Deux photons Imaging calcium dans la souris Naviguer une réalité environnement virtuel

L’objectif global de l’expérience suivante est de réaliser les aspects clés de l’imagerie chronique à deux photons chez la souris, en explorant un environnement de réalité virtuelle. Ceci est réalisé en modifiant un microscope à deux photons pour une imagerie rapide et stable chez les souris au comportement. Ensuite, un tapis roulant gonflable capable de suivre la locomotion est mis en place.

Ensuite, un environnement de réalité virtuelle est préparé qui utilise un projecteur LED synchronisé avec le microscope afin de minimiser les fuites de lumière. En conséquence, des enregistrements d’images de qualité et stables sont obtenus en raison de la réduction des artefacts de mouvement, de la réduction des fuites de lumière et de la minimisation des dommages photographiques. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour mesurer la neuroactivité lors de la navigation dans un environnement de réalité virtuelle, elle peut également être facilement adaptée à une grande variété de paradigmes comportementaux différents qui nécessitent une stimulation visuelle.

Toutes les procédures animales ont été approuvées et effectuées conformément aux directives du département vétérinaire du canton de Basile. Le microscope à deux photons utilisé dans ces expériences se compose d’une tête de balayage composée d’un scanner résonant de huit ou 12 kilohertz et d’un galvanomètre standard. Cela permet des fréquences d’images de 40 ou 60 hertz à 750 fois 400 pixels et réduit la distorsion de l’image, le photoblanchiment et la phototoxicité induits par le mouvement du cerveau.

Un moteur pas à pas Z piézoélectrique à grande vitesse est utilisé pour acquérir séquentiellement des images entrelacées dans le temps à plusieurs profondeurs. Un blanker mécanique est utilisé pour réduire l’exposition laser au tissu aux points de rotation de la trajectoire de numérisation, le blanker doit être réglable pour régler sa largeur. En fonction de l’amplitude du scanner résonant, connectez un tube d’alimentation en air d’un diamètre intérieur d’au moins 10 millimètres au porte-ballon du tapis roulant et placez une quantité BLE de tube entre l’alimentation en air principale et le support de ballon pour réduire le bruit.

Placez une balle en mousse de polystyrène de 20 centimètres de diamètre dans un porte-balle conçu sur mesure et imprimé en 3D. Si le paradigme comportemental ne nécessite qu’une locomotion vers l’avant et vers l’arrière, insérez une épingle telle qu’une aiguille hypodermique de calibre 19 sur le côté de la balle. Pour limiter le mouvement de la balle dans l’axe horizontal, utilisez une ou deux souris d’ordinateur optiques pour suivre le mouvement de la balle autour de deux ou des trois axes respectivement.

Pour préparer l’environnement de réalité virtuelle, utilisez des projecteurs LED ou des écrans d’ordinateur rétroéclairés par LED pour l’affichage. Intégrez un circuit de déclenchement pour un scintillement rapide des LED pendant l’imagerie. La fréquence de scintillement de 24 kilohertz est de plusieurs ordres de grandeur au-dessus du seuil de fusion du scintillement, au-dessus duquel le scintillement n’est plus perçu par l’animal.

Ajustez la fréquence de scintillement et le cycle d’utilisation exacts pour synchroniser le flux lumineux du projecteur avec les points de rotation du scanner résonant pour le suivi de la pupille, utilisez une caméra vidéo basée sur CMO. Assurez-vous que l’appareil photo ne contient pas de filtre bloquant infrarouge. Environ deux à trois semaines après l’injection de l’indicateur de calcium génétique et l’implantation d’une fenêtre crânienne, utilisez un éclairage par épifluorescence pour vérifier la clarté et l’expression de l’implant de la fenêtre crânienne.

Clairement visible et bien défini. Les limites des vaisseaux sanguins superficiels sont une bonne indication que l’implant de fenêtre est adapté à l’imagerie un à deux jours plus tard. Pour réaliser l’expérience à deux photons, mesurez et ajustez la puissance du laser à une valeur inférieure à 50 milliwatts sur l’échantillon.

Activez ensuite le flux d’air vers le tapis roulant sphérique. Ensuite, fixez l’animal sur le tapis roulant sphérique. Les premières fois que la souris est la tête fixe.

Ce processus peut être facilité en sédatif brièvement l’animal avec de l’isofluor. Une fois que l’animal s’est habitué à la procédure, le montage peut normalement être effectué sans sédation. Notez qu’il est essentiel de minimiser le stress de l’animal pendant cette procédure.

Positionnez ensuite le système d’affichage visuel le plus près possible de l’animal pour permettre l’accès à l’animal. Assurez-vous que l’implant de fenêtre crânienne est exempt de saleté et nettoyez-le à l’eau si nécessaire, appliquez du gel à ultrasons transparent comme moyen d’immersion entre la fenêtre crânienne et l’objectif d’immersion dans l’eau pour une protection contre la lumière. Enroulez un morceau de ruban adhésif noir autour de l’objectif et de la barre de tête.

Déplacez l’arène de l’environnement virtuel dans sa position finale et ajustez la caméra vidéo pour le suivi des pupilles. Enfin, réglez l’obturateur laser pour qu’il corresponde à l’amplitude de balayage utilisée pendant l’expérience et commencez à enregistrer les données une fois les expériences terminées. Euthanasiez l’animal selon les directives de votre établissement.

La qualité de l’image dans l’imagerie calcique à deux photons de populations cellulaires marquées avec un indicateur de calcium génétique dépend en grande partie de la qualité de l’implant de la fenêtre crânienne, comme démontré ici lors de la vérification de la clarté de la fenêtre crânienne après l’injection du virus, il ne doit y avoir aucun tissu de granulation ou repousse osseuse visible. De plus, le schéma des vaisseaux sanguins superficiels doit rester inchangé et les limites du système vasculaire doivent être nettement définies. Dans le même temps, la BOI des cellules marquées doit être clairement visible au microscope à épifluorescence.

Idéalement, la préparation est suffisamment stable pour que les distorsions des deux images photoniques induites par la locomotion de la souris ne soient pas visibles dans l’image après le recalage de l’image. Les fuites de lumière du système de stimulation visuelle peuvent être entièrement éliminées en synchronisant correctement le flux lumineux du projecteur avec les points de rotation du scanner de résonance. Lorsque les données ne sont pas acquises, la fréquence de scintillement de la source lumineuse doit être deux fois supérieure à la fréquence de balayage.

Dans cet exemple, le blanker a été retiré pour illustrer l’effet de fuite de lumière montré dans les cases orange pendant la stimulation visuelle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser deux performances en imagerie, en se comportant avec des souris, en naviguant dans un environnement de réalité virtuelle. En plus de la mise en place des systèmes d’imagerie et de réalité virtuelle décrits ici, la clé du succès de ces expériences est la maîtrise de la technique de l’implant de fenêtre crânienne.

Un implant propre est une condition préalable à des images de haute qualité et à des enregistrements stables.