Observation et quantification du compactage du gel de fibrine médié par les fibroblastes

L'objectif général de cette procédure est d'observer et d'analyser l'effet des interactions matrice-cellule sur le réalignement des fibres et les activités de remodelage de la matrice dans un système de gel de fibrine. Cela est réalisé en polymérisant d'abord un gel de fibrine tridimensionnel contenant des microbilles sur un verre de couverture placé dans un bioréacteur sous contrôle environnemental. La deuxième étape consiste à préparer une suspension cellulaire fortement concentrée, utilisée pour positionner des agrégats de fibroblastes ou d'explants X selon des motifs géométriques à la surface du gel.

Ensuite, l'échantillon est imagé toutes les 15 minutes par microscopie de contraste interférentiel différentiel pendant 48 heures. La dernière étape consiste à mesurer l'ampleur de la réorganisation et du remodelage du fibrine sous forme de déformation dans différentes régions du gel, à l'aide de la corrélation d'images numériques. En définitive, ce système d'explant permet d'organiser les cellules selon des motifs géométriques simples, facilitant ainsi la visualisation et l'analyse des mécanismes sous-jacents au remodelage matriciel et au réalignement des fibres induits par les cellules.

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie mécanique, telles que quels sont les effets de signaux mécaniques très précis dans l'espace et dans le temps sur le comportement cellulaire et les changements résultants qu'ils induisent dans la matrice tissulaire environnante. Seront démontrées dans cette procédure des étapes réalisées par Arabic de Jesus, étudiante diplômée de mon laboratoire : dissoudre délicatement du fibrinogène dans du sérum physiologique préchauffé à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit afin d'obtenir une solution mère à 33,3 milligrammes par millilitre. Préparer un pochoir sur perfil afin de définir l'emplacement de chaque explant x selon la géométrie et l'espacement souhaités.

Chaque point espacé d’environ un à deux millimètres. Cette distance correspond à un espacement idéal pour générer un alignement des fibres entre les explants. Ensuite, nettoyez soigneusement tous les composants du bioréacteur à l’aide d’éthanol à 70 % et placez les composants nettoyés sous la lumière UV d’une hotte de culture tissulaire pendant deux à trois heures avant la mise en place.

Une fois les composants du bioréacteur stérilisés, fixez le pochoir sous la zone du verre de couverture de 60 millimètres de diamètre où l'échantillon sera préparé, à l'aide de ruban adhésif. Ensuite, préparez la suspension de microbilles, suivie du fibrinogène et de la thrombine. Les solutions mères combinent 0,017 millilitre de la solution mère de microbilles et 0,149 millilitre de DMEM dans un tube de microcentrifugation afin d'obtenir une concentration de 10 millions de billes par millilitre.

Ensuite, soniquer la suspension pendant 10 minutes pour disperser les billes et homogénéiser la solution. Ajouter 0,22 millilitre de la solution mère de fibrinogène à 0,44 millilitre de tampon HEPES 20 millimolaire et à 0,1667 millilitre de la solution de microbilles dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Mélanger délicatement les composants, puis placer le tube sur de la glace dans un autre tube à centrifuger de 15 millilitres.

Mélanger ensemble : 32,8 µL de thrombine dissoute dans du sérum physiologique à 25 unités par millilitre, 131 µL de tampon HEPES 20 millimolaire, et 2,46 µL de chlorure de calcium 2 molaire.

Ensuite, mélangez soigneusement les solutions de thrombine et de fibrinogène préparées en aspirant et en expulsant cinq à dix fois jusqu'à ce que la solution soit uniformément répartie. Essayez de minimiser l'introduction de bulles dans le mélange en n'expulsant pas complètement le contenu de la pipette pendant le mélange. Déposez la solution mélangée dans des moules carrés en PDMS de huit millimètres de côté sur un coverslip le plus rapidement possible, puis laissez le gel polymériser à température ambiante.

L'ajout de thrombine entraînera la formation rapide d'un gel en environ 30 secondes après la polymérisation. Scellez le bioréacteur et préparez les explants cellulaires en récoltant des cellules de fibroblastes dermiques humains à 70 à 90 % de confluence à partir d'un flacon T75 à l'aide de trypsine, puis centrifugez-les à 200 × g pendant cinq minutes. Transférez le bioréacteur dans une hotte de sécurité biologique et retirez soigneusement le couvercle en respectant les conditions d'asepsie. Aspirez ensuite le milieu et resuspendez le culot cellulaire à une concentration finale de 20 millions de cellules par millilitre dans du DMEM contenant 10 % de FCS.

