Name: Mise en place dun modèle chirurgicalement induite chez la souris pour étudier le rôle de protection de progranuline dans larthrose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Apprenez à créer un modèle DMM chirurgical chez la souris pour étudier l'arthrose et le rôle protecteur de la progranuline. Cette méthode permet d'évaluer la progression de la maladie par analyses histopathologiques.

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Ce travail a été soutenu en partie par les NIH subventions de recherche R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, et une maladie ciblée de subventions de recherche de la Fondation de recherche en rhumatologie (le juge en chef Liu).

Toutes les interventions chirurgicales concernant les animaux devraient être approuvés par le soin des animaux et du Comité d&#39;éthique de l&#39;institution locale, avec un effort pour minimiser la douleur et l&#39;inconfort causé par la chirurgie. Une. Préparation <ol><li> Sélectionner 8-12 semaines mâle souris C57BL / 6 avec un poids corporel d&#39;environ 25 g pour une intervention chirurgicale. </li><li> Anesthésier les animaux par injection intrapéritonéale d&#39;un cocktail contenant à la fois de la xylazine (5 mg / kg) et de la kétamine (40 mg / kg). </li><li> Raser le genou avec des rasoirs, puis draper chirurgicalement l&#39;animal et stériliser le site chirurgical avec de la bétadine et alcool (3x) et couvrir les yeux de souris avec une pommade. </li></ol> 2. Procédures chirurgicales <ol><li> Faire une médiane longitudinale para-patellaire incision de 1 cm pour exposer l&#39;articulation du genou. </li><li> Ouvrez l&#39;articulation du genou doucement à travers la dislocation latérale de la rotule et ligament rotulien. <ol><li> Couper la capsule articulaire du genou longitudinalementà travers la médiane incision para-patellaire à l&#39;étape 2.1. </li><li> Disséquer la capsule articulaire du genou avec une pince. </li><li> Prenez la partie distale de la patte arrière avec la main gauche, et effectuer dislocation latérale de la rotule et ligament rotulien avec une pince. Maintenez la patte arrière doucement et assurez-vous d&#39;éviter les traumatismes dans la patte. Le meilleur de la capsule articulaire est disséqué, moins la force sera nécessaire pour faire la dislocation. </li></ol></li><li> Goutte à goutte une solution saline stérile à la surface du cartilage articulaire lors du fonctionnement afin d&#39;éviter le dessèchement de la surface du cartilage. </li><li> Couper à travers le ligament médial meniscotibial qui ancre ménisque interne au plateau tibial. Éviter de blesser le cartilage sous le ménisque médial. <ol><li> Identifier le ménisque médial qui localise entre condyle médial du fémur et du tibia plateau intermédiaire. </li><li> Identifier le ligament qui relie meniscotibial côté latéral du ménisque médial avec éminence intercondylienne du tibia. </li><li> Tenez le salute patte doucement avec la main, et couper à travers le ligament médial meniscotibial soigneusement à l&#39;aide d&#39;une lame chirurgicale n ° 10. Assurez-vous de ne pas causer de blesser cartilage articulaire et d&#39;autres ligaments. Dans de nombreux cas, le tampon recouvrant la graisse doit être tiré vers le côté mais non d&#39;être retiré dans le but d&#39;identifier le ligament. </li></ol></li><li> Fermez la capsule articulaire du genou avec un fil résorbable 6-0. </li><li> Fermer la peau avec 6-0 suture de soie. </li></ol> 3. Soins post-opératoires <ol><li> Appliquer une goutte de 0,25% de bupivacaïne dans le site chirurgical de chaque souris afin de minimiser la douleur post-opératoire. </li><li> Laissez les souris exploités sans chercher de l&#39;eau et de la nourriture. </li></ol> 4. Marquer histologique de DMM chirurgical Modèle <ol><li> Sacrifier la souris aux points indiqués de temps (par exemple 4 semaines, 8 semaines, et 12 semaines. Ici, nous avons montré les résultats de huit semaines en tant que représentant) après la chirurgie. </li><li> Les articulations des genoux entières sont fixés, décalcifiés, embedded par la paraffine, puis coupe en série à intervalle de 5 um. <ol><li> Couper l&#39;ensemble des membres postérieurs avec n ° 10 lames. </li><li> Disséquer la peau et les muscles des membres postérieurs avec soin, et fixer les échantillons à 4% PFA pendant 3 jours à température ambiante. </li><li> Retirez la PFA, et nettoyer les échantillons avec de l&#39;eau. Ensuite, détartrer les échantillons dans de l&#39;EDTA à 4 ° C pendant 2 semaines. </li><li> Déshydrater les échantillons dans un gradient d&#39;éthanol. Dans le détail, conserver les échantillons dans de l&#39;éthanol à 70% pendant 1 heure, puis changer de l&#39;éthanol et de conserver les échantillons dans un nouvel ensemble de 70% d&#39;éthanol pour O / N. Ensuite, mettre les échantillons dans 80% et 90% d&#39;éthanol, par conséquent, et de les conserver pendant 1 heure, respectivement, suivie par de l&#39;éthanol à 100% pour O / N. </li><li> Éliminer l&#39;éthanol. Conserver les échantillons en o-xylène pendant 1 heure, et passer à une nouvelle série de o-xylène. Répétez cette étape 3x. </li><li> Incorporer les échantillons dans un moule de la paraffine en utilisant le centre enrobage Leica. Par la suite, les échantillons sont coupés à 5 um en utilisant un microtome rotatif (Leica RM2255, Allemagne) et ensuite recueillies sur des lames de verre. </li><li> Des sections sagittales en série sont coupées pour chaque échantillon couvrant une région du centre du condyle latéral vers le centre du condyle interne. </li></ol></li><li> Safranin O coloration est réalisée, suivie par la notation et l&#39;analyse statistique par OARSI système de notation comme décrit précédemment 25. <ol><li> Tout d&#39;abord, Déparaffiner les lames dans o-xylène, et hydrater les dans un gradient d&#39;éthanol à de l&#39;eau distillée. Par la suite, les lames sont colorées par hématoxyline de fer Solution de Weigert, 0,05% vert rapide (FCF) Solution, solution à 1% d&#39;acide acétique et 0,1% safranine O Solution. Monter les lames en utilisant un milieu résineux. </li><li> Note les lames colorées à la safranine O sur la base de la perte de protéoglycanes (de couleur rouge) dans le cartilage et le pourcentage de destruction de la structure du cartilage, faire l&#39;analyse statistique pour le score histologique. </li></ol></li></ol>

