Name: In situ TEM d’assemblages biologiques dans un liquide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Découvrez l'imagerie TEM in situ d'assemblages biologiques en liquide pour observer les comportements dynamiques des complexes viraux à résolution nanométrique. Cette méthode utilise des microplaques en nitrure de silicium avec capture d'affinité.

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Les auteurs remercient le Dr Michael J. Friedlander, directeur du Virginia Tech Carilion Research Institute, d’avoir encouragé nos efforts de recherche. Ce projet a été soutenu par des fonds de développement de S.M.M et D.F.K. et en partie par l’initiative Nano-Bio de l’Institute for Critical Technology and Applied Science de Virginia Tech.

1. Préparer les périphériques de capture d’affinité16
<ol><li>Nettoyer les E-puces de nitrure de silicium en les incubant dans 15 ml d’acétone pendant 2 min suivi de 15 ml de méthanol pendant 2 min(figure 1A). Laissez les copeaux sécher sous un flux d’air laminaire.</li>
	<li>Incuber les copeaux séchés sur une plaque d’agitation chauffée (sans agitation) pendant 1,5 heure à 150 °C, puis les laisser refroidir à température ambiante avant utilisation.</li>
	<li>Utilisez des seringues Hamilton pour composer des mélanges de lipides dans de petits tubes de verre afin de contenir 25 % de chloroforme, 55 % de DLPC (1,2-dilauroyl-phosphocholine) dans le chloroforme (1 mg/ml) et 20 % de lipides Ni-NTA (sel d’acide 1,2-dioleoyl-iminodiacétique-succinyl-nickel) dans le chloroforme (1 mg/ml) pour un volume total de 40 μl.</li>
	<li>Appliquer une partie aliquote de 1 μl du mélange sur chaque goutte de Milli-Q de 15 μl sur un morceau de Parafilm dans une boîte de Petri humide(figure 1B). Incuber des échantillons sur de la glace pendant au moins 60 min.</li>
</ol>2. Capturer des macromolécules17
<ol><li>Placer une puce électronique avec une entretoise intégrée de 150 nm sur un échantillon monocouche et incuber pendant 1 min(Figure 1C).</li>
	<li>Soulevez délicatement la puce de l’échantillon et ajoutez une aliquote de 3 μl de la protéine A marquée par His. Incuber pendant 1 min à température ambiante(figure 1D).</li>
	<li>Épongez l’excès de goutte à l’aide de Whatman #1 papier filtre et ajoutez immédiatement une aliquote de 3 μl de solution d’anticorps. Incuber pendant 1 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer l’excès de solution à l’aide d’une seringue Hamilton et ajouter immédiatement une partie aliquote de 1 μl de DLPs rotavirus (0,1 mg/ml) dans une solution tampon contenant 50 mM hepes (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 et 10 mM CaCl2. Incuber pendant au moins 2 min à température ambiante. La préparation des DLP a été décrite précédemment18.
</li>
</ol>3. Assemblez la chambre microfluidique et chargez le porte-échantillon in situ
<ol><li>Chargez la puce électronique humide contenant l’échantillon viral dans la pointe du porte-échantillon microfluidique. Décharger une seconde puce E plate pendant 1 min puis chargée sur le dessus de la puce d’entretoise(Figure 2, panneaux 1-5).</li>
	<li>Alternativement, pour augmenter le contraste des macromolécules biologiques, une tache de métaux lourds(par exemple 0,2% d’uranyl formate) peut être ajoutée aux échantillons humides avant de placer la deuxième puce électronique sur l’échantillon humide. Cependant, la puce électronique contenant l’échantillon devra être lavée avec de l’eau Milli-Q avant d’ajouter le réactif de contraste.</li>
	<li>Sandwich l’ensemble de l’ensemble ensemble pour former une enceinte scellée, maintenue en place mécaniquement à l’intérieur du support par 3 vis en laiton(Figure 2,panneaux 6-8).</li>
	<li>Après assemblage, la pointe du support est pompée à 10-6 Torr à l’aide d’une station de pompage à sec turbo-pompée avant de placer le support à l’intérieur du TEM.</li>
</ol>4. Imagerie dans un liquide à l’aide d’un microscope électronique à transmission
<ol><li>Chargez le porte-échantillon in situ dans un microscope électronique à transmission (FEI Company) équipé d’un filament LaB6 et fonctionnant à 120 kV.</li>
	<li>Allumez le filament TEM et ajustez la hauteur eucentrique de l’étage du microscope par rapport à l’échantillon en utilisant la fonction wobbler pour incliner l’échantillon de -15° à +15° d’avant en arrière dans la colonne. Cette procédure ajuste l’étage dans la direction z pour aider à tenir compte de l’épaisseur appropriée de la chambre à liquide. Cette étape garantit également qu’un grossissement précis est utilisé lors de l’enregistrement d’images.</li>
	<li>Enregistrez d’abord les images le long des bords et dans les régions d’angle de la chambre microfluidique. Ces zones contiennent généralement la solution la plus fine. Enregistrer des images d’échantillons dans des conditions de faible dose (1-3 électrons/Å2)à l’aide d’une caméra CCD. Utilisez des grossissements nominaux de 6 000X à 30 000X.</li>
	<li>Déterminez la valeur de défocalisation appropriée en vous concentrant sur le bord de la chambre fluidique. Utilisez une valeur de -1,5 μm pour enregistrer des images à un grossissement de 30 000X. Si une solution épaisse est rencontrée ou si l’agent de contraste n’est pas utilisé dans la préparation de l’échantillon, utilisez des valeurs de défocalisation plus élevées dans la plage de -2 à -4 μm.</li>
	<li>Pour s’assurer que la solution est contenue dans la chambre microfluidique tout au long des expériences, concentrez le faisceau d’électrons jusqu’à ce que les bulles se forment dans le liquide à l’intérieur de l’appareil.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

