Name: Analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Découvrez l'analyse de la biréfringence et des tests d'échappement tactile pour évaluer l'intégrité musculaire chez les larves de Danio rerio. Ces méthodes non invasives permettent de quantifier l'organisation myofibrillaire et la locomotion.

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Nous remercions Behzad Moghadaszadeh pour son aide précieuse dans la quantification des images de biréfringence. Ce travail a été financé par la Muscular Dystrophy Association USA (MDA201302) et le National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01 AR044345), ainsi que par le généreux soutien de A Foundation Building Strength, Cure CMD et la AUism Charitable Foundation. VAG est soutenu par le AR062601 K01 de l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées, et le LLS est soutenu par le NS081928 F31 de l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux.

1. Analyse in vivo de la structure musculaire squelettique par biréfringence
<ol>
	<li>Préparez des cages d’accouplement séparant le(s) mâle(s) de la (des) femelle(s) de la (des) ligne(s) de poisson-zèbre souhaitée(s) tard dans l’après-midi après le repas.
	<ol>
		<li>Distinguent les femelles par leur ventre plus gros et leur légère coloration bleue/blanche, et les mâles par la forme élancée de leur corps et leurs teintes roses/jaunes.</li>
		<li>Le succès des croisements par paires (un mâle et une femelle) peut n’être que d’environ 50 %. Pour un taux de réussite plus élevé, accouplez un mâle avec 2-3 femelles.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Retirez les séparateurs de cage le lendemain matin, peu après le début de la lumière, et laissez les poissons frayer sans être dérangés.</li>
	<li>Récupérez les œufs à l’aide d’une passoire lorsqu’un nombre suffisant d’œufs fécondés sont pondus au fond du réservoir.</li>
	<li>Transférez les embryons dans une boîte de Pétri profonde en rinçant la passoire avec de l’eau de poisson et remettez les poissons parents dans leurs réservoirs. Placez les boîtes d’embryons dans un incubateur à 28,5 °C.</li>
	<li>Nettoyez les œufs et les débris non viables plus tard dans la journée ou le lendemain matin, et retournez les embryons dans l’incubateur pour une croissance ultérieure.</li>
	<li>Les embryons/larves atteignent l’âge approprié pour observer la biréfringence 3 à 7 jours après la fécondation (dpf), car les résultats avant 3 dpf peuvent potentiellement souffrir d’un contraste limité. Les embryons de type sauvage éclosent de leur chorion entre 48 et 60 heures après la fécondation (hpf), suivie d’un redressement de l’axe du corps. Les embryons de type sauvage ou mutants à éclosion tardive peuvent nécessiter une déchorisation manuelle.
	<ol>
		<li>Faites doucement une déchirure dans le chorion avec des pinces tranchantes et retournez-le pour que l’embryon tombe.</li>
		<li>Laissez les embryons déchorionnés se redresser avant de commencer le test.</li>
		<li>Anesthésie le(s) embryon(s) avec de la tricaïne (0,04 % dans l’eau de poisson) pour aider à leur positionnement correct.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installez un microscope à dissection avec une lentille polarisée qui peut être tournée pour ajuster l’angle de la lumière polarisée (Figure 1A).</li>
	<li>Placez le(s) embryon(s) déchorionné(s) anesthésié(s) directement sur un deuxième cristallin polarisé le long de l’axe latéral du corps. La deuxième lentille doit être placée sous la lentille supérieure, sur la platine du microscope (Figure 1B). N’utilisez pas de boîtes de Pétri en plastique à aucun moment pendant le test de biréfringence, car le plastique n’est pas un support approprié pour la transmission de la lumière réfractée.</li>
	<li>Faites pivoter la lentille supérieure avec l’embryon d’intérêt en vue jusqu’à ce que les axes de polarisation des deux lentilles soient orientés à 90° l’un de l’autre et que l’arrière-plan soit complètement sombre.</li>
	<li>Le résultat optimal du test dépend de l’orientation des poissons entre deux lentilles polarisées. Déplacez les poissons pour vous assurer qu’ils sont aussi plats que possible.
	<ol>
		<li>Si le poisson est courbé, seuls les segments avec cette orientation plate passeront la lumière polarisée et présenteront une biréfringence. Dans de tels cas, mesurez la biréfringence dans les zones plates et notez la biréfringence de la zone correspondante chez les poissons de type sauvage (par exemple, somites 1-10 chez les poissons de type sauvage et mutants).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Observez le phénotype biréfringent du poisson.
	<ol>
		<li>Les poissons de type sauvage avec un muscle squelettique très organisé présentent une biréfringence brillante, car l’indice de réfraction de la lumière parallèle aux myofilaments est plus élevé que la lumière polarisée perpendiculaire à ces structures.</li>
		<li>Les poissons dont le muscle squelettique est désorganisé et qui suggèrent une myopathie non dégénérative ou un défaut de développement présentent généralement une réduction globale de la biréfringence.</li>
		<li>Les poissons dont le muscle squelettique est désorganisé, caractéristique d’une dystrophie musculaire, présentent généralement un motif de biréfringence en forme de patch, avec des zones sombres représentant la dégénérescence musculaire parmi les zones lumineuses de l’architecture musculaire normale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Quantifiez la biréfringence en prenant des images de poissons de type sauvage et mutants sous une lumière polarisée avec les mêmes paramètres d’exposition et de grossissement. Enregistrez les images sous forme de fichiers .tiff.
	<ol>
		<li>Ouvrez les images de biréfringence dans le logiciel ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
		<li>Pour chaque image, sélectionnez la zone du muscle du poisson-zèbre en traçant une ligne autour du corps à l’aide de l’option « Sélections de polygones » de la barre d’outils.</li>
