Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

L’objectif global de l’expérience suivante est de détecter les anticorps neuronaux anti D deux R ou N-M-D-A-R dans des échantillons de patients à l’aide d’un test cellulaire de cytométrie en flux à haut débit. Ceci est réalisé en sous-adhérent, la séquence complète de CDNA de D deux R ou N-M-D-A-R humain dans un plasmide. Dans un deuxième temps, une lignée cellulaire humaine est transfectée, ce qui conduit à l’expression à la surface cellulaire des antigènes neuronaux.

Ensuite, les cellules transfectées sont incubées avec le sérum du patient et un anticorps secondaire approprié avant l’acquisition de la cytométrie en flux. Afin de détecter la liaison des anticorps aux antigènes de surface cellulaire, les résultats sont obtenus sur la base de l’analyse par cytométrie en flux. Notre test basé sur des cellules de cytométrie à trois ports est rapide, quantitatif et efficace pour de grandes cohortes d’échantillons de patients.

Il s’agit d’un avantage significatif par rapport à l’utilisation d’un test cellulaire avec immunochimie et analyse confocale. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal à faire face à la perte de cellules au cours de l’expérience afin d’acquérir le nombre approprié de cellules au cytomètre en flux. Veillez à ne pas aspirer les cellules entre les lavages.

Sélectionnez un vecteur d’expression adapté à l’expression des protéines transmembranaires et permettant la co-expression cellulaire des antigènes et de la protéine fluorescente verte séparément. Par exemple, ce vecteur a un rapporteur GFP amélioré sous le contrôle d’un sous-clone du site d’entrée interne du ribosome le CD NA humain de pleine longueur dans le vecteur à l’aide des enzymes de restriction appropriées après vérification des clones par séquençage, pour créer des stocks de plasmides qui conviennent à une utilisation dans la culture transfectible. L’HEK 2 93 cellules dans du DMEM complet avec 10 % de sérum de bovin fœtal.

Récoltez les cellules à l’aide de trypsine après un lavage, centrifugez les cellules et suspendez la pastille cellulaire dans un dmm frais et complet. Comptez les cellules, puis ensemencez deux cultures d’un millilitre dans des plaques à six puits avec une fluidité d’environ 70 % de Co, attribuez les puits de 2 93 cellules HEK pour la transfection avec les constructions d’expression ainsi que le vecteur de contrôle. Conservez-en quelques-uns sur des cellules HEK 2 93 transfectées pour compensation ultérieure.

Préparez les mélanges de transfection composés de 200 microlitres de chlorure de sodium à 0,9 %, de 2,5 microgrammes d’ADN et de quatre microgrammes par millilitre de polyéthaline. Immédiatement Vortex pendant 10 secondes et incuber à température ambiante pendant 10 minutes avant d’ajouter le mélange de transfection dans chaque puits de deux millilitres de dmm frais complet. Couvrez la plaque, enveloppez les côtés avec du perfil et centrifugez à 280 GS pendant cinq minutes pour faciliter la transfection des cellules.

Retirez ensuite le film para puis placez la plaque dans des conditions de culture pendant 18 heures. Remplacer le milieu de culture par du DM EM complet et frais et le maintenir en culture pendant encore 72 heures. Pour détacher les cellules, ajoutez 500 microlitres de varices dans chaque puits et incubez pendant environ cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, mettez en suspension les cellules de chaque puits dans deux millilitres de 2 % FBS dans du PBS et transférez les cellules dans un tube conique après trois lavages. Remettre en suspension les palettes de cellules à 1 million de cellules par millilitre dans une solution FBS à 2 %. Concevez maintenant le modèle à 96 puits pour l’acquisition de la cytométrie en flux de manière à ce que les différentes lignées cellulaires soient traitées avec chaque échantillon de patient ou anticorps primaire.

