Name: Deux photons Imaging calcium dans la souris Naviguer une réalité environnement virtuel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez l'imagerie calcium à deux photons chez la souris naviguant dans un environnement virtuel. Cette méthode réduit les artefacts de mouvement et les fuites lumineuses pour des enregistrements neuronaux stables et de haute qualité.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut Friedrich Miescher pour la recherche biomédicale, la Société Max Planck, et la Human Frontiers Science Program.

Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés et mis en œuvre conformément aux lignes directrices du département vétérinaire du canton de Bâle-Ville. Une. Matériel et logiciel Setup <ol><li> Deux photons configuration balayage du microscope: <ol><li> Utiliser un laser infrarouge à impulsions comme source d&#39;éclairage (de largeur d&#39;impulsion &lt;120 fs). </li><li> Utilisez une tête de balayage composé d&#39;un scanner de résonance 8 ou 12 kHz et un niveau galvanomètre. Remarque: Cela permet des taux de 40 ou 60 Hz cadre à 750 x 400 pixels. Un taux de rafraîchissement élevé est essentiel pour minimiser cerveau mouvement induit de distorsion de l&#39;image. En outre, les résultats d&#39;analyse rapide de résonance dans un rendement de signal plus élevé et réduit photoblanchiment 16 et la phototoxicité. </li><li> Utilisez une vitesse élevée z-stepper piézo-électrique de façon séquentielle des images entrelacées de temps à acquérir des profondeurs multiples. Remarque: Cette option est facultative et utilisée pour augmenter le rendement de données au détriment de la vitesse de défilement. </li><li> Utilisez hoccultation écanique pour réduire l&#39;exposition au laser pour le tissu. Ajuster la largeur de l&#39;occultation selon l&#39;amplitude du scanner résonant. Remarque: En raison de la nature sinusoïdale du trajet de balayage d&#39;un scanner résonant, le faisceau laser se déplace lentement comparativement aux points de retournement de balayage. Pour éviter d&#39;endommager des tissus à ces points d&#39;exécution lorsque l&#39;exposition au laser est plus grand, une occultation mécanique est introduit dans le plan focal entre l&#39;analyse et les verres de tubes qui arrête le faisceau laser. </li><li> Pour l&#39;acquisition de données en utilisant un numériseur haute vitesse (800 MHz) en combinaison avec un gate array (field-programmable FPGA). Remarque: Les filtres passe-haut et FPGA bacs le signal de PMT en pixels. La combinaison du filtre passe-haut sur le FPGA et le filtre efficace passe-bas sur le résultat de l&#39;amplificateur de PMT dans un filtre passe-bande centré approximativement autour de la vitesse du laser (80 MHz) de répétition. Exemple de code FPGA est fourni en supplément. </li></ol></li><li> Installation du tapis de course gonflable sur la base de la conception de Dombeck et collègues 2 <ol><li> Connecter le support de boule à une conduite d&#39;alimentation en air au moyen d&#39;un tube d&#39;alimentation en air d&#39;au moins 10 mm de diamètre intérieur. Maximiser la section transversale de l&#39;entrée d&#39;alimentation en air de support de balle et la placer quantité suffisante de tuyau entre l&#39;arrivée d&#39;air principal et le porte-ballon. Remarque: section transversale accrue et la longueur accrue de la tubulure d&#39;amenée d&#39;air permet de réduire la génération de bruit. </li><li> Placez une balle en mousse de polystyrène (20 cm de diamètre) dans un porte-balle et imprimé en 3D conçu sur mesure. </li><li> Si le paradigme de comportement ne nécessite avant (et arrière) locomotion, limiter le mouvement de la balle à l&#39;(pitch) axe horizontal par l&#39;insertion d&#39;une broche (par exemple un G de l&#39;aiguille 19 hypodermique) sur le côté de la balle Note:. Généralement les animaux s&#39;adaptent à l&#39;installation beaucoup plus rapide dans ce paradigme de rotation réduite. </li><li> mouvement de la piste de la balle à l&#39;aide d&#39;un ou deux souris d&#39;ordinateur optiquepour détecter le mouvement autour de deux ou trois axes, respectivement. Remarque: Les souris d&#39;ordinateur devraient idéalement fonctionner avec une diode infrarouge pour moins d&#39;interférence avec l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Configuration de l&#39;environnement de réalité virtuelle <ol><li> Préparer l&#39;environnement de réalité virtuelle. Remarque: Un environnement de l&#39;échantillon sur la base Panda3D, un moteur de jeu disponible gratuitement, est fourni en supplément. Les objets de l&#39;environnement virtuel sont générées en utilisant Wings3D, un modeleur 3D open source. L&#39;exemple de programme lit les informations de position sur une carte d&#39;acquisition de données et le traduit en un mouvement dans l&#39;environnement virtuel. Le code exécute également la transformation non-linéaire pour l&#39;environnement nécessaire pour être projetée sur un écran toroïdal. La construction détaillée de l&#39;écran toroïdal a été décrite ailleurs 14,17. </li><li> Utilisez projecteurs à LED ou écrans d&#39;ordinateur LED rétro-éclairé pour afficher l&#39;environnement virtuel. Intégrer un cir de déclenchementCuit de scintillement rapide des DEL lors de l&#39;imagerie. Remarque: Un problème inhérent à l&#39;imagerie à deux photons pendant la stimulation visuelle est la lumière de fuite provenant du système de stimulation visuelle, qui peut être réduit en protégeant l&#39;objectif. Cependant, la lumière de fuite du système de stimulation visuelle peut être entièrement supprimée par la synchronisation de la sortie de lumière du projecteur sur les points du scanner à résonance (lorsque les données ne sont pas acquis) d&#39;exécution, comme on le fait avec les arènes de LED utilisées pour la stimulation visuelle lors de l&#39;imagerie dans Drosophila 18. Cela se traduit par une alternance haute vitesse effective de stimulation visuelle et d&#39;acquisition de données (voir la figure 2). La fréquence de clignotement (24 kHz) est de plusieurs ordres de grandeur au-dessus du seuil critique de fusion, au-dessus duquel le scintillement n&#39;est plus perçu par l&#39;animal. Le schéma du circuit électronique de cette modification à un projecteur LED du commerce est représenté