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Nous ici déclarer que nous n&#39;avons pas de conflit d&#39;intérêts.

Il est rapporté que la souche de souris est très important pour le modèle de DMM induction, en tant que différentes souches de souris ont différentes gravité de l&#39;arthrose après DMM, avec le plus haut niveau dans la souche 129/SvEv, suivie par C57BL6, 129/SvInJ puis FVB / n 26. Une grande partie des transgènes sont établis dans des souris C57BL6, comme PGRN-/ - souris, nous avons utilisé dans la présente étude, qui sont relativement sensibles à la DMM. Cependant, si le transgène est basé sur la souche sen...

L&#39;arthrose (OA), aussi connu comme l&#39;arthrite dégénérative, affecte 15% de la population mondiale et plus de 46 millions de personnes aux États-Unis, et est caractérisée par une synovite, la dégénérescence du cartilage, et la formation d&#39;ostéophytes 1. Il peut être le résultat d&#39;une interaction complexe de facteurs génétiques, métaboliques, biomécaniques et biochimiques. Les mécanismes sous-jacents de l&#39;arthrose continuent d&#39;échapper à la communauté scientifique. Il existe actuellement de nombreux modèles animaux qui peuvent imiter la pathogenèse de l&#39;arthrose 2,3. Il est important d&#39;établir des modèles animaux chez la souris à la fois en raison de la disponibilité des différentes souris génétiquement modifiées et la rentabilité de l&#39;expérimentation. Parmi les différents types de modèles d&#39;arthrose expérimentale, la déstabilisation induite chirurgicalement du ménisque interne (DMM) de modèle est un modèle OA bien acceptée en raison de sa bonne reproductibilité et une progression relativement lente au cours du développement de l&#39;arthrose. Ces deux attributs ontjoué un rôle clé pour l&#39;évaluation de la progression de l&#39;arthrose dans les différents traitements ou des transgènes 8.3. Toutefois, la cohérence du modèle d&#39;OA chirurgical est affecté par plusieurs facteurs au cours de l&#39;intervention chirurgicale et, par conséquent, l&#39;application du modèle de souris chirurgical est limité. Progranuline (PGRN) est un facteur de croissance multi-fonctionnel exprimé dans diverses cellules. Il est connu que PGRN joue un rôle essentiel dans différents processus physiologiques et pathologiques, tels que la cicatrisation des plaies 9, 10 tumorigenèse, et l&#39;inflammation de 11 à 15. Des études ont également montré que l&#39;insuffisance de PGRN peut provoquer des maladies dégénératives du système nerveux chez les humains et les souris 16-18. Il est connu que PGRN est exprimé dans le cartilage articulaire humain, et son niveau est significativement élevée dans le cartilage de patients atteints d&#39;arthrose et de la polyarthrite rhumatoïde 19. En outre, PGRN joue également un rôle crucial dans la prolifération des chondrocytes 20, la différenciation et endochondraleossification du cartilage de croissance au cours du développement 21,22. Récemment, nous avons signalé que PGRN contrarié TNF-α en se liant à des récepteurs TNF et présentait une fonction anti-inflammatoire dans des modèles inflammatoires d&#39;arthrite 13,14,23,24. Cependant, le rôle de PGRN dans l&#39;arthrose, en particulier in vivo, reste à être une énigme. Ici, nous présentons la procédure pour induire un modèle DMM chirurgicale, et d&#39;enquêter sur le rôle de PGRN en développement de l&#39;OA en établissant modèle de DMM en WT et PGRN-/ - souris.

