Name: In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Apprenez à visualiser la migration des neuroblastes dans le cerveau postnatal de souris par électroporation in vivo de GFP et imagerie time-lapse sur tranches aiguës. Cette méthode permet l'analyse quantitative des dynamiques cellulaires.

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MS et YZ sont pris en charge par KCL KCL et la Chine bourses de doctorat. MO a été financée par une bourse d&#39;études de doctorat en biotechnologie et Conseil de recherches en sciences biologiques. Nous remercions Masaru Okabe et Jun-ichi Miyazaki pour le plasmide pCX-EGFP et Alain Chedotal et Athena Ypsilanti pour de précieux conseils sur l&#39;électroporation.

Cette procédure est conforme à Accueil Règlement Royaume-Uni bureau (ACT des procédures scientifiques des animaux, 1986). Les scientifiques doivent suivre les lignes directrices établies et approuvées par leurs organismes de réglementation animaux institutionnelles et nationales. Une. Postnatale électroporation 1.1. Préparation de verre capillaires, de l&#39;ADN de solutions et Electroporator <ol><li> Préparer des capillaires de verre tiré (DO: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) pour l&#39;injection d&#39;ADN. (Paramètres indicatifs pour un capillaire extracteur Sutter P-97 sont: chaleur 283; Tirer 50; Velocity 90; heure 50). Faire une marque sur le capillaire correspondant à un volume d&#39;environ 2 pl. </li><li> Régler la tension de la électroporateur à 5 impulsions carrées, 50 ms / impulsion à 100 V, avec 850 intervalles ms (100 V, impulsion ON 50 ms, impulsion OFF 850 ​​ms, impulsion 5). </li><li> Diluer à haute pureté (DO 260/280&gt; 1,80) de l&#39;ADN plasmidique à l&#39;endotoxine libre à une concentration finale de 1 à 2 ug / ulavec une endotoxine libérer un tampon Tris-EDTA ou du PBS. Il est recommandé d&#39;ajouter 0,1% de vert de production rapide de la solution d&#39;ADN (le colorant doit se propager dans le ventricule lorsqu&#39;il est injecté avec succès). </li><li> Préparer les électrodes 5-7 mm, le gel de l&#39;électrode et réchauffer le coussin chauffant. </li></ol> 1.2. Électroporation <ol><li> Suppression d&#39;un jour 2 chiot postnatal de la souris de cage et anesthésier par inhalation d&#39;isoflurane (à un débit de ~ 0,6 L / min). </li><li> Après environ 1 minute, de déterminer l&#39;état de l&#39;anesthésie à l&#39;aide de la réponse du pied presseur. Si aucun mouvement n&#39;est détecté, procéder à l&#39;injection intraventriculaire. </li><li> Charger aiguille capillaire avec 1-2 pl de l&#39;ADN en utilisant un tube d&#39;aspiration relié au tube capillaire. </li><li> Sous une source de lumière froide, tenir la tête du chiot entre le pouce et l&#39;index de votre main moins dominante. Tirez légèrement la peau du dos de la tête pour aider à l&#39;identification du point d&#39;injection à droite. </li><li> Considérons une ligne virtuelle entre l&#39;œil et til craniométriques repère lambda (figure 1A). Insérer l&#39;aiguille capillaire à environ un tiers de la longueur de cette ligne à partir de la lambda (environ 1 mm à partir du point médian de la ligne 15). Insérer le capillaire sur 2 mm de profondeur, en veillant à éviter une pénétration profonde dans le cerveau. </li><li> Injecter lentement plasmide par soufflage à travers la bouche (une seringue connectée au capillaire peut également être utilisé). Au cours de cette procédure, assurez-vous que vos doigts ne sont pas appliquer trop de pression sur le cerveau, car cela peut empêcher l&#39;injection de plasmide succès. </li><li> Arrêter l&#39;injection lorsque la quantité minimale de solution d&#39;ADN est laissé dans le capillaire. Il est recommandé d&#39;injecter à moins de 1 ul d&#39;éviter l&#39;augmentation de la pression intracrânienne délétère. </li><li> Manteau deux électrodes avec du gel et placez-les avec le côté positif sur la face latérale de l&#39;hémisphère où l&#39;ADN a été injecté (figure 1A). Pour l&#39;incorporation d&#39;ADN dans la SVZ rostrale, place des électrodes peu rostrale à lapoint d&#39;injection. Faire varier la position de l&#39;électrode peut obtenir une spécificité régionale de l&#39;électroporation dans différents domaines de la SVZ 22,25. </li><li> Initier le transfert en cours en appuyant sur la pédale impulsion de pédale. Lorsque l&#39;électroporation est terminée, vérifier la tension sur l&#39;écran de électroporateur (valeurs de tension ne doit pas être inférieure à 90 V, car les valeurs de tension plus faible corrélation avec une faible efficacité d&#39;électroporation). </li><li> Réanimer le chiot sous oxygène sur coussin chauffant pendant quelques minutes et le retourner à la cage, le plaçant loin de la mère. Assurez-vous que la mère récupère le chiot et réunit avec le reste de la litière. Après électroporation, laissez les petits avec leur mère pendant 4-7 jours avant l&#39;étape suivante. </li></ol> 2. Préparation des cultures aiguë tranche cerveau 2.1. Préparation des solutions et outils <ol><li> Les solutions suivantes sont nécessaires (il est également possible d&#39;utiliser-DMEM riche en glucose pour disséquer et d&#39;imagerie17): Dissection Medium (500 ml) Médias équilibrée de Gey - 500ml 45% Glucose - 5ml Film moyen (10 ml) 45% de