Ensuite, ensemencez 50 000 cellules par puits dans une plaque à 96 puits à fond en V et granulez les cellules en les centrifugeant à 450 G pendant cinq minutes. Inclinez une plaque en biais et retirez délicatement le supranatin en prenant soin de ne pas aspirer la pastille cellulaire. Ensuite, ajoutez une dilution en série de l’anticorps primaire afin d’évaluer l’expression de surface de l’antigène.

Ensuite, des échantillons de patients afin de détecter les anticorps, incubez les cellules pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité après trois lavages dans 170 microlitres de solution FBS à 2 %, ajoutez l’anticorps secondaire conjugué AF 6 47 approprié IgG anti-humain pour le patient et anti-US. IgG pour les anticorps primaires. Hybrider pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité après trois lavages.

Resus suspend les cellules dans 35 microlitres de solution FBS à 2 % pour l’acquisition de cellules de cytométrie en flux au niveau du cytomètre en flux. Configurez d’abord l’échantillonneur à haut débit. Acquérir 10 000 événements par puits selon le modèle d’acquisition de cytométrie en flux.

Exportez puis analysez les données à l’aide d’un progiciel de cytométrie en flux pour les cellules HEK 2 93 en direct en fonction des diffusions vers l’intérieur. Recherchez également une positivité GFP élevée pour analyser uniquement les cellules transfectées. Déterminez l’intensité moyenne de fluorescence du canal AF 6 47 dans les cellules GFP positives en direct.

Exportez ensuite les données dans Excel ou prism pour analyse. Tracez les concentrations d’anticorps primaires en fonction de l’IMF obtenues à partir des échantillons correspondants pour chaque patient et échantillon de contrôle. Déterminez l’IMF delta et calculez le seuil de positivité des anticorps en ajoutant trois écarts-types au-dessus de l’IMF delta moyenne de la cohorte témoin.

Tracez ensuite les échantillons individuels regroupés en fonction du groupe de patients sur un graphique. Représentez le seuil sous la forme d’une ligne ici. Les cellules exprimant soit le récepteur n méthyl de aspartate, soit le récepteur de la dopamine deux ont été acquises au cytomètre en flux à l’aide d’un échantillonneur à haut débit.

Au cours de l’analyse, les cellules ont été contrôlées en fonction de la diffusion vers l’avant pour la taille et de la diffusion latérale pour la granularité. Les cellules TRANSFECTÉES HK 2 9 3 ont exprimé la molécule rapporteure de la GFP dans le cytoplasme et les cellules transfectées UNT ont été exclues de l’analyse dans la démarche positive à la GFP. L’IMF associée à la liaison conjuguée des anticorps IgG IgG humains AF 6 47 a été mesurée afin d’éliminer la fluorescence de fond lors de l’analyse des sérums humains.

L’IFM delta a été calculée en soustrayant l’IFM d’arrière-plan des cellules témoins. Ce test de cytométrie en flux basé sur les cellules est basé sur la détection d’anticorps de l’antigène de surface cellulaire d’intérêt. Par exemple, les cellules a GK 2 93 transfectées avec le plasmide d’expression pour N-M-D-A-R ont montré une expression élevée de la surface et du récepteur méthyle de.

De même, les cellules transfectées D deux R exprimaient le récepteur de la dopamine deux, tandis que les cellules contrôlées n’exprimaient aucun de ces antigènes. Cette étude clinique a évalué une cohorte de patients atteints d’encéphalite N-M-D-A-R, une cohorte de patients atteints d’encéphalite associée aux anticorps D deux R et une cohorte témoin d’autres maladies neurologiques non inflammatoires. Notez qu’aucun des patients positifs n’était doublement positif pour les anticorps.

Ciblage N-M-D-A-R-M-D deux R comme prévu. Les anticorps N-M-D-A-R et D deux R n’ont été détectés dans aucun des témoins analysés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée correctement en cinq heures avec une heure d’acquisition de flux pour environ 80 échantillons après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neuroimmunologie pour découvrir de nouvelles cibles d’anticorps dans les troubles à médiation immunitaire.