<table><tbody><tr><td>N° 10 Lames chirurgicales</td><td>Feather</td><td>25-2976#10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 suture</td><td>Applied Dental</td><td>WG-N53133</td><td></td></tr></tbody></table>

mise en place d&#39;un modèle chirurgicalement induite chez la souris pour étudier le rôle de protection de progranuline dans l&#39;arthrose

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Déstabilisation du ménisque interne (DMM) modèle est un outil important pour étudier les rôles physiopathologiques de nombreuses molécules associées à l&#39;arthrite dans la pathogenèse de l&#39;arthrose (OA) in vivo. Cependant, le détail, en particulier le protocole visualisée pour établir ce modèle compliqué chez la souris, ne sont pas disponibles. Ici, nous avons profité de type sauvage et progranuline (PGRN) - / - souris comme exemples d&#39;introduire un protocole pour induire modèle DMM chez la souris, et contre l&#39;apparition de l&#39;arthrose suite à la création de ce modèle induit chirurgicalement. Les opérations effectuées sur des souris ont un fonctionnement en trompe-l&#39;œil, qui vient d&#39;ouvrir la capsule articulaire, ou opération de DMM, qui a coupé le ligament menisco-tibiale et provoqué la déstabilisation du ménisque interne. Arthrose gravité a été évaluée à l&#39;aide dosage histologique (par exemple, la safranine O de coloration), des expressions de gènes OA-associés, la dégradation de cartilage molécules de la matrice extracellulaire, et ostéophytes formeation. DMM opération induite avec succès OA initiation et la progression à la fois de type sauvage et PGRN-/ - souris, et la perte de facteur de croissance PGNR conduit à un phénotype plus sévère OA dans ce modèle induit chirurgicalement.

Modèle DMM a été créé avec succès chez la souris, et la carence de PGRN exagéré développement de l&#39;OA chirurgicalement induite. Opérations fictives et DMM (figure 1) ont été effectuées dans le document WT et PGRN-/ - souris. 8 semaines après l&#39;opération, les souris ont été sacrifiées, et la safranine O coloration a été réalisée sur des sections de l&#39;articulation du genou, suivies d&#39;une analyse statistique de score sur la base de l&#39;arthrit...

Nous décrivons un protocole pour la déstabilisation du ménisque médial (DMM) de modèle chez la souris, un outil efficace pour l&#39;arthrose (OA) de recherche. De plus, nous avons démontré que la carence de progranulincan exaggerate développement de l&#39;OA et de la progression à l&#39;aide de ce modèle, ce qui indique que progranulin joue un rôle protecteur dans la pathogenèse de l&#39;arthrose.

Mise en place d&#39;un modèle chirurgicalement induite chez la souris pour étudier le rôle de protection de progranuline dans l&#39;arthrose