		<li>Utilisez « Définir les mesures » dans le menu déroulant « Analyser » pour sélectionner les statistiques requises pour l’image.
		<ol>
			<li>La sélection minimale nécessite que les cases « Surface », « Valeur de gris moyenne » et « Valeur de gris min et max » soient cochées.</li>
			<li>Une valeur de gris maximale de >255 indiquera la saturation des pixels. Par conséquent, utilisez des images avec des valeurs de gris maximales inférieures à 255.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Normalisez l’intensité moyenne avec la zone sélectionnée et répétez cette même procédure de quantification pour chaque image de biréfringence.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Essai de comportement d’échappement évoqué par le toucher
<ol>
	<li>Établissez des couples d’accouplement de la ou des lignées de poisson-zèbre appropriées et collectez les embryons comme décrit ci-dessus aux étapes 1.1 à 1.5.</li>
	<li>De 2 à 7 jours après la fécondation, placez les embryons/larves déchoionnés individuellement dans une boîte de Pétri profonde ou dans les chambres des plaques multipuits.</li>
	<li>En travaillant avec un seul embryon à la fois, centrez l’embryon dans le champ de vision d’un stéréomicroscope Nikon SMZ1500 avec un système d’appareil photo numérique SPOT RT3 ou similaire, et commencez l’imagerie séquentielle.
	<ol>
		<li>La même fréquence d’imagerie doit être utilisée pour les poissons de type sauvage et mutant. Les fréquences d’images >30 Hz sont recommandées, car des fréquences plus lentes ne seront généralement pas suffisantes pour capturer la nage rapide des poissons sauvages.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Délivrez des stimuli mécanosensoriels à l’embryon en touchant la queue avec une épingle à insectes.</li>
	<li>Arrêtez l’imagerie lorsque l’embryon a cessé de nager ou a nagé hors du champ de vision.</li>
	<li>Convertissez des images séquentielles en fichier vidéo ou analysez des images individuelles d’images accélérées hors ligne à l’aide du logiciel SPOT 5.1 Advanced. Parmi les logiciels similaires, citons Open Lab, NIS Elements ou ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/ » title="">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
	<li>Quantifiez le comportement de nage en effectuant la réponse évoquée par le toucher chez plusieurs embryons.
	<ol>
		<li>Cela peut être réalisé en faisant la moyenne de la distance que les embryons sont capables de nager dans un intervalle de temps fixe à l’aide d’un logiciel ou d’une règle métrique pour marquer les points de départ et d’arrivée de la nage.</li>
		<li>Évitez que les embryons ne s’habituent au stimulus tactile au fil du temps en effectuant le test avec un nouvel embryon pour chaque répétition expérimentale. Les comportements dans les modèles mutants de type sauvage et fiables ont tendance à être hautement reproductibles.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+%CE%B12-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li>
<li>Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troponin+T+is+essential+for+sarcomere+assembly+in+zebrafish+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle.</a> J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).</li>
<li>Hawkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATPase-dependent+chaperoning+activity+of+Hsp90a+regulates+thick+filament+formation+and+integration+during+skeletal+muscle+myofibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis.</a> Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).</li>
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<li>Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+flow+birefringence+of+myosin+as+a+result+of+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy.</a> Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).</li>
<li>Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+behavioral+characteristics+of+the+startle+response+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish.</a> Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).</li>
<li>Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner-initiated+startle+response+in+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mauthner-initiated startle response in teleost fish.</a> J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect%2C+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).</li>
<li>Wallace, G. Q., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+muscle+degeneration%2C+regeneration%2C+and+repair+in+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).</li>
<li>Granato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+controlling+and+mediating+locomotion+behavior+of+the+zebrafish+embryo+and+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva.</a> Development. 123, 399-413 (1996).</li>
<li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).</li>
<li>Low, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+is+required+within+zebrafish+sensory+neurons+for+the+activation+of+touch-evoked+escape+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors.</a> J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+identified+motoneurones+and+co-ordination+of+primary+and+secondary+motor+systems+during+zebrafish+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming.</a> J. Physiol. 403, 73-89 (1988).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Les troubles neuromusculaires primaires sont traditionnellement classés comme des processus dystrophiques ou non dystrophiques. Les dystrophies musculaires sont caractérisées par une dégénérescence des myofibres suivie de cycles répétés de régénération, qui conduisent finalement à un processus final caractérisé par une fibrose et un remplacement par le tissu adipeux14. Les myopathies non dystrophiques, en revanche, ne sont pas associées à une nécrose ou à des changements régénératifs, mais entraînent une désor...

