Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter des anticorps neuronaux anti-D2R ou anti-NMDAR dans des échantillons de patients à l'aide d'un dosage cellulaire basé sur la cytométrie en flux à haut débit. Cela est réalisé en clonant la séquence complète d'ADNc humain du D2R ou du NMDAR dans un plasmide. Dans une deuxième étape, une lignée cellulaire humaine est transfectée, ce qui conduit à l'expression à la surface cellulaire d'antigènes neuronaux.

Ensuite, les cellules transfectées sont incubées avec le sérum de patient et un anticorps secondaire approprié avant l'acquisition en cytométrie en flux. Afin de détecter la liaison des anticorps aux antigènes de surface cellulaire, les résultats sont obtenus à partir d'une analyse par cytométrie en flux. Notre essai cellulaire à base de cytométrie en flux à trois ports élevés est rapide, quantitatif et efficace pour de grandes cohortes d'échantillons de patients.

Ceci constitue un avantage important par rapport à l'utilisation d'un test basé sur des cellules associé à une immunochimie et à une analyse en microscopie confocale. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés face à la perte de cellules au cours de l'expérience afin d'obtenir le nombre adéquat de cellules au cytomètre en flux. Veillez à ne pas aspirer les cellules entre les lavages.

Sélectionnez un vecteur d'expression adapté à l'expression de protéines transmembranaires et permettant la co-expression cellulaire des antigènes et de la protéine verte fluorescente de manière séparée. Par exemple, ce vecteur possède un rapporteur GFP amélioré sous le contrôle d'un site d'entrée ribosomale interne. Sous-clonnez la séquence codant pour la protéine humaine CD complète dans le vecteur à l'aide des enzymes de restriction appropriées. Après vérification des clones par séquençage, préparez des stocks de plasmide adaptés à l'utilisation en transfection. Cultivez les cellules HEK 293 dans du DMEM complet contenant 10 % de sérum de veau fœtal.

Récupérez les cellules par trypsine après un lavage, centrifugez les cellules puis resuspendez le culot cellulaire dans un milieu DMM complet frais. Comptez les cellules, puis semez des cultures de deux millilitres dans des plaques à six puits à une confluence d'environ 70 %. Attribuez les puits de cellules HEK 293 pour la transfection avec les constructions d'expression ainsi qu'avec le vecteur contrôle. Conservez certaines cellules HEK 293 non transfectées pour la compensation ultérieure.

Préparez les mélanges de transfection composés de 200 microlitres de chlorure de sodium à 0,9 %, de 2,5 microgrammes d'ADN et de quatre microgrammes par millilitre de polyéthylène. Vortexez immédiatement pendant 10 secondes, puis incubez à température ambiante pendant 10 minutes avant d'ajouter le mélange de transfection à chaque puits de deux millilitres de dmm complet frais. Recouvrez la plaque, enveloppez les côtés avec du perfil et centrifugez à 280 ×g pendant cinq minutes afin de faciliter la transfection cellulaire.

Ensuite, retirez le film parafilm, puis placez la plaque dans les conditions de culture pendant 18 heures. Remplacez le milieu de culture par du DM EM complet frais et maintenez en culture pendant encore 72 heures. Pour détacher les cellules, ajoutez 500 microlitres de varice dans chaque puits et incubez environ cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, resuspendre les cellules de chaque puits dans deux millilitres de PBS contenant 2 % de FBS et transférer les cellules dans un tube conique après trois lavages. Resuspendre les culots cellulaires à raison d’un million de cellules par millilitre dans une solution de 2 % de FBS. Concevoir maintenant le modèle de plaque de 96 puits pour l’acquisition en cytométrie en flux de manière à ce que les différentes lignées cellulaires soient traitées avec chaque échantillon de patient ou anticorps primaire.