Ensuite, créez des explants en chargeant les cellules dans une micropipette et en injectant 0,3 µL de la suspension cellulaire dans le gel de fibrine polymérisé. Suivant le motif indiqué sur le pochoir, chaque explant doit contenir environ 6 000 cellules. Une fois les explants positionnés sur le gel, scellez le bioréacteur.

Ensuite, insérez les blocs chauffants et connectez les thermocouples au régulateur de température. Réglez le régulateur de température à 37 degrés Celsius et incubez les gels pendant une heure afin de permettre aux cellules de se déposer et de s'attacher à la matrice de fibrine. Puis ajoutez environ cinq millilitres de DMEM ayant été conditionné pendant deux à trois heures avec du dioxyde de carbone à 5 % et complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine, 0,1 % d'amphotéricine B et 10 microgrammes par millilitre d'aprotinine directement dans la chambre du bioréacteur.

Ensuite, refermez le bioréacteur. Utilisez une seringue pour introduire les cinq millilitres supplémentaires de milieu conditionné au dioxyde de carbone par le raccord à collerette du port d'entrée, en remplissant complètement le bioréacteur. Retirez soigneusement toute bulle d'air éventuelle. Préparez une pompe à seringue équipée d'une seringue de 10 millilitres ou de 30 millilitres remplie de milieu supplémentaire conditionné avec 5 % de dioxyde de carbone. Connectez la seringue directement au port d'entrée sur le couvercle du bioréacteur à l’aide d’un tube stérile muni d’un raccord Luer lock.

Régler le débit de perfusion sur la pompe à seringue à 0,01 millilitre par minute. Ensuite, connecter des morceaux de tubulure modifiés aux deux orifices de sortie et placer les extrémités dans un bécher de 100 millilitres. Pour recueillir les déchets, utiliser un support élévateur de laboratoire afin de régler la hauteur des entrées et sorties de telle sorte qu'aucun gradient de pression ne se développe dans l'alimentation du bioréacteur.

Remplacer régulièrement le milieu conditionné au dioxyde de carbone à 5 % dans le bioréacteur tout au long de l'expérience. Afin de maintenir le pH, fournir les nutriments et éliminer les produits résiduaires, une seringue de 10 millilitres remplie de milieu durera environ 16 heures. Placer l'objectif 20 XDIC sous le hublot du microscope et s'assurer que le polariseur, l'analyseur et le prisme sont tous en place.

Ensuite, ouvrez le logiciel d'imagerie. Mettez au point l'objectif sur la zone située entre les trois x explan et enregistrez les coordonnées X, Y et Z de cet emplacement dans le logiciel d'imagerie. Afin d'acquérir une image de toute la zone comprise entre et autour des x explan, sélectionnez l'option permettant de capturer une grande image et spécifiez la taille de la zone.

Ceci permettra d'acquérir plusieurs images autour de la zone spécifiée et de créer une grande image en mosaïque ; réglez l'intensité lumineuse et le temps d'exposition aux valeurs les plus faibles possibles. Cela aidera à éviter la mort cellulaire causée par la phototoxicité tout en fournissant une résolution suffisante pour distinguer les cellules, les microbilles et les fibres de fibrine. Notez que, dans cette expérience particulière, les fibres de fibrine ne sont pas visibles en raison de la forte densité de billes dispersantes la lumière dans le gel ; réduisez la densité des billes ou l'épaisseur du gel afin d'observer les fibres de fibrine.

Ensuite, commencez le suivi de la déformation. Commencez par créer ou télécharger un code MATLAB personnalisé, puis enregistrez les images en utilisant des microbilles réparties dans le gel comme points de référence. L'enregistrement des images garantira que les images obtenues sont prises à l'exacte même position à chaque fois.

Un réalignement des fibres a été observé entre les explants en capturant des images assemblées toutes les 15 minutes. Sur une période de 48 heures, des régions individuelles ont été extraites des images assemblées et analysées à l’aide de l’algorithme de suivi des déformations. Afin de mesurer les déformations locales à partir du déplacement des microbilles, des courbes de niveau montrent la distribution de la déformation principale maximale dans la zone de réalignement des fibres correspondant à la sangle.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois à quatre heures si elle est correctement exécutée. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'étiquetage fluorescent du collagène et des protéines du cytosquelette, ainsi que la quantification de la migration cellulaire, peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quelles voies mécanobiologiques sont impliquées dans le remodelage tissulaire, et comment ces processus sont-ils modulés par divers produits biochimiques.