<table><tbody><tr><td>Tricaine </td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fischer Scientific</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Fischer Scientific</td><td>100189-588</td><td></td></tr><tr><td>Épingle à insectes</td><td>Fischer Scientific</td><td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>Objectifs polarisés</td><td>Ritz Camera</td><td>Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Fischer </td><td>Incubateur scientifique Isotemp Modèle 630D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td>Logiciel d’imagerie <td>SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td><td>SPOT 5.1 Avancé</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un outil particulièrement efficace pour modéliser les maladies humaines affectant les muscles squelettiques, y compris les dystrophies musculaires1-3, les myopathies congénitales4,5 et les perturbations de l’assemblage sarcomérique6,7, en raison d’une conservation génomique et structurelle élevée chez les mammifères8. La désorganisation musculaire et la déficience locomotrice peuvent être rapidement évaluées chez le poisson-zèbre au cours des premiers jours suivant la fécondation. Deux tests pour aider à caractériser les défauts musculaires squelettiques chez le poisson-zèbre sont la biréfringence (structurelle) et la réponse d’évasion évoquée par le toucher (comportementale).
La biréfringence est une propriété physique dans laquelle la lumière tourne lorsqu’elle traverse une matière ordonnée, comme le réseau pseudo-cristallin de sarcomères musculaires9. Il s’agit d’une approche simple et non invasive pour évaluer l’intégrité musculaire des larves de poisson-zèbre translucides au début du développement. Les poissons-zèbres de type sauvage avec un muscle squelettique très organisé apparaissent très brillants au milieu d’un fond sombre lorsqu’ils sont visualisés entre deux filtres de lumière polarisée, tandis que les mutants musculaires ont des motifs de biréfringence spécifiques au trouble musculaire primaire qu’ils modélisent. Les poissons-zèbres modélisant les dystrophies musculaires, des maladies caractérisées par une dégénérescence des myofibres suivie de cycles répétés de régénération, présentent des taches sombres dégénératives dans les muscles squelettiques sous une lumière polarisée. Les myopathies non dystrophiques ne sont pas associées à une nécrose ou à des modifications régénératives, mais entraînent une désorganisation des myofibres et une faiblesse des muscles squelettiques. Les poissons-zèbres myopathiques présentent généralement une réduction globale de la biréfringence, ce qui reflète la désorganisation des sarcomères.
Le test d'évasion évoquée par le toucher consiste à observer le comportement de nage d'un embryon en réponse à une stimulation tactile10-12. Par rapport aux larves de type sauvage, les larves mutantes présentent souvent une faible contraction d’échappement, suivie d’une nage lente ou d’un autre type de mouvement altéré qui ne parvient pas à propulser les larves sur plus d’une courte distance12. L’avantage de ces tests est que la progression de la maladie chez le même type de poisson peut être surveillée in vivo pendant plusieurs jours, et qu’un grand nombre de poissons peuvent être analysés en peu de temps par rapport aux vertébrés supérieurs.