glucose - 0.110 ml HEPES 1 M - 0,100 ml Pen / Strep - 0.100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 ml Glutamine - 0,200 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (rouge de phénol libre) - 8,89 ml </li><li> Réchauffez milieu de film à 37 ° C. </li><li> Placez Millicell insère dans un fond plat de la culture 35 mm de verre contenant 1 ml de milieu de film et placer dans un incubateur humidifié à 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Préparer vibratome accessoires (tournevis, chambre, lames de rasoir, de la colle). </li><li> Préparer les outils de dissection: ciseaux, petite spatule, pinces droites. </li><li> Préparer les outils pour la manipulation de tranches: petit pinceau doux ou anse (taille: 10 pi), pipettes Pasteur en plastique, une boîte de glace et plusieurs plats en plastique 6 cm. </li><li> Prérefroidir le milieu de dissectionà 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Préparation des tranches de cerveau <ol><li> Remplir un plat de 6 cm avec un milieu de dissection pré-refroidi et placez-le sur la glace (pour garder des tranches fraîchement coupées). </li><li> Après la dislocation cervicale, utiliser des ciseaux pour décapiter le chiot de la souris. Retirez le cuir chevelu avec un scalpel, couper le crâne long de la suture mi-sagittal de l&#39;OB pour le cervelet et retirez délicatement les volets crâniens aide d&#39;une pince. Assurez-vous que l&#39;ensemble du cerveau est exposé et soigneusement disséquer à l&#39;aide d&#39;une spatule, en prenant soin de ne pas endommager le tissu. La dissection doit être fait avec soin, mais en même temps très rapidement (moins d&#39;une minute si possible). Dislocation cervicale est notre méthode préférée, car l&#39;anesthésie terminaux avec des anesthésiques médicaments / de gaz peuvent influencer les propriétés de migration des neuroblastes et l&#39;état de santé des cultures tranche de cerveau, qui doivent être imagé relativement rapidement après le sacrifice animal. </li><li> Hemisect le cerveau avec un razou lame (Figure 2). Jeter hémisphère non injectée ou à d&#39;autres expériences. </li><li> Placer un petit morceau de ruban adhésif sur le support de vibratome et utiliser la quantité minimale nécessaire de la colle pour fixer l&#39;hémisphère du cerveau au-dessus de celui-ci (figure 2). Ceci permet d&#39;éviter d&#39;endommager la surface de support à des applications répétées en raison de la colle. </li><li> Laissez la colle sécher pendant quelques secondes. </li><li> Placez support dans le bac vibratome rempli de solution de dissection pré-refroidi. Pointer le bulbe olfactif vers la lame (Figure 2). </li><li> Commencez à couper l&#39;hémisphère du cerveau en utilisant les paramètres appropriés. Les paramètres suivants sont recommandés: épaisseur de la tranche 300 um; vitesse ~ 3-5, la fréquence ~ 9. Haute fréquence et basse vitesse sont recommandés pour éviter d&#39;endommager la tranche. </li><li> Recueillir tranches à l&#39;aide d&#39;un petit pinceau ou une anse doux. Ne garder que les tranches avec OB visible (habituellement 2-3 tranches / cerveau). Typiquement, la tranche contenant la plupart des RMS can se trouve à ~ 300 um de la surface inférieure. </li><li> Vérifiez tranches sous un microscope fluorescent standard pour le signal de la GFP (en prenant soin de les retourner pour vérifier fluorescence des deux côtés), et choisir celles montrant la fluorescence lumineuse le long de la plupart des RMS. </li></ol> 2.3. La culture de tranches de cerveau <ol><li> Dans une hotte de culture cellulaire, couper la troisième plus caudale de la tranche de cerveau et enlever toute trace de colle en utilisant une pince à épiler droites fines ou un scalpel de microdissection. </li><li> Délicatement aspirer la tranche à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en plastique (couper la pointe de la pipette pour créer une plus grande ouverture, ce sera de ne pas endommager la tranche) et le placer sur le centre d&#39;un Millicell préchauffé insert. </li><li> Assurez-vous que le côté avec le signal fluorescent lumineux est placé en contact avec le Millicell insérer (pour l&#39;imagerie avec un microscope inversé). </li><li> Retirer la solution de dissection excès au-dessus de l&#39;insert avec une pipette. </li><li> Laissez cultures tranche des&#39;installer dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° pendant au moins 1 h avant l&#39;imagerie. </li></ol> 3. Imagerie time-lapse de la migration neuroblaste <ol><li> Au moins 2 heures avant l&#39;imagerie, allumez le système Perkin Elmer UltraViewVoX confocale à disque rotatif, inversé Nikon Ti-E microscope, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) caméra CCD refroidie numérique, et le système de chauffage (Solent scientifique) fixé à la constante température de 37 ° C. </li><li> Ouvrez le module d&#39;acquisition de logiciels de Volocity et cliquez sur le bouton &quot;Viz&quot; et sélectionnez le laser (s) pour l&#39;imagerie. </li><li> Dans 2 heures de cerveau préparation de tranches, placez le plat de fond de verre contenant la tranche de cerveau dans la chambre d&#39;imagerie sur la platine du microscope. </li><li> Utilisez un objectif Nikon FCI super plan Fluor ELWD 20X/0.45 sous la lumière fluorescente approprié