sur la figure 3. </li></ol></li><li> Chiotsuivi il <ol><li> Utilisation d&#39;une caméra vidéo sur la base de CMOS (30 fps) pour le suivi de position de la pupille. Assurez-vous que l&#39;appareil photo ne contient pas de filtre de blocage infrarouge. Remarque: L&#39;élève est visible à contraste élevé lors des enregistrements en raison de la lumière parasite de deux photons laser d&#39;excitation sortant par l&#39;œil. position de la pupille et le diamètre est extrait en temps réel en utilisant un logiciel programmé sur mesure basé sur la conception de Sakatani et Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. Injection de l&#39;indicateur de calcium génétique et la fenêtre de l&#39;implant L&#39;injection d&#39;un indicateur de calcium 20 et l&#39;implantation de la fenêtre crânienne 21 sont réalisées comme décrit précédemment avec les ajouts suivants: <ol><li> Injecter du virus dans la région d&#39;intérêt en utilisant une pipette d&#39;injection de verre remblayée avec une solution de virus, et relié à un système d&#39;injection sous pression. Régler la pression en fonction de la pipette du centre-diamètre, typiquement environ. 70 à 140 mbar, pour injecter environ 100 nl d&#39;une solution de virus, au cours de 1-2 min. Faible volume impulsions d&#39;injection livrés à basse fréquence (0,05 impulsions sec à 2 Hz) doivent être utilisées pour éviter le débordement du virus le long de la pipette lors de l&#39;injection. Remarque: Afin de contrôler le volume d&#39;injection, la pipette peut être marqué à petit , longueurs espacés (par exemple 0,5 mm) sous un microscope stéréo. Le déplacement du ménisque entre les marquages ​​peut ensuite être utilisée pour estimer le volume injecté. </li><li> Plusieurs semaines post injection cela devrait aboutir à un bolus de cellules densément marqués avec un diamètre d&#39;environ 500 um. L&#39;efficacité d&#39;expression GECI dans la région d&#39;intérêt dépend du choix de GECI et la combinaison du promoteur, ainsi que le titre infectieux et le sérotype de l&#39;AAV recombinant utilisé. Remarque: Comme exemple représentatif, avec injection de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 un tit viraleer de 8 x 10 12 GC / ml dans le cortex visuel primaire d&#39;un résultat de la souris dans l&#39;expression satisfaisante à environ deux semaines après l&#39;injection (figure 1). </li><li> Le bar de la tête ne doit pas obstruer le champ visuel de la souris, mais doit être suffisamment rigide pour permettre l&#39;imagerie stable pendant comportement. Cela nécessite généralement deux points de fixation de chaque côté de la barre de la tête (voir la figure 1). Pour fixer fermement la barre de la tête sur le crâne, veillez à optimiser et sécher la zone du crâne exposé où la barre de la tête sera fixée. En outre, à l&#39;aide d&#39;un scalpel ou d&#39;une seringue, gratter le crâne pour créer des rainures superficielles augmentant ainsi l&#39;aire de surface pour le collage. Couvrir l&#39;os avec de la colle cyanoacrylate tissu avant de fixer la barre de la tête avec du ciment dentaire. </li></ol> 3. Procédure expérimentale <ol><li> Deux à trois semaines après l&#39;injection de virus, vérifiez la fenêtre implant crânien pour plus de clarté et d&#39;expression sous epifluorescence éclairage. Limites clairement visibles et bien définies de vaisseaux sanguins superficiels sont une bonne indication que l&#39;implant de fenêtre est adapté pour l&#39;imagerie (voir la figure 1). </li><li> Mesurer et régler la puissance du laser à une valeur inférieure à 50 mW à l&#39;échantillon. </li><li> Allumez le flux d&#39;air sur le tapis roulant sphérique. </li><li> Pour la tête de fixation sous le microscope, anesthésier brièvement l&#39;animal avec de l&#39;isoflurane à réduire le stress. Placez l&#39;animal dans un récipient de l&#39;isoflurane et attendre les arrêts d&#39;animaux en mouvement (environ 10 secondes). Retirer l&#39;animal et immédiatement la tête fixer sous le microscope. </li><li> Positionner le système d&#39;affichage visuel le plus près possible de l&#39;animal afin de permettre l&#39;accès au reste de l&#39;animal. Le contact visuel moins l&#39;animal a avec l&#39;expérimentateur, le moins stressé l&#39;animal sera au cours de la phase initiale de l&#39;expérience. </li><li> Assurez-vous que la fenêtre implant crânien est exempt de poussière et de la saleté. Nettoyer à l&#39;eausi nécessaire. </li><li> Appliquer le gel échographique claire milieu d&#39;immersion entre la fenêtre crânienne et objectif immersion dans l&#39;eau. Cela résout les problèmes de lenteur dégradation de l&#39;image due à l&#39;évaporation de l&#39;eau ou des fuites et réduit le besoin de monter un cône sur la barre de la tête pour retenir l&#39;eau. Remarque: Centrifugeuse le gel avant utilisation pour enlever toutes les bulles d&#39;air, et de prendre soin de ne pas créer d&#39;air des bulles lors de l&#39;application du gel. Des bulles d&#39;air peuvent gravement nuire à la qualité de l&#39;image. </li><li> Enrouler un morceau de ruban adhésif noir autour de la barre objectif et la tête pour protection contre la lumière. </li><li> Déplacez le domaine de l&#39;environnement virtuel à sa position finale et ajuster la caméra vidéo pour le suivi des élèves. </li><li> Régler le système d&#39;occultation laser pour correspondre à l&#39;amplitude de balayage utilisé lors de l&#39;expérience. </li><li> Commencer l&#39;enregistrement des données. </li></ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
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<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
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<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La clé du succès de comportement imagerie à deux photons est la stabilité de la préparation de deux façons: <ol><li> Au cours de la fenêtre de jours après l&#39;implantation, les réponses inflammatoires du tissu peut conduire à l&#39;amélioration de la formation du tissu de granulation et du cartilage qui va gêner ou même empêcher l&#39;imagerie. </li><li> Pendant l&#39;expérience, le cerveau doit être suffisamment stable pour éviter les artefacts de mouvement de corrompre neuronal signal de fluorescence de l&#39;ac...

