Évaluation quantitative des neutrophiles migrations humaines à travers une culture d'épithélium de la vessie

L’objectif global de cette procédure est de quantifier le niveau de migration des neutrophiles à travers une barrière épithéliale de la vessie lors d’une infection bactérienne ou en réponse à des molécules d’attraction de chimiothérapie. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules épithéliales de la vessie en culture jusqu’à ce qu’elles se confluent sur des supports perméables. La deuxième étape consiste à infecter les cellules épithéliales de la vessie avec diverses bactéries ou à appliquer des molécules d’attraction de chimiothérapie sur le réservoir inférieur des supports perméables.

Ensuite, les neutrophiles sont isolés du sang veineux et sont appliqués sur le réservoir supérieur des supports perméables. La dernière étape consiste à dénombrer le nombre de neutrophiles dans le réservoir inférieur après une heure à l’aide d’un hémocytomètre. En fin de compte, le test de migration trans uro épithéliale des neutrophiles est utilisé pour évaluer les différences dans la migration des neutrophiles provoquées par divers stimuli.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des aspects de la réponse immunitaire innée lors d’une infection des voies urinaires, elle peut également être utilisée pour étudier d’autres maladies, y compris les infections bactériennes qui se produisent à d’autres surfaces muqueuses. Effectuez cette procédure dans une hotte de culture tissulaire en utilisant une technique septique à l’aide de pinces stériles. Retournez les supports perméables dans une boîte de culture de tissus stérile de 25 millimètres de profondeur.

Pour des résultats optimaux, utilisez 5 6 3 7 cellules épithéliales de la vessie qui ont subi moins de 10 sous-cultures de trypsine oculaire. Fiole de 75 centimètres carrés de 5, 6, 3, 7 alvéoles à 95 % de confluence selon le texte écrit. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, remettez doucement les cellules en suspension dans environ deux millilitres de RPMI plus jusqu’à une concentration de 3 millions de cellules par millilitre déterminée par comptage des cellules.

À l’aide d’un hémocytomètre, appliquez 50 microlitres de suspension cellulaire sur chaque support perméable sans toucher la membrane. Placez le couvercle sur le plat et placez soigneusement le plat à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant 16 heures maximum. À l’aide d’une pince stérile.

Écrivez les supports perméables dans une plaque de 24 puits contenant 0,6 millilitre de RPMI plus par. Ajoutez bien 0,1 millilitre de RPMI plus dans le réservoir supérieur de chaque support perméable avant d’incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Remplacez le milieu tous les deux jours en aspirant le milieu du réservoir supérieur, suivi du réservoir inférieur.

Appliquez ensuite du RPMI plus frais dans l’ordre inverse, en ajoutant 0,6 millilitre dans le réservoir inférieur, puis 0,1 millilitre dans le réservoir supérieur. Sept jours après l’ensemencement, les supports perméables avec 5, 6, 3, 7 alvéoles. Évaluez la confluence des cellules en remplissant le réservoir supérieur avec 0,35 millilitre de RPMI.

De plus, les cellules sont suffisamment confluentes lorsque le milieu ne s’équilibre pas entre les réservoirs supérieur et inférieur. Préparez l’inoculum bactérien et prélevez du sang de volontaires adultes comme décrit dans le protocole textuel dans une cagoule de culture tissulaire. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, transférez délicatement le sang dans un tube conique frais et stérile de 50 millilitres.

Ajouter une quantité équivalente de 3 % de dextran dans 0,9 % de chlorure de sodium. Incuber le tube à la verticale à température ambiante pendant 20 minutes sans perturber la couche inférieure. Aspirez soigneusement la couche supérieure et transférez-la dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.

Granuler les cellules par centrifugation à 300 fois G pendant 10 minutes après la centrifugation, jeter le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un volume de chlorure de sodium à 0,9 % équivalent au volume de départ du sang. Ensuite, superposez 10 millilitres de solution de centrifugation à densité dense sous la suspension cellulaire.