de choisir et de se concentrer le domaine de la tranche qui sera imagée (par exemple, la première partie descendante du RMS juste après le site d&#39;injection, ou la elbow région des RMS, ou juste après le coude avant neuroblastes entrer l&#39;OB). </li><li> Mettre en place l&#39;imagerie time-lapse avec les actions suivantes: <ol><li> Sur le microscope, cliquez sur le bouton L100 pour permettre à balayage laser de l&#39;échantillon. </li><li> En Volocity, ouvrez le changeur laser ultraView en sélectionnant le laser approprié (par exemple 488 nm laser pour la GFP). </li><li> Régler le temps d&#39;exposition (en général entre 100 à 500 ms) et de l&#39;intensité du laser (en général 20 à 30%) en fonction de l&#39;intensité du signal fluorescent. </li><li> Réglez le gain d&#39;image numérique pour améliorer la visualisation de la cellule. </li><li> Sélectionnez l&#39;intervalle z-pile à l&#39;image à l&#39;intérieur de la tranche de cerveau (généralement sur ​​une intervalle de 100-120 um). Choisir un intervalle d&#39;un nombre approprié de cellules isolées pour éviter des chevauchements possible, autant que possible (ce qui facilitera l&#39;analyse de suivi ultérieur). </li><li> Sélectionner l&#39;espacement entre chaque image z-pile (habituellement 2-4 um). </li><li> Choisissez le moment intErval entre chaque capture z-pile (par exemple 3 min) et la durée totale de formation d&#39;image (par exemple de 3 heures). </li><li> Cliquez sur l&#39;icône &quot;Sauvegarder&quot; pour enregistrer les modifications apportées aux paramètres d&#39;imagerie. </li><li> Appuyez sur le bouton d&#39;enregistrement pour commencer l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Alternate imagerie d&#39;échantillons témoins et expérimentaux (par exemple véhicule / traitement médicamenteux ou différents plasmides par électroporation) dans l&#39;ensemble le même jour. </li></ol> 4. Analyser neuroblaste migrations <ol><li> Dans le module Volocity quantification, ouvrez la bibliothèque souhaitée créé après avoir terminé une expérience time-lapse. Sélectionnez &quot;Mise au point étendue&quot; de la boîte en haut à gauche (figure 4A, étape 1). </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Mesures&quot; pour afficher la fenêtre de mesure (figure 4A, étape 2). </li><li> Une liste de tâches est visible dans le coin inférieur gauche de l&#39;écran. Drag &quot;Track&quot; (présent sous le titre «Divers» au bas dela liste) sur l&#39;espace ci-dessus. Cela incitera l&#39;ouverture d&#39;une nouvelle fenêtre appelée &quot;Track&quot; à la partie supérieure gauche de l&#39;écran (figure 4A, étape 3). </li><li> Sélectionnez &quot;Points&quot; de l&#39;onglet &quot;Input&quot; dans la fenêtre Track (figure 4A, étape 4). </li><li> Cliquez sur l&#39;outil Point (figure 4A, étape 5). </li><li> Commencer le suivi de la neuroblastes migration en cliquant avec la souris sur la zone centrale du corps cellulaire et de garder le suivi des mouvements de la cellule jusqu&#39;à ce que le dernier point de la time-lapse de temps est atteinte (par exemple le point numéro 61 pour un film de 3 heures de long) . </li><li> Pour obtenir des données choisir &quot;Faire Point de mesure&quot; dans le menu Mesures (figure 4B, les étapes 6-7). Une fenêtre apparaît au centre de l&#39;écran. </li><li> Dans cette fenêtre, sélectionnez &quot;Un nouvel élément de mesure appelée:&quot; et tapez un nom (figure 4C, étape 8). N&#39;oubliez pas de sélectionner l&#39;option &quot;Tous les points de temps&quot; avant presser OK (figure 4C, étape 9). Un fichier d&#39;élément de mesure apparaîtra sous le fichier time-lapse et contenir des paramètres pour l&#39;analyse quantitative (par exemple, la distance de migration, de vitesse, de déplacement, et taux de déplacement). </li><li> Double-cliquez sur le fichier d&#39;élément de mesure de l&#39;ouvrir comme une fenêtre (figure 4D, l&#39;étape 10). </li><li> Pour visualiser les pistes individuelles de cellules analysées, choisissez «Point chenilles&quot; dans les options d&#39;affichage &quot;&quot; (figure 4D, étape 11). </li><li> Faites un clic droit sur le fichier d&#39;objet de mesure et de l&#39;exporter en tant que fichier texte, qui peut ensuite être importé dans des programmes comme Excel pour analyser les paramètres de migration. </li><li> Pour mesurer les mouvements entre les images consécutives et les pauses faites par chaque cellule au cours de la période de tournage, dans le fichier d&#39;objet mesure, sélectionner des options &quot;Affichage&quot; &quot;point&quot; ou &quot;populations&quot; et cliquez sur ID (chaque piste a un numéro d&#39;identification unique). Exportez le fichier résultant par procéderment comme expliqué à l&#39;étape 4.10. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Migration efficace de cellules progénitrices neurales le long des RMS assure leur maturation ultérieure en neurones fonctionnels 10. Flux importants de progéniteurs neuronaux dirigés vers l&#39;OB sont visibles dans l&#39;enfance humaine et sont susceptibles de jouer un rôle important au début postnatal le développement du cerveau humain 27. De plus, ces cellules sont capables de cibler des sites du cerveau affectées par une lésion et la neurodégénérescence 4,28. Être capable de suivre e...