Imagerie à deux photons des indicateurs de calcium (codés génétiquement comme GCaMP5 7 ou R-GECO 8, ou des colorants synthétiques comme OGB ou Fluo4) a émergé comme une puissante méthode de mesure de l&#39;activité neuronale en comporter souris 1-6. Il permet la mesure simultanée de l&#39;activité de plusieurs centaines de cellules à l&#39;action quasi-unique résolution potentielle, jusqu&#39;à environ 800 um en dessous de la surface du cerveau 9,10. En outre, en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) l&#39;activité neuronale peut être mesurée de façon chronique 5,11,12, et dans des types cellulaires génétiquement déterminées 13. Ensemble, ces méthodes fournissent un degré de résolution temporelle et spatiale qui ouvrent une multitude de nouvelles possibilités dans l&#39;étude de calcul neuronal in vivo. Une intervention chirurgicale est nécessaire d&#39;exposer et étiqueter le cerveau de la souris pour l&#39;imagerie. Les cellules sont transfectées en utilisant typiquement un vir adéno-associé recombinant<html> nous système (AAV) pour la livraison GECI et une fenêtre crânienne est implanté sur le site d&#39;injection pour obtenir un accès optique au cerveau. Une barre de tête est ensuite fixé sur le crâne pour la tête de fixation sous le microscope à deux photons. La conception et la mise en œuvre de ces étapes est essentiel car la plupart des problèmes de l&#39;imagerie éveillé découlent de l&#39;instabilité dans la préparation. Idéalement, le procédé décrit ici devrait permettre l&#39;imagerie chronique pouvant aller jusqu&#39;à plusieurs mois après la chirurgie. Pour activer le comportement guidé visuellement lors de l&#39;imagerie à deux photons, la tête la souris fixe se trouve sur un tapis roulant sphérique de l&#39;air pris en charge, qu&#39;il peut utiliser pour naviguer dans un environnement de réalité virtuelle. Locomotion de la souris sur le tapis roulant est couplé au mouvement dans l&#39;environnement virtuel qui s&#39;affiche sur un écran toroïdal entourant le 14,15 de la souris. Variables comportementales telles que la locomotion, stimulus visuel, et la position de la pupille peuvent être enregistrées 6. t &quot;&gt; Nous décrivons les procédures impliquées dans chronique imagerie à deux photons dans les souris d&#39;explorer un environnement de réalité virtuelle Les principaux points abordés sont:. réduction des artefacts de mouvement, la réduction des fuites de lumière, la maximisation du nombre de cellules enregistrées simultanément, et la minimisation des dommages photo. Nous fournissons également des détails sur la mise en place du tapis de course gonflable, le suivi des élèves, et l&#39;environnement de réalité virtuelle. Les procédures décrites ici peuvent être utilisés pour l&#39;imagerie des populations de cellules marquées par fluorescence dans des souris fixes de la tête dans une potentiellement grande variété de paradigmes comportementaux .