En préservant l’interface entre les deux phases, centrifugez à 400 fois G pendant 30 minutes sans interruption avant de jeter le surnageant pour poux les globules rouges restants. Resus, suspendez la pastille cellulaire dans 10 millilitres de chlorure de sodium froid à 0,2 % après l’incubation pendant 30 secondes, ajoutez rapidement 10 millilitres de chlorure de sodium froid, 1,6 % pour restaurer l’isotonicité granule les cellules par centrifugation à 300 fois G pendant six minutes et jetez le surnageant. Répétez ces étapes jusqu’à ce que la pastille cellulaire semble être exempte de globules rouges.

Généralement trois cycles de lyse à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres. Mettez en suspension la pastille cellulaire, principalement les leucocytes polynucléaires ou PMN dans le RPMI chaud moins à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre, déterminée par le comptage des cellules. À l’aide d’un hémocytomètre, maintenez les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à l’utilisation.

Généralement, la viabilité et la pureté de pm n sont supérieures à 99 %, comme l’ont évalué respectivement l’exclusion du bleu trian et la visualisation de la morphologie nucléaire après coloration. Pour l’essai de migration, utiliser uniquement des supports perméables porteurs de confluent. 5 6 3 7 couches de cellules.

Eloqua un millilitre de RPMI chaud moins par puits. Dans une plaque à 24 puits préparant trois puits par support perméable, aspirez le fluide des réservoirs supérieur et inférieur des supports perméables à l’aide d’une pince stérile. Transférez les supports perméables sur la plaque à 24 puits, lavez les supports perméables trois fois en transférant les supports d’un puits à l’autre.

Si un inoculum bactérien doit être utilisé, inversez les supports perméables dans une boîte de culture de tissus stérile de 25 millimètres de profondeur. Pour les expériences avec des stimuli bactériens vivants ou tués, inoculez la face apicale de chaque support perméable avec 60 microlitres de RPMI pour une infection simulée ou avec l’inoculum bactérien préparé. Placez le couvercle sur le plat et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant une heure.

Ajoutez ensuite 0,6 millilitre de RPMI moins par puits à une plaque de fixation basse de 24 puits. Préparation d’un puits par support perméable. Préparez trois puits contenant 0,5 millilitre de RPMI moins pour énumérer l’entrée de PMN.

Alternativement, si un attractif de chimiothérapie est utilisé à la place des bactéries, ajoutez l’attractif de chimiothérapie à 0,6 millilitre de RPMI moins dans la plaque à 24 puits préparée. L’étape suivante pour les deux expériences consiste à inscrire les supports perméables dans la plaque de fixation basse à 24 puits. Ajoutez ensuite 0,1 millilitre de PMN préparé dans le réservoir supérieur de chaque support perméable.

Ajoutez 0,1 millilitre de PMN directement dans les puits contenant 0,5 millilitre de RPMI moins incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant une heure. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres. Rincez la face inférieure de la membrane du support perméable avec des médias du réservoir inférieur à l’aide d’une pince stérile, raclez doucement la membrane contre le bord du puits.

Pour éliminer le PMN supplémentaire du côté apical, prélevez le PMN en raclant doucement le fond de chaque puits avec la pointe de pipette de 1000 microlitres. Et le transfert des suspensions PMN sur des micro-tubes de fuge. Énumérer le NMP à l’aide d’un hémocytomètre pour calculer le nombre total de NMP dans le réservoir inférieur.

Multipliez le nombre de PMN dans un millimètre carré par 6 000. Les données peuvent être déclarées en pourcentage du PMN d’entrée ou lorsque les numéros PMN se normalisent à 10 puissance six. Le respect du protocole décrit dans cette vidéo avec une attention particulière aux détails permet d’énumérer la migration du PMN en réponse à des stimuli, y compris des bactéries et des substances attractives de chimiothérapie infectées par la souche non pathogène e coli MG 1655.

MG 1655 tué par la chaleur ou un mutant PEC provoque significativement plus de migration pm n que l’infection simulée ou l’infection par la souche pec de type sauvage UTI 89, un isolat de cystite. L’ajout d’attractifs de chimiothérapie, FMLF ou IL eight dans le réservoir inférieur entraîne beaucoup plus de PM et de migration que le traitement simulé. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la migration des neutrophiles à travers une barrière épithéliale en réponse à des stimuli chimiotactiques.