Dans le cerveau des mammifères, la génération de nouveaux neurones (neurogenèse) commence après la naissance principalement dans deux régions, la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire dans le gyrus denté de l&#39;hippocampe 1. Des preuves considérables recueillies au cours des dernières années prend en charge un rôle essentiel pour la neurogenèse postnatale dans les fonctions de mémoire de l&#39;ampoule de l&#39;hippocampe et olfactives 1-3. Surtout, la neurogenèse postnatale est également titulaire d&#39;un potentiel thérapeutique en raison de sa relation avec les troubles neurologiques dégénératives, et la capacité des neuroblastes à migrer vers les sites blessés dans le cerveau 4-6. La zone sous-ventriculaire (SVZ) a récemment émergé comme une niche neurogène crucial. Neuroblastes SVZ dérivés migrent vers le bulbe olfactif (OB) via le courant de migration rostrale (RMS), ce qui en fait le plus long processus de migration dans le cerveau 1,7,8 postnatale. Le / RMS / système de OB mammifère SVZ est devenu unmodèle utile pour étudier les différentes étapes de la neurogenèse, tels que la prolifération, la migration et la différenciation 1,8. Beaucoup de facteurs de croissance et signaux extracellulaires régulent la neurogenèse SVZ et migration le long des RMS, mais les mécanismes moléculaires intracellulaires sont loin d&#39;être pleinement compris 1,9. Migration correcte le long des RMS est essentiel pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones 10. En outre, certaines études ont montré que les neuroblastes SVZ dérivés peuvent migrer hors des RMS aux sites de lésions cérébrales 4-6,11-13. Ainsi, l&#39;enquête de la migration des neuroblastes mécanismes de signalisation de régulation est fondamental non seulement pour comprendre la neurogenèse, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour marquer progéniteurs neuronaux SVZ par électroporation postnatale in vivo et de suivre leur migration le long des RMS dans les cultures de tranches de cerveau de courte durée en utilisant time-lapse disque rotatif confocale microscopy. L&#39;électroporation est largement utilisé dans les études de développement de l&#39;embryon à stade adulte 14-18. Il est un outil puissant pour cibler et manipuler progéniteurs neuronaux SVZ et représente une alternative moins coûteuse et beaucoup plus rapide à l&#39;injection stéréotaxique de vecteurs viraux ou génération de modèles transgéniques 1,15,19,20. Il s&#39;agit d&#39;un procédé relativement simple qui ne nécessite pas une intervention chirurgicale et a des taux de survie élevés. Électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant dans les modèles génétiques de souris qui emploient le système loxP peut être utilisé pour cibler des gènes d&#39;intérêt ou de réaliser l&#39;étiquetage permanent des progéniteurs SVZ, ce qui représente un outil utile pour les études de la neurogenèse adulte 21,22. Imagerie RMS migration des neuroblastes dans le cerveau intact est encore difficile en raison de limitations techniques actuelles. Toutefois, ce processus peut être contrôlé à l&#39;aide confocale à disque rotatif time-lapse microscopie de tranches de cerveau de courte durée, qui fournissent un syst appropriélui ressemblant étroitement à la condition in vivo aussi prêtent à la manipulation pharmacologique 23,24. Couplage dans électroporation postnatale vivo avec imagerie time-lapse facilitera la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant neuroblastes motilité et contribuer au développement de nouvelles approches pour promouvoir la réparation du cerveau.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Plat de culture à fond en verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gey’s Milieu équilibré</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, 45 %</td><td>Sigma</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pen/ Strep</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (sans rouge de phénol)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre pour injection</td><td>Appareil Harvard</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’aspiration</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 Extracteur de capillaire</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Électroporateur à ondes carrées</td><td>Appareil Harvard</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler en platine Appareil</td><td>Harvard</td> 7 mm<td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Pédale de commande Modèle 1250F</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Gel pour électrodes</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Glue</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>Système de disque rotatif UltraViEW VoX</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Configuration personnalisée (plusieurs sources laser peuvent être utilisées) équipé d’une caméra CCD Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B</td></tr><tr><td>Logiciel Volocity Modules</td><td>d’acquisition, de quantification et de visualisation</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>Chambre environnementale pour la microscopie</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>inversé Ti-E</td> sur mesure <td>Nikon</td><td></td><td>L’objectif CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA est recommandé pour l’application décrite dans ce document</td></tr></tbody></table>

in vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans souris aiguë tranches du cerveau

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l&#39;une des principales niches neurogène dans le cerveau postnatal. Ici, cellules progénitrices neurales prolifèrent et donnent lieu à des neuroblastes capables de se déplacer le long de la courant de migration rostrale (RMS) vers le bulbe olfactif (OB). Cette migration de longue distance est nécessaire pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones dans l&#39;OB, mais les mécanismes moléculaires qui régulent ce processus sont encore peu claires. Enquêter sur les voies de signalisation contrôlant neuroblastes motilité peut non seulement aider à comprendre une étape fondamentale dans la neurogenèse, mais aussi avoir un potentiel de régénération thérapeutique, compte tenu de la capacité de ces neuroblastes de cibler des sites cérébrales affectées par une blessure, accident vasculaire cérébral, ou dégénérescence. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole détaillé pour in vivo électroporation postnatal et après imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le RMS de la souris. Électroporation postnatale peut efficacement transfecter SVZ ancêtrecellules, qui à leur tour, les neuroblastes qui migrent le long des RMS. Confocale disque en rotation time-lapse microscopie sur des cultures de tranches de cerveau de courte durée, la migration des neuroblastes peut être contrôlée dans un environnement ressemblant étroitement à la condition in vivo. En outre, neuroblaste motilité peut être suivi et analysé quantitativement. A titre d&#39;exemple, nous décrivons comment utiliser in vivo postnatale électroporation d&#39;un plasmide exprimant la GFP d&#39;étiqueter et de visualiser les neuroblastes qui migrent le long des RMS. L&#39;électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant chez la souris knock-out conditionnel qui emploient le système de LoxP peut également être utilisé pour cibler des gènes d&#39;intérêt. Manipulation pharmacologique des cultures de tranches de cerveau aiguë peut être effectuée pour étudier le rôle des différentes molécules de signalisation dans la migration des neuroblastes. En couplant électroporation in vivo avec imagerie time-lapse, nous espérons comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la motilité neuroblastes et contribuer au développementment de nouvelles approches pour favoriser la réparation du cerveau.

