La fonctionnalisation assistée par micro-ondes de poly (éthylène glycol) et peptides sur-résine pour l'utilisation dans la polymérisation en chaîne et de la Formation hydrogel

L’objectif général de cette procédure est de fonctionnaliser le polyéthylène glycol et les peptides avec des groupes acrylate de méthamphétamine pour les polymérisations en chaîne ultérieures et la synthèse d’hydrogel. Pour ce faire, on combine d’abord la méthamphétamine, l’anhydride acrylique et le précurseur fonctionnalisé par l’ONU dans un flacon à scintillation. La deuxième étape consiste à utiliser l’énergie des micro-ondes pour fonctionnaliser la cheville ou le peptide.

Ensuite, le PEG DM est dissous dans du chlorométhane, ou le peptide est clivé de la résine. Et tous les groupes de protection de la chaîne latérale sont éliminés dans un cocktail à base d’acide. La dernière étape consiste à précipiter le PEG DM ou peptide fonctionnalisé de méthamphétamine dans l’éther.

En fin de compte, la RMN des protons ou la spectrométrie de masse à temps de vol de Maldi est utilisée pour montrer la fonctionnalisation réussie de la cheville ou du macro peptidique. Bonjour, je m’appelle Amy Van Hove. Je suis doctorant au département de génie biomédical de l’Université de Rochester.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la réaction du PEG avec du fluorure acrylique de méthamphétamine est que la réaction est nettement plus rapide et plus respectueuse de l’environnement. Bonjour, je m’appelle Brandon Wilson. Je suis étudiant de premier cycle en génie chimique à l’Université de Rochester.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des biomatériaux, telles que la façon dont les hydrogels produits à partir de peg diméthyl peuvent être utilisés pour contrôler l’administration de cellules thérapeutiques dans les molécules. Bonjour, je suis Danielle Benoit, professeure adjointe au Département de génie biomédical de l’Université de Rochester. Les implications de cette technique sont pour le développement de thérapies pour une variété de maladies, car les composés synthétisés peuvent être utilisés pour des applications d’administration de cellules et de médicaments.

Avant de commencer cette procédure, préséchez la verrerie requise dans un four pendant une heure pour éviter la contamination par l’eau d’un grand bateau de lactosérum. Exit cinq grammes de cheville d’un poids moléculaire compris entre 1000 et 100 000 daltons. Le cas échéant, retirez la pièce en plastique du couvercle d’un flacon à scintillation dans le capot chimique.

Versez 10 molaires d’anhydride acrylique de méthamphétamine en excès dans un flacon à scintillation déchiré. Ajoutez ensuite du PEG dans le flacon. Ensuite, sans serrer, tournez le capuchon sur le flacon et placez le flacon au micro-ondes.

Réglez le micro-ondes sur cinq minutes à puissance maximale en portant des gants résistants à la chaleur. Retirez le flacon du micro-ondes toutes les 30 secondes. Ensuite, serrez complètement le capuchon et agitez l’échantillon pendant 30 secondes.

Desserrez le capuchon avant de remettre le flacon au micro-ondes. Répétez ces étapes jusqu’à ce que la solution ait été passée au micro-ondes pendant les cinq minutes complètes. Après avoir retiré le flacon du micro-ondes, desserrez le capuchon et laissez le PEG DM refroidir à température ambiante.

Dissoudre ensuite le PEG DM dans 10 à 15 millilitres de di chlorométhane. Précipitez le PEG DM dans 10 x l’excès de pré dathyl éther pendant 20 minutes. À l’aide d’un entonnoir Buckner de sept centimètres et d’une fiole de 500 millilitres.

Recueillir le PEG DM par filtration sous vide. Ensuite, transférez le PEG DM filtré dans un tube conique de 50 millilitres avec une aiguille de gros calibre percée à travers le capuchon pour la ventilation. Placez le tube dans une chambre à vide et séchez le PEG DM pendant la nuit.

Après avoir retiré le tube de la chambre à vide, le rouge dissout le PEG DM dans le précipité de chlorométhane DI avec de l’éther dathylique glacé. Pour éliminer l’anhydride acrylique de méthamphétamine non réactif après la filtration et la collecte, séchez le PEG DM dans une chambre à vide de la même manière que précédemment. Pour l’analyse RMN des protons, placez environ 10 milligrammes de PEG MS dans un flacon à scintillation et ajoutez environ un millilitre de chloroforme deutéré.