La biréfringence peut être utilisée comme un test efficace et non invasif permettant d'évaluer l'état de l'organisation des myofibrilles chez des embryons vivants de poisson zèbre. Des exemples de poissons zèbres de type sauvage ainsi que de poissons zèbres présentant une expression réduite de gènes essentiels au développement et à la fonction du muscle squelettique sont présentés. À 5 dpf, les poissons zèbres de type sauvage présentent des muscles squelettiques fortement biréfringents en lumière polarisée, en raison de ...

Le poisson-zèbre est maintenant un outil établi et puissant pour modéliser les dystrophies musculaires, les myopathies congénitales et les maladies neuromusculaires associées. La biréfringence et le comportement d’évasion évoqué par le toucher sont deux tests non invasifs courants utilisés pour déterminer le degré de désorganisation musculaire et de déficience locomotrice des embryons de poisson-zèbre au cours du développement précoce.

Analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer le degré d'organisation des myofibrilles chez des larves de poisson zèbre translucides, et de quantifier leur distance de nage en réponse à une stimulation tactile pour les deux méthodes. Cela est réalisé tout d'abord en faisant se reproduire les poissons zèbres, puis en collectant des œufs viables à la deuxième étape du test destinée à évaluer la structure musculaire. Un embryon de poisson zèbre anesthésié et recouvert est positionné directement entre deux lentilles polarisées sur la platine d'un microscope stéréo, de sorte que le poisson soit orienté selon l'axe latéral de son corps et présente une orientation aussi plate que possible.La biréfringence est ensuite visualisée et l'intégrité musculaire est quantifiée. Dans la deuxième étape du test d'échappement induit par un stimulus tactile, une larve unique recouverte est placée dans une boîte de Pétri profonde, puis centrée dans le champ de vision du microscope stéréo. Un stimulus sensoriel léger est appliqué aux larves en touchant la queue avec une aiguille à insecte, et la réaction de l'animal est filmée jusqu'à ce que l'embryon cesse de nager ou quitte le champ de vision.En fin de compte, les différences dans l'organisation musculaire et les réponses locomotrices peuvent être quantifiées. Les principaux avantages de ces techniques non invasives sont qu’un grand nombre de poissons peuvent être analysés rapidement, et que les défauts du muscle squelettique chez le même poisson peuvent être surveillés in vivo pendant plusieurs jours. Des démonstrations visuelles du montage des lentilles polarisées et du positionnement des larves dans l’orientation appropriée sont essentielles pour assurer le succès.Avec ces tests, éliminez les œufs non viables de toutes les pontes prélevées sur des poissons adultes accouplés. Ces œufs apparaissent généralement blancs et opaques à l'œil nu, ou comme un amas de cellules sombres désorganisées au microscope. Remettez les embryons dans l'incubateur pour une croissance supplémentaire entre trois et sept jours après la fécondation. Si l'embryon d'intérêt reste dans sa chorioine, utilisez une pince fine pour déchirer délicatement la chorioine de l'embryon ciblé, puis retournez-le afin que l'embryon en tombe.Anesthésiez les embryons enrobés avec du trica afin de faciliter leur positionnement correct, puis équipez un microscope stéréoscopique d'un objectif polarisant pouvant être tourné pour ajuster l'angle de la lumière polarisée. Une fois les embryons redressés, placez un deuxième objectif polarisant sur la platine du microscope directement sous l'objectif supérieur et déposez les embryons directement au-dessus du second objectif. Chaque embryon d'intérêt doit ensuite être positionné selon l'axe latéral de son corps.Faites pivoter l'objectif supérieur avec l'embryon d'intérêt en vue jusqu'à ce que l'axe de polarisation des deux objectifs soit orienté à 90 degrés l'un par rapport à l'autre et que l'arrière-plan soit complètement sombre. Déplacez le poisson pour vous assurer qu'il est aussi plat que possible. Si un poisson est courbé, seuls les segments orientés à plat laisseront passer la lumière polarisée et présenteront un frt.Observe maintenant le phénotype de biréfringence des poissons de type sauvage. Les muscles squelettiques hautement organisés apparaissent brillants en biréfringence, car l'indice de réfraction de la lumière parallèle aux myofilaments est plus élevé que celui de la lumière polarisée perpendiculairement à ces structures. Les poissons présentant un désordre des muscles squelettiques, évocateur d'une myopathie neurodégénérative ou d'un défaut de développement, montrent généralement une réduction globale de la biréfringence.Caractéristique de la dystrophie musculaire. Présente couramment