<table><tbody><tr><td>Lamelles de recouvrement (diamètre = 3-5 mm)</td><td>Implant de fenêtre</td> <td>de Menzel</td><td></td></tr><tr><td>InSight DeepSee laser Microscope</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Scanner</td></tr><tr><td>12 kHz Scanner de résonance</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Galvomètre</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Numériseur</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>microscope</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>Microscope National Instruments</td><td>PXIe 7965R</td><td></td></tr><tr><td>Carte d’acquisition</td><td>Microscope National Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’émission 525/50</td><td>Microscope Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Capteur piézo-électrique z-drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de microscope pour microscope piézo-électrique entraînement</td><td>Microscope Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 16X, 0.8NA</td><td>Microscope Nikon</td><td>CFI75</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur de courant</td><td>Microscope Femto</td><td>DHPCA-100</td><td></td></tr><tr><td>Tube photomultiplicateur</td><td>Microscope</td><td>Hamamatsu</td><td></td></tr><tr><td>Caméra USB sans filtre IR</td><td>ImageSuivi</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de la source DMK22BUC03 de la pupilleObjectif 50 mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>Suivi de la pupille</td></tr><tr><td>Bagues d’adaptation macro</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td><td>Suivi de la pupille</td></tr><tr><td>Souris d’ordinateur optique</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>Suivi de mouvement</td></tr><tr><td>Boule en polystyrène 20 cm</td><td>, par ex. idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>environnement</td></tr><tr><td>virtuel Projecteur LED</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>virtual environnement</td></tr><tr><td>Carte d’acquisition</td><td>National Instruments</td><td>Environnement virtuel NI 6009</td><td></td></tr><tr><td>Moteur</td><td></td> de jeu Panda3D<td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td><td>environnement virtuel</td></tr><tr><td>Bibliothèque Numpy pour Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>environnement virtuel</td></tr><tr><td>Scipy bibliothèque pour Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>environnement virtuel</td></tr><tr><td>NI-DAQmx driver</td><td>National Instruments</td><td><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td><td>environnement virtuel</td></tr><tr><td>Gel d’échographie</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td>imagerie</td></tr></tbody></table>

deux photons imaging calcium dans la souris naviguer une réalité environnement virtuel