Une fois l’échantillon dissous, transférez-le dans un tube RMN propre. Ensuite, collectez les spectres RMN des protons et analysez les échantillons à température ambiante pendant au moins 64 balayages pour obtenir une résolution de données suffisante. Après avoir synthétisé le peptide d’intérêt par synthèse en phase solide, stockez-le sur la résine dans du DMF à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

Ensuite, collectez la résine peptidique par filtration à l’aide d’un entonnoir de sept centimètres avec du papier filtre et une fiole de 250 millilitres. Retirez la pièce en plastique du couvercle d’un flacon à scintillation et transférez la résine dans le flacon. À l’aide d’une pipette jetable, ajoutez juste assez d’anhydride acrylique pour couvrir la résine Après avoir légèrement tordu le capuchon sur le flacon, placez-le au micro-ondes et réglez la minuterie sur trois minutes.

À puissance maximale en portant des gants résistants à la chaleur, retirez le flacon du micro-ondes toutes les 15 à 20 secondes. Après avoir complètement serré le bouchon, agitez l’échantillon pendant 15 secondes. Desserrez le capuchon avant de remettre le flacon au micro-ondes.

Répétez ces opérations jusqu’à ce que la solution ait été passée au micro-ondes pendant les trois minutes complètes. Une fois le capuchon du flacon desserré, laissez la solution peptidique refroidir à température ambiante à l’aide d’une petite quantité de DMF et d’un entonnoir de sept centimètres. Avec du papier filtre et une fiole de 250 millilitres.

Récupérez la résine peptidique du flacon pour le clivage et la protection en profondeur. Transférez la résine peptidique dans un flacon à scintillation fraîche pour 0,25 millimole de peptide contenant de l’arginine. Ajouter 0,25 millilitre chacun de tri ISO, de propylène, de trois, de six dioxyde d’oxygène, un diol thiol à indice d’octane huit et 18,0 millilitres d’eau déminéralisée TFA.

Ensuite, faites tourner le mélange réactionnel sur un rotateur de tremblement de terre de laboratoire pendant quatre heures à température ambiante. Une fois terminé, précipitez le peptide dans 10 fois l’excès d’éther éthylique de pré-refroidissement. Répartissez la solution uniformément dans quatre tubes coniques de 50 millilitres, centrifugez les quatre échantillons à 3, 200 G pendant 10 minutes pour recueillir le peptide après la centrifugation, décantez l’éther, remettez le peptide en suspension dans 100 millilitres d’éther éthylique frais répartis entre deux tubes coniques de 50 millilitres.

Répétez le processus de centrifugation. En suspendant le peptide dans 50 millilitres d’éther frais, deux fois pour un total de quatre lavages d’éther après la dernière étape de centrifugation, décantez l’éther résiduaire et séchez le peptide pendant la nuit sous vide. Pour préparer l’échantillon à l’analyse en temps de vol de Maldi, placez un à deux milligrammes de peptide dans un tube einor de 1,5 millilitre et dissolvez l’échantillon dans un millilitre de solvant maldi.

Ensuite, préparez une solution matricielle de 10 milligrammes par millilitre d’acide hydroxycéramique Alpha Sano quatre dans le solvant multis. Combinez les solutions peptidique et matricielle dans un rapport un-à-un, repérez un microlitre de la solution combinée à trois endroits distincts sur la plaque d’échantillonnage MALDI. Séchez les taches à l’aide d’un pistolet thermique.

Ensuite, re-tachez et séchez chaque échantillon. Enfin, recueillir les données sur le temps de vol de MALDI et confirmer une augmentation de 68 grammes par mole de la masse moléculaire due à l’ajout du groupe méthamphétamine acrylamide à l’extrémité terminale du peptide. On voit ici le spectre RMN d’un PEG DM linéaire de deux kilodaltons fonctionnalisé à l’aide de la méthode assistée par micro-ondes pour cette réaction.

L’analyse RMN des protons peut être utilisée pour calculer le pourcentage de fonctionnalisation à partir du rapport observé et théorique entre les protons terminaux de méthacrylate et les protons PEG centraux. Le pourcentage global de fonctionnalisation est de 91 % et ce PEG DM est correctement fonctionnalisé pour être utilisé dans la synthèse d’hydrogel. Voir le protocole texte pour plus de détails sur le calcul du pourcentage de fonctionnalisation dû à la multitude de pics de protons qui se produisent dans l’analyse RMN des peptides de peptide de proton.

