Analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer le degré d'organisation des myofibrilles chez des larves de poisson zèbre translucides, et de quantifier leur distance de nage en réponse à une stimulation tactile pour les deux méthodes. Cela est réalisé tout d'abord en faisant se reproduire les poissons zèbres, puis en collectant des œufs viables à la deuxième étape du test destinée à évaluer la structure musculaire. Un embryon de poisson zèbre anesthésié et recouvert est positionné directement entre deux lentilles polarisées sur la platine d'un microscope stéréo, de sorte que le poisson soit orienté selon l'axe latéral de son corps et présente une orientation aussi plate que possible.

La biréfringence est ensuite visualisée et l'intégrité musculaire est quantifiée. Dans la deuxième étape du test d'échappement induit par un stimulus tactile, une larve unique recouverte est placée dans une boîte de Pétri profonde, puis centrée dans le champ de vision du microscope stéréo. Un stimulus sensoriel léger est appliqué aux larves en touchant la queue avec une aiguille à insecte, et la réaction de l'animal est filmée jusqu'à ce que l'embryon cesse de nager ou quitte le champ de vision.

En fin de compte, les différences dans l'organisation musculaire et les réponses locomotrices peuvent être quantifiées. Les principaux avantages de ces techniques non invasives sont qu’un grand nombre de poissons peuvent être analysés rapidement, et que les défauts du muscle squelettique chez le même poisson peuvent être surveillés in vivo pendant plusieurs jours. Des démonstrations visuelles du montage des lentilles polarisées et du positionnement des larves dans l’orientation appropriée sont essentielles pour assurer le succès.

Avec ces tests, éliminez les œufs non viables de toutes les pontes prélevées sur des poissons adultes accouplés. Ces œufs apparaissent généralement blancs et opaques à l'œil nu, ou comme un amas de cellules sombres désorganisées au microscope. Remettez les embryons dans l'incubateur pour une croissance supplémentaire entre trois et sept jours après la fécondation. Si l'embryon d'intérêt reste dans sa chorioine, utilisez une pince fine pour déchirer délicatement la chorioine de l'embryon ciblé, puis retournez-le afin que l'embryon en tombe.

Anesthésiez les embryons enrobés avec du trica afin de faciliter leur positionnement correct, puis équipez un microscope stéréoscopique d'un objectif polarisant pouvant être tourné pour ajuster l'angle de la lumière polarisée. Une fois les embryons redressés, placez un deuxième objectif polarisant sur la platine du microscope directement sous l'objectif supérieur et déposez les embryons directement au-dessus du second objectif. Chaque embryon d'intérêt doit ensuite être positionné selon l'axe latéral de son corps.

Faites pivoter l'objectif supérieur avec l'embryon d'intérêt en vue jusqu'à ce que l'axe de polarisation des deux objectifs soit orienté à 90 degrés l'un par rapport à l'autre et que l'arrière-plan soit complètement sombre. Déplacez le poisson pour vous assurer qu'il est aussi plat que possible. Si un poisson est courbé, seuls les segments orientés à plat laisseront passer la lumière polarisée et présenteront un frt.

Observe maintenant le phénotype de biréfringence des poissons de type sauvage. Les muscles squelettiques hautement organisés apparaissent brillants en biréfringence, car l'indice de réfraction de la lumière parallèle aux myofilaments est plus élevé que celui de la lumière polarisée perpendiculairement à ces structures. Les poissons présentant un désordre des muscles squelettiques, évocateur d'une myopathie neurodégénérative ou d'un défaut de développement, montrent généralement une réduction globale de la biréfringence.

Caractéristique de la dystrophie musculaire. Présente couramment un motif en « puzzle » de biréfringence, avec des zones sombres représentant la dégénérescence musculaire parmi des zones brillantes correspondant à une architecture musculaire normale. Acquérir des images du poisson en lumière polarisée afin de quantifier la biréfringence.

Enregistrez les images au format fichiers tiff. Ouvrez les images de biréfringence dans un logiciel de traitement d'images. Si vous utilisez ImageJ comme illustré ici, utilisez d'abord l'outil de sélection polygonale pour tracer une ligne autour du corps du poisson afin de définir la zone du muscle du poisson zèbre destinée à la mesure.