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

L'objectif général de cette procédure est de créer un modèle de DMM chez la souris et d'étudier l'apparition de l'ostéoarthrite après la chirurgie de DMM. Après la préparation des animaux, une incision longitudinale médiale parapatellaire d'un centimètre est pratiquée afin d'exposer l'articulation du genou. Ensuite, la capsule articulaire est disséquée et une luxation médiale du genou est réalisée.La dernière étape consiste à sectionner le ligament tibial méniscal médial et à suturer le genou. En fin de compte, des analyses histopathologiques permettent de mettre en évidence la destruction de la structure articulaire ainsi que la perte de protéoglycanes et le développement d'une ostéoarthrite. La gravité est évaluée à l'aide des scores MANKIN réalisés après coloration au safran et à l'o.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, sauf si elles ont assisté à une chirurgie réalisée chez la souris. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Comme les étapes détaillées sont difficiles à apprendre et sont désormais réalisées au microscope, chaque structure de l'articulation du genou doit être clairement identifiée.Pour établir ce modèle, préparez-vous à la destabilisation du ménisque médial ou à la chirurgie DMM en anesthésiant une souris mâle C57BL/6 âgée de huit à douze semaines et pesant environ 25 grammes. Appliquez ensuite une pommade ophtalmique sur les yeux après avoir rasé la zone autour du genou. Stérilisez le site avec de la Bétadine et de l’alcool trois fois et draperez chirurgicalement la zone.Commencez la chirurgie en pratiquant une incision médiale para-patellaire longitudinale d'un centimètre afin d'exposer l'articulation du genou. Ensuite, coupez soigneusement longitudinalement la capsule de l'articulation du genou par l'incision para-patellaire médiale jusqu'à l'exposition du fémur. Puis, utilisez une pince pour desserrer la structure de la capsule en élargissant et approfondissant l'incision.En maintenant délicatement la partie distale de la patte arrière avec une main, utiliser une pince pour effectuer une luxation latérale de la rotule et du ligament rotulien. La luxation ne doit pas nécessiter beaucoup de force si la capsule articulaire a été sectionnée longitudinalement. Appliquer goutte à goutte du sérum physiologique stérile sur la surface du cartilage articulaire pendant le reste de l'intervention chirurgicale afin d'éviter qu'elle ne s'assèche.Maintenant, identifiez le ménisque médial, situé entre le condyle médial du fémur et la plateau médial du tibia. Si nécessaire, écartez le bourrelet adipeux qui recouvre le ligament tibial du ménisque afin d'exposer ce dernier, qui relie le côté latéral du ménisque médial à l'émicence intercondylienne du tibia. Tenez délicatement la patte postérieure avec une main.Réaliser la chirurgie DMM en coupant soigneusement le ligament tibial du ménisque médial à l’aide d’un bistouri chirurgical n°10. Veiller à ne pas endommager le cartilage articulaire ni les autres ligaments. Ensuite, fermer la capsule de l’articulation du genou avec une suture résorbable en six points et fermer la peau avec une suture en soie en six points.Pour minimiser la douleur postopératoire, administrer une injection sous-cutanée de 10 milligrammes par kilogramme de mélocicam et replacer la souris dans sa cage après que l'anesthésie se soit dissipée. Plusieurs semaines après l'intervention chirurgicale, sacrifier la souris et prélever les deux membres postérieurs à l'aide d'une lame n°10. Ensuite, disséquer soigneusement la peau et les muscles des membres postérieurs et fixer l'échantillon dans du paraformaldéhyde 4 % pendant trois jours à température ambiante.Après trois jours, retirez le paraformaldéhyde et nettoyez les échantillons à l’eau distillée pendant trois minutes. Ensuite, décalcifiez les échantillons dans l’EDTA à quatre degrés Celsius pendant deux semaines. Après deux semaines, déshydratez les échantillons dans un gradient d’éthanol.Après avoir éliminé l'éthanol final, placez les échantillons dans trois bains de Lene pendant une heure chacun. Ensuite, incluez les échantillons dans un moule en paraffine. À l’aide d’un microtome rotatif, réalisez des coupes de cinq microns et déposez-les sur une lame de verre.Continuer à couper des sections sagittales sérielles du centre du condyle latéral jusqu'au centre du condyle médial afin d'effectuer la coloration au safran et à l'o. Déparaffiner d'abord les lames dans le céline pendant trois à cinq minutes. Répéter le bain de céline deux fois.Ensuite, hydrater les lames selon un gradient d'éthanol se terminant par de l'eau distillée. Puis plonger les lames dans la solution d'hématine ferrique de Weigert, une solution de vert rapide à 0,05 %, une solution d'acide acétique à 1 %, et une solution de safran et O à 0,1 %. Monter ensuite les lames à l'aide d'un milieu résineux et noter les lames colorées au safran et O en fonction de la perte de la couleur rouge du protoglycane dans le cartilage et du pourcentage de destruction de la structure du cartilage.Ensuite, effectuez une analyse statistique à l'aide du système de notation histologique O-A-R-S-I. Ces images montrent des articulations du genou colorées à la safranine et à l'orange O chez des souris de type sauvage et des souris knock-out pour le gène PG rrn, huit semaines après une opération témoin ou une chirurgie DMM. Aucune dégénérescence évidente du cartilage n'est observée dans l'un ou l'autre des génotypes après une opération témoin.Cependant, huit semaines après une opération de DMM, on observe une perte de protéoglycane, indiquée par la disparition de la coloration rouge dans le cartilage, ainsi que la destruction de la structure du cartilage, comme l'indiquent les flèches rouges, tant chez les souris de type sauvage que chez celles présentant une invalidation de PGRN, ce qui témoigne de l'induction réussie d'un phénotype d'ostéoarthrite. Après la chirurgie de DMM, une comparaison des scores d'ostéoarthrite entre les souris de type sauvage et celles présentant une invalidation de PGRN montre un score significativement plus élevé chez les souris invalidées, démontrant ainsi que la perte de PGRN entraîne un phénotype d'ostéoarthrite plus sévère.Cette technique peut être réalisée en 10 à 15 minutes si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer une opération DMM en masse.

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