Étiquetage des neuroblastes migrateurs SVZ dérivés peut être observé le long des RMS, habituellement 4-8 jours après une électroporation réussie (figure 1B). Points de plus longues peuvent également être choisis, mais moins de cellules se trouvent dans les RMS, car la plupart d&#39;entre eux sont entrés dans l&#39;OB. Neuroblastes commencent acquisition morphologie typique et les caractéristiques de cellules granulaires matures dans l&#39;OB environ 2-3 semaines après l&#39;électroporation (non représen...

la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l&#39;étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l&#39;aide de l&#39;imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l&#39;analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo.

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

L’objectif global de cette procédure est de visualiser et d’analyser la migration des neuroblastes le long du flux migratoire rostral dans le cerveau postnatal de la souris. Ceci est accompli par le premier électroporé, un plasmide d’ADN enrobant une protéine fluorescente verte dans le ventricule latéral de la souris. La deuxième étape consiste à préparer des tranches de cerveau à partir de souris électroporées.Ensuite, les tranches avec le meilleur signal GFP sont sélectionnées pour la culture. La dernière étape est l’imagerie en accéléré des tranches de cerveau contenant le neuroblaste migratoire marqué à la GFP à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif. En fin de compte, les films en accéléré sont utilisés pour le suivi cellulaire et l’analyse quantitative de la migration des neuroblastes.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse, telles que la façon dont le mouvement des neuroblastes dérivés des cellules souches est guidé et régulé dans le cerveau postnatal. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’administration de vecteurs viraux est qu’elle est plus facile, moins coûteuse et moins chronophage. De plus, il permet un marquage clairsemé des neuroblastes, permettant ainsi une analyse détaillée de leur dynamique de migration.Commencez cette procédure en réglant la tension de l’électroporatisé à cinq impulsions carrées, 50 millisecondes par impulsion à 100 volts avec des intervalles de 850 millisecondes. Chargez ensuite une aiguille capillaire avec un à deux microlitres d’ADN à l’aide d’un tube d’aspirateur relié au capillaire. Ensuite, retirez un chiot souris postnatal du deuxième jour de la cage et anesthésiez-le par inhalation de fluor.Après cela, tenez la tête du chiot entre votre pouce et l’index de votre main moins dominante. Tirez légèrement la peau vers l’arrière sur la tête pour aider à l’identification du bon point d’injection. Considérons une ligne virtuelle entre l’œil et le point de repère métrique crânien Lambda.Insérez ensuite l’aiguille capillaire à environ un tiers de la longueur de cette ligne depuis le Lambda jusqu’à environ deux millimètres de profondeur par la suite, injectez le plasmide en soufflant lentement dans la bouche. Au cours de cette procédure, assurez-vous que vos doigts n’appliquent pas trop de pression sur le cerveau. Arrêtez l’injection lorsqu’il reste une quantité minimale de solution d’ADN dans le capillaire.Ensuite, enduisez les deux électrodes de gel et placez-les avec le côté positif sur le côté latéral de l’hémisphère où l’ADN a été injecté. Pour l’incorporation de l’ADN dans le Rostral SVZ, placez les électrodes légèrement rostrales jusqu’au point d’injection. Ensuite, lancez le transfert de courant en appuyant sur la pédale de commutation à impulsions.Ensuite, essuyez le gel de la tête du chiot, réanimez le chiot avec de l’oxygène sur un coussin chauffant pendant quelques minutes. Ensuite, remettez-le dans la cage et placez-le loin de la mère. Assurez-vous que la mère récupère le chiot et le réunit avec le reste de la portée.Dans cette procédure, placez les inserts de cellules millicellulaires dans une boîte de culture à fond de verre de 35 millimètres contenant un millilitre de support cinématographique. Placez ensuite la boîte de culture dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Après avoir décapité le chiot souris, retirez le cuir chevelu avec un scalpel.Ensuite, coupez le crâne le long de la suture sagittale médiane du cervelet au bulbe olfactif. Faites quelques coupes transversales supplémentaires sur le crâne et retirez délicatement les rabats crâniens à l’aide d’une pince. Assurez-vous que tout le cerveau est exposé et disséquez-le soigneusement à l’aide d’une spatule, en prenant soin de ne pas endommager les tissus.Après cela, les hémis dissèquent le cerveau avec une lame de rasoir et jettent l’hémisphère injecté d’unin. Ensuite, placez un petit morceau de ruban adhésif sur le support de vibram. Utilisez la quantité minimale de colle nécessaire pour fixer l’hémisphère cérébral dessus.Commencez à couper l’hémisphère cérébral en tranches de 300 microns. Ensuite, récupérez les tranches à l’aide d’un petit pinceau ou d’une boucle d’inoculation douce. Ensuite, vérifiez les deux côtés des coupes sous un