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Au cours des dernières années, l&#39;imagerie à deux photons est devenu un outil précieux dans les neurosciences, car il permet de mesurer chronique de l&#39;activité des cellules génétiquement identifiés lors de comportements 1-6. Nous décrivons ici les méthodes d&#39;effectuer une imagerie à deux photons dans le cortex de la souris alors que l&#39;animal navigue un environnement de réalité virtuelle. Nous nous concentrons sur les aspects des procédures expérimentales qui sont essentiels à l&#39;imagerie chez un animal se comporter dans un environnement virtuel bien éclairée. Les principaux problèmes qui se posent dans ce dispositif expérimental que nous sommes ici adresse: minimiser les mouvements des artefacts liés au cerveau, en minimisant les fuites de lumière à partir du système de projection de la réalité virtuelle, et en minimisant induite par laser des lésions tissulaires. Nous fournissons également des logiciels de l&#39;échantillon à contrôler l&#39;environnement de réalité virtuelle et de faire le suivi des élèves. Avec ces procédures et les ressources, il devrait être possible de convertir un microscope à deux photons pour une utilisation conventionnelle en se comportant souris.

La qualité de l&#39;image en deux photons imagerie calcique de populations de cellules marquées avec un GECI dépend largement de la qualité de la fenêtre implant crânien. Deux semaines après l&#39;injection du virus de la fenêtre crânienne doivent être inspectés pour plus de clarté. Il devrait y avoir aucun tissu de granulation ou de la repousse osseuse visible (Figure 1A). En outre, le motif de vaisseaux sanguins superficiels devrait rester inchangé et les limites du système vasculaire doit être nettem...

Nous décrivons ici les procédures expérimentales impliquées dans l&#39;imagerie à deux photons de cortex de la souris pendant le comportement dans un environnement de réalité virtuelle.

Deux photons Imaging calcium dans la souris Naviguer une réalité environnement virtuel