La fonctionnalisation peptidique est plus facilement étudiée à l’aide de la spectrométrie de masse à temps de vol Maldi. Ceci est démontré ici où le peptide G-K-R-G-D-S-G a été synthétisé et soumis à la fonctionnalisation de la méthamphétamine-acrylamide, une petite fraction du peptide a été clivée pour l’évaluation du poids moléculaire avant la fonctionnalisation, qui a montré que le pic de poids moléculaire observé se produisant à 676 grammes par mole, la masse moléculaire attendue du peptide, le reste du peptide a subi la fonctionnalisation du méthamphétamine acrylamide avant le clivage après la fonctionnalisation du méthamphétamine-acrylamide. Le pic de poids moléculaire observé se produit à 744 grammes par mole, le poids attendu du peptide fonctionnalisé de méthamphétamine-amilamide.

Pour démontrer la fonctionnalité du PEG DM et de la méthamphétamine, des peptides fonctionnalisés de méthamphétamine ont été produits avec et sans méthamphétamine millimolaire. ACRYLAMIDE FONCTIONNALISÉ GK R-G-D-S-G montré ici sont des images représentatives de MSC mortes en contraste de phase et en direct sur des gels de cheville seuls et sur des gels de cheville contenant le peptide fonctionnalisé de méthamphétamine. Les CSM n’ont pas été en mesure d’adhérer aux hydrogels peg fonctionnalisés par l’ONU, mais lors de l’inclusion du peptide d’adhésion cellulaire RGD, ils ont pu adhérer et se répandre à la surface de l’hydrogel.

Les images de morts vivants ne représentent pas la viabilité de la population de CSM ensemencée. Au contraire, les images fluorescentes sont destinées à faire la distinction entre les cellules d’adhérence et les petites variations de la topologie de l’hydrogel, ce qui peut être difficile avec le seul contraste de phase. Il est intéressant de noter que les cellules non étalées ensemencées sur les gels PEG uniquement se colorent positivement pour l’AM de calcium et l’homodimère AUM, ce qui indique que les cellules mouraient au moment de l’imagerie.

L’un des nombreux avantages des hydrogels PEG est leur nature hautement réglable, modifiant la composition spécifique de la cheville. L’hydrogel offre aux chercheurs un haut degré de contrôle sur des propriétés telles que le module d’élasticité, comme illustré ici. Le poids moléculaire et le pourcentage de poids du PEG sont connus pour contrôler la taille du maillage de l’hydrogel, l’hydrogel résultant, la rigidité et le taux de libération des médicaments encapsulés.

Cela a été démontré en produisant des hydrogels avec des PEG dm de poids moléculaire variable et en étudiant le module d’hydrogel et la taille de maille résultants, comme supposé l’augmentation de la masse moléculaire du peg. Macer a provoqué une augmentation de la taille des mailles d’hydrogel et une diminution de la rigidité de l’hydrogel, la taille des mailles d’hydrogel et la rigidité du gel qui en résulte peuvent également être contrôlées en modifiant le poids. Le pourcentage d’hydrogels PEG a été produit avec un poids variable.

Le pourcentage de rigidité linéaire de 10 kilodaltons en PEG DM et en hydrogel et la taille des mailles ont été déterminés comme illustré ici, l’augmentation du pourcentage de poids du PEG entraîne une diminution significative de la taille des mailles et une augmentation de la rigidité de l’hydrogel. Des hydrogels contenant de l’albumine sérique bovine encapsulée ont été formés à l’aide de peg de poids moléculaire variable, comme indiqué ici. La libération d’albumine sérique bovine se produit plus rapidement à partir d’hydrogels formés à l’aide de PEG DM de poids moléculaire plus élevé en raison de la plus grande taille des mailles à l’intérieur de l’hydrogel.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser l’accolade PEG DME à l’aide de la méthode assistée par micro-ondes et de la façon d’évaluer la fonctionnalisation à l’aide de la RMN des protons. Une fois cette procédure maîtrisée, on pourrait également utiliser l’ouverture d’anneau de groupes hydrolytiques dégradables afin de répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont la dégradation de l’hydrogel affecte la fonction cellulaire. Vous devez également avoir une bonne compréhension de la façon dont cette technique peut être utilisée pour incorporer sélectivement les fonctionnalités de la méthamphétamine acrylamide sur les séquences peptidiques terminales finales et comment évaluer cette fonctionnalisation à l’aide de la spectrométrie de masse à temps de vol multiple.

Merci d’avoir regardé.