un motif en « puzzle » de biréfringence, avec des zones sombres représentant la dégénérescence musculaire parmi des zones brillantes correspondant à une architecture musculaire normale. Acquérir des images du poisson en lumière polarisée afin de quantifier la biréfringence.Enregistrez les images au format fichiers tiff. Ouvrez les images de biréfringence dans un logiciel de traitement d'images. Si vous utilisez ImageJ comme illustré ici, utilisez d'abord l'outil de sélection polygonale pour tracer une ligne autour du corps du poisson afin de définir la zone du muscle du poisson zèbre destinée à la mesure.Ensuite, dans le menu déroulant Analyser, choisissez « Définir les mesures » pour sélectionner les statistiques requises pour l'image. Cochez les cases Surface, Valeur moyenne de gris, et Valeurs minimale et maximale de gris afin de configurer le test de comportement d'échappement induit par le toucher entre deux et sept jours après la fécondation. Placez individuellement les poissons recouverts d'intérêt dans des boîtes de Pétri profondes, en travaillant avec un seul embryon à la fois.Positionnez le poisson au centre du champ de vision d'un microscope stéréo équipé d'un système de caméra numérique et commencez l'acquisition d'images séquentielles à une fréquence d'images supérieure ou égale à 30 hertz. Ensuite, à l'aide d'une aiguille à insectes, touchez la queue de l'embryon pour délivrer le stimulus sensoriel mécanosensoriel, puis arrêtez l'acquisition lorsque l'embryon a cessé de nager ou s'est déplacé hors du champ de vision. Enfin, convertissez les images séquentielles en un fichier vidéo ou analysez les images individuelles des séquences temporelles.La biréfringence hors ligne peut être utilisée comme un test non invasif efficace permettant d'évaluer l'état de l'organisation des myofibrilles dans les embryons de poisson-zèbre vivants. Chez les poissons-zèbres de type sauvage à cinq jours après la fécondation, les muscles squelettiques présentent une forte biréfringence sous lumière polarisée en raison de l'organisation ordonnée de leurs myofilaments. En revanche, les embryons âgés de manière comparable et homozygotes pour une mutation pathogène dans le gène de la dystroglycane ou DAG1 présentent une biréfringence irrégulière, indiquant des zones de dégénérescence musculaire. Ce motif irrégulier et la progression rapide de la dégénérescence musculaire durant les premières phases du développement sont compatibles avec d'autres modèles de poissons dystrophiques.La quantification de la biréfringence chez des mutants dystrophiques DAG1 à cinq jours post-fécondation révèle une réduction significative de la luminosité à 27,9 ± 5,3 % de la biréfringence maximale observée chez leurs frères et sœurs de type sauvage. Cette réduction est plus sévère que celle observée à 52,4 ± 5,5 % chez des poissons modèles myopathiques mtm1 à trois jours post-fécondation. Les modèles de poissons myopathiques présentent généralement une réduction globale de la biréfringence par rapport au type sauvage, car il existe souvent une désorganisation des myofibrilles dans les muscles squelettiques axiaux principaux, sans toutefois de signes de modifications dégénératives. Des comportements d'évasion sensibles au toucher peuvent être utilisés pour démontrer que les modèles de poisson zèbre de maladies musculaires squelettiques présentent des défauts locomoteurs et des difficultés de nage.Ce premier vidéo montre un test de comportement d'échappement induit par le toucher sur des zebrafish de type sauvage. Remarquez comment, à cinq jours post-fécondation, les alevins normaux s'éloignent très rapidement. En réponse à un toucher, dans cette deuxième vidéo, un alevin du jour un, le comportement d'échappement induit par le toucher a été enregistré.Remarquez comment les embryons mutants cinq jours après la fécondation présentent une réponse altérée au toucher et ne parviennent pas à quitter le champ de vision après stimulation. Les vidéos ont ensuite été analysées image par image afin de confirmer que les mutants DAG1 présentent une locomotion altérée par rapport aux témoins de type sauvage en réponse à des stimuli tactiles. Les distances parcourues par les deux types d'embryons au cours d'un intervalle de temps fixe ont été moyennées et indiquent une fonction motrice réduite chez les mutants DAG1.Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être appliquées à de grandes quantités de poissons en un court laps de temps, ce qui est essentiel lors de criblages chimiques ou de mutagenèse à haut débit. Après cette procédure, des approches plus invasives, telles que l'immunohistochimie ou la microscopie électronique, peuvent être réalisées afin d'étudier les anomalies du muscle squelettique aux niveaux moléculaire et structural.