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de réaliser les aspects clés de l’imagerie chronique à deux photons chez la souris, en explorant un environnement de réalité virtuelle. Ceci est réalisé en modifiant un microscope à deux photons pour une imagerie rapide et stable chez les souris au comportement. Ensuite, un tapis roulant gonflable capable de suivre la locomotion est mis en place.Ensuite, un environnement de réalité virtuelle est préparé qui utilise un projecteur LED synchronisé avec le microscope afin de minimiser les fuites de lumière. En conséquence, des enregistrements d’images de qualité et stables sont obtenus en raison de la réduction des artefacts de mouvement, de la réduction des fuites de lumière et de la minimisation des dommages photographiques. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour mesurer la neuroactivité lors de la navigation dans un environnement de réalité virtuelle, elle peut également être facilement adaptée à une grande variété de paradigmes comportementaux différents qui nécessitent une stimulation visuelle.Toutes les procédures animales ont été approuvées et effectuées conformément aux directives du département vétérinaire du canton de Basile. Le microscope à deux photons utilisé dans ces expériences se compose d’une tête de balayage composée d’un scanner résonant de huit ou 12 kilohertz et d’un galvanomètre standard. Cela permet des fréquences d’images de 40 ou 60 hertz à 750 fois 400 pixels et réduit la distorsion de l’image, le photoblanchiment et la phototoxicité induits par le mouvement du cerveau.Un moteur pas à pas Z piézoélectrique à grande vitesse est utilisé pour acquérir séquentiellement des images entrelacées dans le temps à plusieurs profondeurs. Un blanker mécanique est utilisé pour réduire l’exposition laser au tissu aux points de rotation de la trajectoire de numérisation, le blanker doit être réglable pour régler sa largeur. En fonction de l’amplitude du scanner résonant, connectez un tube d’alimentation en air d’un diamètre intérieur d’au moins 10 millimètres au porte-ballon du tapis roulant et placez une quantité BLE de tube entre l’alimentation en air principale et le support de ballon pour réduire le bruit.Placez une balle en mousse de polystyrène de 20 centimètres de diamètre dans un porte-balle conçu sur mesure et imprimé en 3D. Si le paradigme comportemental ne nécessite qu’une locomotion vers l’avant et vers l’arrière, insérez une épingle telle qu’une aiguille hypodermique de calibre 19 sur le côté de la balle. Pour limiter le mouvement de la balle dans l’axe horizontal, utilisez une ou deux souris d’ordinateur optiques pour suivre le mouvement de la balle autour de deux ou des trois axes respectivement.Pour préparer l’environnement de réalité virtuelle, utilisez des projecteurs LED ou des écrans d’ordinateur rétroéclairés par LED pour l’affichage. Intégrez un circuit de déclenchement pour un scintillement rapide des LED pendant l’imagerie. La fréquence de scintillement de 24 kilohertz est de plusieurs ordres de grandeur au-dessus du seuil de fusion du scintillement, au-dessus duquel le scintillement n’est plus perçu par l’animal.Ajustez la fréquence de scintillement et le cycle d’utilisation exacts pour synchroniser le flux lumineux du projecteur avec les points de rotation du scanner résonant pour le suivi de la pupille, utilisez une caméra vidéo basée sur CMO. Assurez-vous que l’appareil photo ne contient pas de filtre bloquant infrarouge. Environ deux à trois semaines après l’injection de l’indicateur de calcium génétique et l’implantation d’une fenêtre crânienne, utilisez un éclairage par épifluorescence pour vérifier la clarté et l’expression de l’implant de la fenêtre crânienne.Clairement visible et bien défini. Les limites des vaisseaux sanguins superficiels sont une bonne indication que l’implant de fenêtre est adapté à l’imagerie un à deux jours plus tard. Pour réaliser l’expérience à deux photons, mesurez et ajustez la puissance du laser à une valeur inférieure à 50 milliwatts sur l’échantillon.Activez ensuite le flux d’air vers le tapis roulant sphérique. Ensuite, fixez l’animal sur le tapis roulant sphérique. Les premières fois que la souris est la tête fixe.Ce processus peut être facilité en sédatif brièvement l’animal avec de l’isofluor. Une fois que l’animal s’est habitué à la procédure, le montage peut normalement être effectué sans sédation. Notez qu’il est essentiel de minimiser le stress de l’animal pendant cette procédure.Positionnez ensuite le système d’affichage visuel le plus près possible de l’animal pour permettre l’accès à l’animal. Assurez-vous que l’implant de fenêtre crânienne est exempt de saleté et nettoyez-le à l’eau si nécessaire, appliquez du gel à ultrasons transparent comme moyen d’immersion entre la fenêtre crânienne et l’objectif d’immersion dans l’eau pour une protection contre la lumière. Enroulez un morceau de ruban adhésif noir autour de l’objectif et de la barre de tête.Déplacez l’arène de l’environnement virtuel dans sa position finale et ajustez la caméra vidéo pour le suivi des pupilles. Enfin, réglez l’obturateur laser pour qu’il corresponde à l’amplitude de balayage utilisée pendant l’expérience et commencez à enregistrer les données une fois les expériences terminées. Euthanasiez l’animal selon les directives de votre établissement.La qualité de l’image dans l’imagerie calcique à deux photons de populations cellulaires marquées avec un indicateur de calcium génétique dépend en grande partie de la qualité de l’implant de la fenêtre crânienne, comme démontré ici lors de la vérification de la clarté de la fenêtre crânienne après l’injection du virus, il ne doit y avoir aucun tissu de granulation ou repousse osseuse visible. De plus, le schéma des vaisseaux sanguins superficiels doit rester inchangé et les limites du système vasculaire doivent être nettement définies. Dans le même temps, la BOI des cellules marquées doit être clairement visible au microscope à épifluorescence.Idéalement, la préparation est suffisamment stable pour que les distorsions des deux images photoniques induites par la locomotion de la souris ne soient pas visibles dans l’image après le recalage de l’image. Les fuites de lumière du système de stimulation visuelle peuvent être entièrement éliminées en synchronisant correctement le flux lumineux du projecteur avec les points de rotation du scanner de résonance. Lorsque les données ne sont pas acquises, la fréquence de scintillement de la source lumineuse doit être deux fois supérieure à la fréquence de balayage.Dans cet exemple, le blanker a été retiré pour illustrer l’effet de fuite de lumière montré dans les cases orange pendant la stimulation visuelle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser deux performances en imagerie, en se comportant avec des souris, en naviguant dans un environnement de réalité virtuelle. En plus de la mise en place des systèmes d’imagerie et de réalité virtuelle décrits ici, la clé du succès de ces expériences est la maîtrise de la technique de l’implant de fenêtre crânienne.Un implant propre est une condition préalable à des images de haute qualité et à des enregistrements stables.

