucial dans la régulation de la graisse cellulaire, de la différenciation, de la prolifération et du guidage axonal des ti

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Nous introduisons une nouvelle méthode pour le maintien de la muqueuse intestinale humaine dans la culture et le suivi de la réponse à différents types de stimuli sur au moins 24 heures. Avec notre procédé, la polarité de la conservation du tissu, ce qui permet une stimulation physiologique par voie apicale.

Une nouvelle méthode pour la Culture et polarisé stimulation des explants de muqueuse intestinale de l&#39;homme

Les bactéries produisent des composés sécrétés qui ont le potentiel d'affecter la physiologie de leurs voisins microbiennes. Nous décrivons ici un écran de co-culture qui permet la détection de ces médiation chimiquement interspécifiques interactions en mélangeant les microbes du sol avec des souches rapporteurs fluorescents transcription de Bacillus subtilis sur milieu solide.

Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

Le protocole suivant décrit la procédure d’assemblage de cultures sandwich à utiliser comme étape intermédiaire entre les environnements cellulaires bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D). Les systèmes conçus peuvent avoir des applications en microscopie, en biomécanique, en biochimie et en biologie cellulaire.

Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

La matrice extracellulaire joue un rôle majeur dans la définition du microenvironnement des cellules et dans la modulation du comportement et du phénotype cellulaires. Nous décrivons une méthode rapide pour l’isolement de la matrice extracellulaire dérivée de cellules, qui peut être adaptée à différentes échelles pour des études microscopiques, biochimiques, protéomiques ou fonctionnelles.

Un rapide, méthode évolutive pour l&#39;isolement, l&#39;étude fonctionnelle, et l&#39;analyse de la matrice extracellulaire de cellules dérivées

Ce protocole prévoit une approche rentable pour isoler et caractériser les souris primaire les cellules tubulaires rénales qui peuvent ensuite être Sub cultivées afin d’évaluer les fonctions biologiques rénales ex vivo, y compris bioénergétique mitochondriale.

Analyse de Flux extracellulaire isolement, caractérisation et un débit élevé de souris primaire tubulaire les cellules épithéliales rénales

Cellules entérochromaffines (EC) composent un petit sous-ensemble de cellules épithéliales gastro-intestinale. Cellules EC sont électriquement excitables et libérer la sérotonine, mais des difficultés dans la mise en culture et en identifiant les cellules EC ont limité des études physiologiques. La méthode présentée ici établit un modèle de culture primaire se prêtent à l’examen des cellules individuelles de EC en électrophysiologie.

Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour produire des réseaux de microtissus musculaires squelettiques humains en 3D et des tests de fonction in situ en aval mini-invasifs, y compris des analyses de force contractile et de manipulation du calcium.

Évaluation des mesures fonctionnelles de la santé des muscles squelettiques dans les microtissus musculaires squelettiques humains

Nous décrivons une approche pour détecter et capturer des sous-populations cellulaires invasives en temps réel. La conception expérimentale utilise l’analyse cellulaire en temps réel en surveillant les changements dans l’impédance électrique des cellules. Le cancer invasif, les cellules immunitaires, endothéliales ou stromales dans les tissus complexes peuvent être capturés et l’impact des co-cultures peut être évalué.

Détection et capture en temps réel de sous-populations cellulaires invasives provenant de co-cultures

Le protocole présenté décrit le développement et l’utilisation d’une technique de coloration filamenteuse à base de phalloïdine avec microscopie confocale à balayage laser (CLSM) pour visualiser la structure de la couche cellulaire adhérente dans les canaux de culture dynamique microfluidique et les chambres de culture statique traditionnelles à puits fixes. Cette approche aide à évaluer la confluence de la couche cellulaire, la formation de monocouches et l’uniformité de l’épaisseur de la...

Préparation et évaluation structurale de monocouches de cellules épithéliales dans un dispositif de culture microfluidique de taille physiologique

Nous présentons ici un protocole de culture de cellules IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle (3D).

Culture cellulaire IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle

Apprenez à produire un milieu conditionné par la plaque au sol à partir d'embryons de souris E12.5 pour étudier les signaux neuronaux dans le développement de la moelle épinière. Cette méthode permet d'analyser l'expression des marqueurs commissuraux.

Culture de tissus isolement de la plaque au sol et la production de milieu conditionné à évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux plancher Plate-publié (Vidéo) | JoVE Journal

Culture de tissus isolement de la plaque au sol et la production de milieu conditionné à évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux plancher Plate-publié

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