Étirer dans le cerveau cellules endothéliales microvasculaires (CEND) comme

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'utilisation de la lésion par étirement comme modèle de traumatisme crânien. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant des cellules endothéliales microvasculaires sur des puits à fond flexible. La deuxième étape consiste à différencier les cellules par réduction du sérum de veau fœtal dans le milieu de culture.

Ensuite, les cellules sont endommagées à l'aide du dispositif d'étirement cellulaire. La dernière étape consiste à évaluer le degré de lésion des cellules. En définitive, les lésions induites par l'étirement dans les cellules endothéliales cérébrales sont utilisées pour modéliser in vitro les atteintes de la barrière hémato-encéphalique.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des lésions cérébrales traumatiques, car elle modélise l'impact réel survenant lors d'un TCE au niveau de la barrière hémato-encéphalique, en utilisant une lésion par étirement de cellules endothéliales cérébrales marines. Le Dr. Elaine Salvador, postdoctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez cette procédure en cultivant les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales marines dans un flacon de culture T 75.

Changer le milieu deux fois par semaine jusqu'à ce que la confluence soit atteinte. Ensuite, laver les cellules avec du PBS. Puis retirer le PBS et la trypsine.

Lysez les cellules avec deux millilitres de solution chaude de trypsine-EDTA. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes ou jusqu'à ce que la couche cellulaire soit dispersée. Ensuite, ajoutez huit millilitres de milieu de culture aux cellules et tapez plusieurs fois sur le flacon pour détacher les cellules.

Observer les cellules au microscope afin de s'assurer qu'elles se sont détachées complètement du flacon. Puis, pipeter le milieu contenant les cellules détachées en montant et en descendant. Agiter doucement le flacon pour homogénéiser la suspension cellulaire par la suite.

Ajoutez 20 microlitres de la suspension cellulaire dans un hémocytomètre et comptez le nombre de cellules. Déterminez la densité cellulaire et voyez 20 000 cellules par centimètre carré dans le puits. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans le collagène.

Une plaque de culture à six puits avec fond flexible, utilisée avec un volume total de trois millilitres par puits. Renouveler le milieu de culture deux fois par semaine et faire croître les cellules à 37 degrés Celsius pendant une semaine, jusqu'à confluence.

Pour la différenciation cellulaire, changer le milieu de culture des cellules par un milieu de différenciation et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Dans cette procédure, allumer l'appareil contrôleur de lésion cellulaire, régler le délai à 50 millisecondes. Ensuite, régler la pression du régulateur à 15 PSI et appuyer sur la gâchette plusieurs fois jusqu'à ce que la pression maximale enregistrée devienne stable.

Ensuite, régler la pression du régulateur à la valeur souhaitée. Puis, placer la plaque de culture à six puits avec fonds flexibles dans le support de plateau. S'assurer que le sélecteur de puits est réglé sur la taille de puits appropriée.

Ensuite, placez fermement le bouchon d'adaptateur sur le connecteur, maintenez bien le bouchon en place d'une main tout en appuyant sur la gâchette de l'autre main, puis enregistrez la pression maximale générée. Replacez immédiatement la plaque dans l'incubateur à 37 degrés Celsius pendant la durée souhaitée, ou utilisez-la immédiatement pour des expériences ou évaluations ultérieures afin d'évaluer la lésion par étirement à l'aide du test d'absorption de DI. Immédiatement après l'étirement des cellules, ajoutez 30 microlitres d'une solution colorante de viabilité à un milligramme par millilitre, servant de marqueur de cytotoxicité, dans le milieu de culture cellulaire.

Pour évaluer la lésion par étirement au moyen de la libération de la lactate déhydrogénase. Après l'étirement, retirez immédiatement 200 microlitres de milieu de culture cellulaire du puits, faites de même pour chaque point temporel post-lésion que vous souhaitez inclure dans votre étude de la libération de la LDH. Ensuite, centrifugez le milieu de culture cellulaire au réglage maximal d'une microcentrifugeuse pendant cinq minutes.

Pour éliminer tout débris cellulaire, retirez le surnageant et utilisez-le pour les étapes suivantes. Une fois que les échantillons nécessaires provenant de différents points temporels ont été prélevés, lysez les cellules à l’aide de la solution de lyse fournie dans le kit de dosage du LDH. Ensuite, ajoutez 100 microlitres du milieu d’essai inclus dans le kit d’essai dans chaque puits d’une plaque 96 puits fournie avec le kit.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres du milieu de culture cellulaire cellulaire libre dans deux puits parallèles de la plaque 96. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et lisez l'absorbance à 492 nanomètres. Illustrée ici est l'examen par microscopie optique de cellules normales par rapport à des cellules lésées.

La monocouche de cellules au confluent normal, non étirée, est compacte et les cellules sont allongées. Lorsque les cellules sont étirées par une impulsion de pression maximale de 1,8 à 2,0 PSI, elles apparaissent moins compactes. Lorsque les cellules sont modérément endommagées par une impulsion de pression maximale de 2,5 à 3,0 PSI, certaines apparaissent gonflées et déformées. Les cellules se rétractent lorsqu'elles sont soumises à un étirement sévère de 3,5 à 4,5 PSI.

Voici l'examen microscopique en fluorescence de cellules normales par rapport à des cellules lésées. Les cellules ont été traitées avec un colorant de viabilité deux heures après la lésion. Il s'agit des cellules témoins non étirées, des cellules modérément étirées et des cellules fortement étirées.

Cette figure montre la libération de l'enzyme LDH dans le surnageant après une lésion par étirement. La LDH libérée dans le milieu de culture a été mesurée à différents intervalles de temps après la lésion induite par étirement et exprimée en pourcentage de la quantité totale de LDH libérable provenant des cellules soumises à un étirement faible ou modéré. Cette libération ne différait pas de façon significative entre les témoins non étirés et les différents groupes d'étirement.

Les cellules fortement étirées ont libéré une quantité significativement plus élevée de LDH par rapport à tous les autres échantillons, sauf par rapport à l'échantillon modérément étiré à une heure après sa préparation. Cette technique a permis aux chercheurs du domaine de la neurobiologie d'étudier les lésions cérébrales traumatiques dans des cellules endothéliales cérébrales marines in vitro.