microscope fluorescent standard pour le signal GFP et choisissez celles qui montrent une fluorescence brillante le long de la majeure partie du flux migratoire rostral.Dans une hotte d’auto-culture, coupez le tiers le plus choyé de la tranche de cerveau et enlevez toute trace de colle. Ensuite, aspirez la tranche à l’aide d’une pipette en plastique et placez-la au centre d’un insert millicellulaire préchauffé. Retirer l’excès de solution de dissection sur le dessus de l’insert à l’aide d’une pipette gilson.Laissez ensuite les cultures de tranches se déposer dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins une heure. Avant l’imagerie dans les deux heures suivant la préparation de la tranche de cerveau. Placez la parabole à fond de verre contenant la tranche de cerveau dans la chambre d’imagerie sur la platine du microscope.Ensuite, utilisez un objectif 20 x 0,45 sous la lumière fluorescente appropriée pour sélectionner et mettre au point la zone de la tranche qui sera imagée. Pour configurer l’imagerie en accéléré sur le microscope, cliquez sur le bouton L 100 pour permettre le balayage laser de l’échantillon. Ensuite, en vitesse, ouvrez le changeur de laser ultra view en sélectionnant le laser approprié.Réglez le gain de temps d’exposition et l’intensité du laser. Sélectionnez ensuite l’intervalle Zack pour imager l’intérieur du cerveau. Ensuite, sélectionnez l’espacement entre chaque image de pile ZS.Choisissez l’intervalle de temps entre chaque capture de pile ZS et la durée totale de l’imagerie. Cliquez ensuite sur l’icône d’enregistrement pour enregistrer les modifications apportées aux paramètres d’imagerie. À la fin, appuyez sur le bouton d’enregistrement pour démarrer l’imagerie dans le module de quantification de la vitesse.Ouvrez la bibliothèque créée de votre choix. Après avoir terminé une expérience time-lapse, sélectionnez Focus étendu dans la zone en haut à gauche. Cliquez sur l’onglet mesures pour afficher la fenêtre de mesure.Une liste de tâches est visible en bas à gauche de l’écran. Faites glisser la piste sur l’espace au-dessus. Cela entraînera l’ouverture d’une nouvelle fenêtre appelée track.Dans la partie supérieure gauche de l’écran, sélectionnez des points dans l’onglet de saisie de la fenêtre de piste. Cliquez sur l’outil de pointage, cliquez sur l’onglet Outils et sélectionnez l’option de suivi manuel des objets, une fenêtre s’ouvrira pour permettre à l’opérateur de commencer à suivre les cellules. Commencez à suivre le neuroblaste en migration en cliquant avec la souris sur la zone centrale du corps cellulaire et continuez à suivre le mouvement cellulaire jusqu’à ce que le dernier point temporel du laps de temps soit atteint.Pour obtenir des données, choisissez Make measurement item (Créer un élément de mesure). Dans le menu des mesures, une fenêtre apparaîtra au centre de l’écran. Dans cette fenêtre, sélectionnez un nouvel élément de mesure appelé et saisissez un nom tel élément de mesure.Le fichier contenant les paramètres d’analyse quantitative apparaîtra sous le fichier time-lapse. Double-cliquez sur ce fichier d’élément de mesure pour l’ouvrir en tant que fenêtre permettant de visualiser les traces uniques des cellules analysées. Choisissez le point suivi dans les options d’affichage et sélectionnez les cellules qui doivent être visualisées pour leur chemin migratoire.Pour analyser les paramètres de migration, faites un clic droit sur le fichier de l’élément de mesure et exportez-le sous forme de fichier texte, qui peut ensuite être importé dans des programmes comme Excel. Il s’agit d’images en accéléré d’un neuroblaste en disque rotatif prises à partir d’une tranche de cerveau sagittal de souris. Cinq jours après l’électroporation d’une GFP exprimant des images plasmidiques sont espacées d’une heure.Chaque panneau est une projection Zack de 28 images consécutives espacées de quatre microns. Les pointes de flèches indiquent quatre neuroblastes représentatifs migrant le long du RMS vers le bulbe olfactif. Ce sont les voies migratoires représentatives obtenues à partir de l’imagerie en accéléré de quatre neuroblastes.Ce graphique montre la distance migrée avec le temps de deux neuroblastes représentatifs. Ces cellules présentent un comportement motilatoire saltatoire typique. Cette vidéo montre la migration d’une section de la souris RMS avec GFP étiquetée.Neuroblaste obtenu cinq jours après électroporation d’un plasmide exprimant une GFP. Le bulbe olfactif est situé hors de vue vers le coin inférieur droit. Les piles confocales Z ont été capturées sur un disque confocal en rotation.Avec un objectif 20x toutes les trois minutes pendant trois heures sur un intervalle de 120 microns, la vitesse de lecture est de 10 images par seconde. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de pratiquer l’électroporation avant de commencer les expériences et de préparer soigneusement les cultures de tranches de cerveau aiguës dans les plus brefs délais. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser et d’analyser la migration des neuroblastes dans le cerveau postnatal de la souris.