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Analyse des défauts des muscles squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et par essais de réaction d’échappement déclenchée par le toucher

Cette vidéo décrit le test de réponse tactile, qui mesure la réponse de la larve de poisson-zèbre aux stimuli tactiles.

Escape Response Assay : Une méthode pour étudier la réponse des larves de poisson-zèbre aux stimuli tactiles

La vidéo décrit l’évitement et le dosage de la thigmotaxie des larves de poisson-zèbre. La vidéo examine le comportement des larves de poisson-zèbre en réponse à un stimulus visuel aversif.

Essai d’évitement et de thigmotaxie chez le poisson-zèbre : une méthode à haut débit pour examiner le comportement larvaire en réponse à un stimulus visuel aversif

Poisson zèbre sont d'un nouveau système pour la modélisation de maladies humaines du muscle squelettique. Nous décrivons une méthode rapide et efficace pour isoler les fibres musculaires des muscles squelettiques de poisson zèbre embryonnaire et larvaire. Cette méthode produit une préparation de haute densité myofiber approprié pour l'étude de la morphologie unique de fibres de muscle squelettique, la localisation subcellulaire des protéines, et la physiologie des muscles.

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

mesures de force peuvent être utilisés pour démontrer les changements de la fonction musculaire en raison du développement, les blessures, la maladie, le traitement ou la toxicité chimique. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour mesurer la force lors d'une contraction maximale du poisson zèbre muscles du tronc larvaire.

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Nous présentons une méthode pour l’analyse électrorétinographique (ERG) des larves de poisson-zèbre en utilisant des techniques de micromanipulation et d’électrorétinographie. Il s’agit d’une méthode simple et directe pour mesurer la fonction visuelle des larves de poisson-zèbre in vivo.

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Dans cette étude, nous décrivons une méthode simple pour effectuer une analyse Evans Blue Dye (EBD) sur des larves de poisson-zèbre.  Cette technique est un outil puissant pour la caractérisation de l’intégrité des muscles squelettiques et la délimitation des modèles de dystrophie musculaire chez le poisson-zèbre, et constitue une méthode précieuse pour le développement de nouvelles thérapies.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

Les poissons-zèbres sont un excellent modèle pour étudier la fonction musculaire et les maladies. Au début de l’embryogenèse, le poisson-zèbre commence à contracter régulièrement ses muscles, produisant un comportement de nage rythmé, qui est modifié lorsque le muscle est perturbé. Nous décrivons ici un test de réponse et de locomotion évoquée par le toucher pour examiner les performances de natation comme mesure de la fonction musculaire.

Utilisation de la réponse tactile évoqué et Locomotion essais pour évaluer la performance de la fonction musculaire et en Zebrafish

Nous présentons ici un protocole pour le développement et la caractérisation d’un modèle d’épilepsie du poisson-zèbre résultant de l’inhibition transitoire du gène DEPDC5.

Analyse comportementale et physiologique dans un modèle d’épilepsie de poisson-zèbre

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

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Une nouvelle méthode polyvalente pour l'observation de la microcirculation est présenté. Il est considéré comme convenable pour observation à long terme, et pour la combinaison avec pharmacophysiological ou moléculaire interventions biologiques.

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Découvrez l'analyse de la biréfringence et des tests d'échappement tactile pour évaluer l'intégrité musculaire chez les larves de Danio rerio. Ces méthodes non invasives permettent de quantifier l'organisation myofibrillaire et la locomotion.

Analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile

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