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Research

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JoVE Journal

Behavior

Comportement

Pour comprendre la dynamique des réseaux de microcircuits du néocortex, il est indispensable d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. L'imagerie in vivo de calcium à deux photons est la seule méthode qui permet d'enregistrer l'activité d'une population dense de neurones avec une seule cellule de résolution.

In Vivo 2-Photon Imaging calcium dans la couche 2 / 3 de souris

Source : Maruoka, H., et. al.  Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez les souris éveillées. J. vis. exp..  (2022) Cette vidéo montre une procédure de microscopie à deux photons pour imager l’activité neuronale et la dynamique microgliale chez une souris éveillée pendant une stimulation visuelle, en mettant en évidence les transitoires calciques et les interactions cellulaires.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez une souris éveillée

Source : Lee, H. et. al., Imagerie calcique in vivo réussie avec un microscope miniaturisé monté sur la tête dans l’amygdale d’une souris se comportant librement. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre l’imagerie calcique in vivo chez une souris à l’aide d’un indice de réfraction à gradient, ou lentille GRIN, et d’un microscope miniaturisé. La configuration combine la fixation de la tête dans un système de cage mobile sans friction, stimulant les neurones et déclenchant l’afflux d’ions calcium.

Imagerie calcique microendoscopique en temps réel chez une souris en mouvement libre

Source : Thapa, R., et. al., Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à gradient d’indice pour le cerveau profond Imagerie calcique in vivo.  J. Vis. Exp. (2021)La vidéo démontre l’imagerie calcique en temps réel à l’aide d’un miniscope chez une souris transduction, en corrélant l’activité neuronale avec le comportement.

Imagerie calcique en temps réel du cortex préfrontal médian d’une souris à l’aide d’un miniscope

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée transgénique Thy1-GFP. Cette approche est combinée à l’injection d’un virus adéno-associé exprimant mCherry dans l’hippocampe dorsal. Ces techniques permettent un suivi à long terme de la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

Nous présentons un protocole pour exposer le tronc cérébral de la souris adulte du côté ventral. En utilisant une lentille à indice de réfraction gradient avec un microscope miniature, l’imagerie au calcium peut être utilisée pour examiner l’activité de la somata neuronale olive inférieure in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

L’imagerie calcique in vivo Miniscope est une technique puissante pour étudier la dynamique neuronale et les microcircuits chez des souris qui se comportent librement. Ce protocole décrit la réalisation de chirurgies cérébrales pour obtenir une bonne imagerie calcique in vivo à l’aide d’un miniscope.

Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

Ici, nous décrivons un protocole combinant l’injection de virus adéno-associés avec l’implantation de fenêtres crâniennes pour l’imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez la souris éveillée.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées

Le présent protocole décrit la fabrication d’une grande fenêtre crânienne (6 x 3 mm2) à l’aide d’une pellicule alimentaire, de silicone transparent et de verre de couverture. Cette fenêtre crânienne permet des expériences in vivo d’imagerie calcique à grand champ et à deux photons chez la même souris.

In vivo Imagerie calcique à grand champ et à deux photons d’une souris utilisant une grande fenêtre crânienne

Ici, nous présentons une configuration matérielle et logicielle open source simplifiée pour étudier l’apprentissage spatial de la souris à l’aide de la réalité virtuelle (VR). Ce système affiche une piste linéaire virtuelle vers une souris retenue par la tête fonctionnant sur une roue en utilisant un réseau de microcontrôleurs et un ordinateur monocarte exécutant un logiciel graphique Python facile à utiliser.

Un système de réalité virtuelle open-source pour la mesure de l’apprentissage spatial chez des souris retenues par la tête

Ce protocole détaille la procédure d’imagerie des réponses calciques dans le colliculus supérieur (SC) des souris éveillées, y compris l’imagerie de l’activité d’un seul neurone avec la microscopie à deux photons tout en laissant le cortex intact chez les souris de type sauvage, et l’imagerie de l’ensemble du SC avec la microscopie à grand champ chez les souris mutantes à cortex partiel.

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

Découvrez l'imagerie calcium à deux photons chez la souris naviguant dans un environnement virtuel. Cette méthode réduit les artefacts de mouvement et les fuites lumineuses pour des enregistrements neuronaux stables et de haute qualité.

Deux photons Imaging calcium dans la souris Naviguer une réalité environnement virtuel

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