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Nous décrivons un protocole en temps réel videoimaging de la migration neuronale dans le cerveau antérieur de la souris. La migration de viralement étiquetés ou greffés précurseurs neuronales a été enregistré en direct en utilisant des tranches aiguës imagerie à grand champ fluorescent avec un intervalle d'acquisition relativement rapide pour étudier les différentes phases de la migration cellulaire, y compris les durées des phases stationnaire et la migration et la vitesse de migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

Source : Wiegreffe, C., et al.,  Imagerie confocale en accéléré de neurones migrateurs dans une culture en coupe organotypique de cerveau embryonnaire de souris à l’aide deIn Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) Cette vidéo montre la microscopie confocale time-lapse pour observer la migration radiale des neurones corticaux à partir de la zone sous-ventriculaire à la plaque corticale via des échafaudages gliaux radiaux dans des tranches de cerveau embryonnaire de souris transduites.

Imagerie en accéléré de la migration radiale des neurones corticaux dans des tranches de cerveau embryonnaire de souris transduites

la migration des neuroblastes est une étape cruciale dans la neurogenèse postnatale. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour étudier le rôle des régulateurs candidats de la migration des neuroblastes en utilisant / petit ARN en épingle à cheveux d'ADN (shRNA) nucléofection et un test de migration 3D avec neuroblastes isolés du rongeur postnatale courant de migration rostrale.

Nucléofection de rongeurs Neuroblastes à étudier neuroblaste migrations<em&gt; In vitro</em

Ce protocole fournit des instructions pour l'observation directe des neurones corticaux migrant radialement. L' électroporation in utero , la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle sont combinés pour étudier directement et dynamiquement les effets de la surexpression ou la régulation négative des gènes d'intérêt dans les neurones migrateurs et d'analyser leur différenciation au cours du développement.

L&#39;imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant<em&gt; Dans Utero</em&gt; Electroporation

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

Ce protocole démontre une méthode simple et robuste pour étudier la croissance in situ des axones et la dynamique des cônes de croissance. Il décrit comment préparer ex vivo des tranches de cerveau aiguës physiologiquement pertinentes et fournit un pipeline d’analyse convivial.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

Ce protocole décrit une analyse organotypique optimisé pour le cerveau postnatal et à haute résolution imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le flux rostrale migrateurs.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

Apprenez à visualiser la migration des neuroblastes dans le cerveau postnatal de souris par électroporation in vivo de GFP et imagerie time-lapse sur tranches aiguës. Cette méthode permet l'analyse quantitative des dynamiques cellulaires.

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

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