Ensuite, dans le menu déroulant Analyser, choisissez « Définir les mesures » pour sélectionner les statistiques requises pour l'image. Cochez les cases Surface, Valeur moyenne de gris, et Valeurs minimale et maximale de gris afin de configurer le test de comportement d'échappement induit par le toucher entre deux et sept jours après la fécondation. Placez individuellement les poissons recouverts d'intérêt dans des boîtes de Pétri profondes, en travaillant avec un seul embryon à la fois.

Positionnez le poisson au centre du champ de vision d'un microscope stéréo équipé d'un système de caméra numérique et commencez l'acquisition d'images séquentielles à une fréquence d'images supérieure ou égale à 30 hertz. Ensuite, à l'aide d'une aiguille à insectes, touchez la queue de l'embryon pour délivrer le stimulus sensoriel mécanosensoriel, puis arrêtez l'acquisition lorsque l'embryon a cessé de nager ou s'est déplacé hors du champ de vision. Enfin, convertissez les images séquentielles en un fichier vidéo ou analysez les images individuelles des séquences temporelles.

La biréfringence hors ligne peut être utilisée comme un test non invasif efficace permettant d'évaluer l'état de l'organisation des myofibrilles dans les embryons de poisson-zèbre vivants. Chez les poissons-zèbres de type sauvage à cinq jours après la fécondation, les muscles squelettiques présentent une forte biréfringence sous lumière polarisée en raison de l'organisation ordonnée de leurs myofilaments. En revanche, les embryons âgés de manière comparable et homozygotes pour une mutation pathogène dans le gène de la dystroglycane ou DAG1 présentent une biréfringence irrégulière, indiquant des zones de dégénérescence musculaire. Ce motif irrégulier et la progression rapide de la dégénérescence musculaire durant les premières phases du développement sont compatibles avec d'autres modèles de poissons dystrophiques.

La quantification de la biréfringence chez des mutants dystrophiques DAG1 à cinq jours post-fécondation révèle une réduction significative de la luminosité à 27,9 ± 5,3 % de la biréfringence maximale observée chez leurs frères et sœurs de type sauvage. Cette réduction est plus sévère que celle observée à 52,4 ± 5,5 % chez des poissons modèles myopathiques mtm1 à trois jours post-fécondation. Les modèles de poissons myopathiques présentent généralement une réduction globale de la biréfringence par rapport au type sauvage, car il existe souvent une désorganisation des myofibrilles dans les muscles squelettiques axiaux principaux, sans toutefois de signes de modifications dégénératives. Des comportements d'évasion sensibles au toucher peuvent être utilisés pour démontrer que les modèles de poisson zèbre de maladies musculaires squelettiques présentent des défauts locomoteurs et des difficultés de nage.

Ce premier vidéo montre un test de comportement d'échappement induit par le toucher sur des zebrafish de type sauvage. Remarquez comment, à cinq jours post-fécondation, les alevins normaux s'éloignent très rapidement. En réponse à un toucher, dans cette deuxième vidéo, un alevin du jour un, le comportement d'échappement induit par le toucher a été enregistré.

Remarquez comment les embryons mutants cinq jours après la fécondation présentent une réponse altérée au toucher et ne parviennent pas à quitter le champ de vision après stimulation. Les vidéos ont ensuite été analysées image par image afin de confirmer que les mutants DAG1 présentent une locomotion altérée par rapport aux témoins de type sauvage en réponse à des stimuli tactiles. Les distances parcourues par les deux types d'embryons au cours d'un intervalle de temps fixe ont été moyennées et indiquent une fonction motrice réduite chez les mutants DAG1.

Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être appliquées à de grandes quantités de poissons en un court laps de temps, ce qui est essentiel lors de criblages chimiques ou de mutagenèse à haut débit. Après cette procédure, des approches plus invasives, telles que l'immunohistochimie ou la microscopie électronique, peuvent être réalisées afin d'étudier les anomalies du muscle squelettique aux niveaux moléculaire et structural.