Ensuite, ensemencer 50 000 cellules par puits dans une plaque 96 puits en fond V et faire tomber les cellules par centrifugation à 450 G pendant cinq minutes. Incliner la plaque en biais et retirer délicatement le surnageant en prenant soin de ne pas aspirer le culot cellulaire. Puis, ajouter une dilution sériée d'anticorps primaire afin d'évaluer l'expression membranaire de l'antigène.

Ensuite, pour détecter les anticorps dans les échantillons de patients, incuber les cellules pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière, après trois lavages dans 170 microlitres de solution de FBS à 2 %. Ajouter l’anticorps secondaire marqué au AF 647 approprié : anti-IgG humaine pour le patient et anti-IgG US pour les anticorps primaires. Hybridation pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière, après trois lavages.

Resuspendre les cellules dans 35 microlitres de solution à 2 % de FBS pour l'acquisition cellulaire en cytométrie en flux sur le cytomètre en flux. Configurer d'abord l'échantillonneur à haut débit. Acquérir 10 000 événements par puits selon le modèle d'acquisition en cytométrie en flux.

Exporter les données, puis les analyser à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux en sélectionnant les cellules HEK 293 vivantes selon la diffusion avant et la diffusion latérale. Sélectionner également les cellules fortement positives pour la GFP afin d’analyser uniquement les cellules transfectées. Déterminer l’intensité moyenne de fluorescence du canal AF 647 au sein des cellules vivantes positives pour la GFP.

Ensuite, exportez les données vers Excel ou Prism pour analyse. Tracez les concentrations d'anticorps primaire en fonction des valeurs MFI obtenues à partir des échantillons correspondants pour chaque patient et chaque échantillon témoin. Déterminez le delta MFI et calculez le seuil de positivité de l'anticorps en ajoutant trois écarts types à la moyenne du delta MFI du groupe témoin.

Ensuite, représentez graphiquement les échantillons individuels regroupés selon le groupe de patients. Indiquez le seuil sous forme de ligne ici. Les cellules exprimant soit le récepteur N-méthyl-D-aspartate, soit le récepteur de la dopamine de type 2 ont été analysées au cytomètre en flux à l’aide d’un échantillonneur à haut débit.

Lors de l'analyse, les cellules ont été sélectionnées en fonction de la diffusion avant pour la taille et de la diffusion latérale pour la granularité. Les cellules HK 2 9 3 transfectées exprimaient la molécule rapporteur GFP dans le cytoplasme, tandis que les cellules non transfectées (UNT) ont été exclues de l'analyse dans la population positive pour GFP. L'intensité moyenne de fluorescence (MFI) associée à la liaison de l'anticorps secondaire anti-IgG humaine conjugué à l'AF 6 47 a été mesurée afin d'éliminer la fluorescence de fond lors de l'analyse des sérums humains.

La différence de MFI a été calculée en soustrayant la MFI de fond des cellules témoins. Cet essai cellulaire par cytométrie en flux repose sur la détection par anticorps de l'antigène membranaire d'intérêt. Par exemple, les cellules GK 2.93 transfectées avec le plasmide d'expression du récepteur N-M-D-A-R ont montré une forte expression du récepteur membranaire de la méthyldé.

De même, les cellules transfectées D deux R exprimaient le récepteur de la dopamine deux, tandis que les cellules contrôles n'exprimaient aucun de ces antigènes. Cette étude clinique a évalué une cohorte de patients atteints d'encéphalite à récepteurs N-M-D-A-R, une cohorte de patients atteints d'encéphalite associée à des anticorps anti-D deux R et une cohorte témoin présentant d'autres maladies neurologiques non inflammatoires. Noter que aucun des patients positifs n'était doublement positif pour les anticorps.

Ciblage de N-M-D-A-R-M-D deux R comme prévu. Les anticorps anti-N-M-D-A-R et anti-D deux R n'ont été détectés dans aucun des contrôles analysés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être correctement réalisée en cinq heures, avec une heure d'acquisition en flux pour environ 80 échantillons après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neuro-immunologie pour découvrir de nouvelles cibles d'anticorps dans les troubles immuno-médiés.