L’auteur, Madeline J. Dukes, est une employée de Protochips, Inc.

Dans notre travail présenté, nous avons employé l’approche de capture d’affinité pour attacher le rotavirus DLPs à une plate-forme microfluidique. Cela a permis l’imagerie in situ de complexes macromoléculaires dans un microenvironnement liquide. L’approche de capture est importante en ce qui concerne d’autres techniques d’imagerie microfluidique, car elle localise les échantillons biologiques dans la fenêtre d’imagerie pour annuler les grands problèmes diffusifs qui surviennent lors de l’enregis...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Un objectif commun des biologistes et des ingénieurs est de comprendre le fonctionnement interne des machines moléculaires. Les microscopes électroniques à transmission (TEMs) sont des instruments idéaux pour visualiser ces détails complexes à une résolution quasi atomique1-2. Afin de soutenir le système à vide poussé d’un TEM, les échantillons biologiques sont typiquement encastrés dans des films minces de glace vitreuse3,de sucres4,de sels de métaux lourds5,ou d’une combinaison de ceux-ci6. Par conséquent, les images d’échantillons incorporés peuvent ne révéler que des instantanés limités de processus dynamiques.
Des tentatives précoces pour maintenir les spécimens biologiques hydratés dans des chambres liquides environnementales ont été entreprises par Parsons et collègues utilisant des étapes de pompage différentielles. Des modèles de diffraction d’électrons de cristaux de catalase non souillés ont été enregistrés avec succès à une résolution de 3 Å dans un état hydraté7-8. En outre, des domaines lipidiques séparés en phase ont pu être examinés dans des membranes hydratées d’érythrocytes humains9-10. Cependant, le mouvement causé par la diffusion du liquide et son interférence avec le faisceau d’électrons, a entraîné une perte de résolution grave et d’autres expériences utilisant des échantillons biologiques n’ont pas été tentées jusqu’à récemment.
De nouveaux supports d’échantillons microfluidiques ont été introduits qui utilisent des micropuces semi-conductrices pour former une chambre environnementale micro-échelle. Ces dispositifs peuvent maintenir les échantillons dans un liquide pendant qu’ils sont positionnés dans une colonne TEM11-12. Cette percée technique dans l’imagerie TEM a permis aux chercheurs de visualiser, pour la première fois, des événements progressifs au niveau moléculaire13. Nous appelons cette nouvelle modalité « microscopie moléculairein situ » car les expériences peuvent maintenant être effectuées « à l’intérieur » de la colonne EM14-15. L’objectif global de cette méthode est d’imager les assemblages biologiques dans un liquide afin d’observer leurs comportements dynamiques à une résolution nanométrique. La raison d’être de la technique mise au point est d’enregistrer les observations en temps réel et d’examiner les nouvelles propriétés des machines biologiques en solution. Cette méthodologie élargit l’utilisation des TEMs à des fins plus larges en biologie cellulaire et moléculaire12-16.
Dans l’article vidéo actuel, nous présentons un protocole complet pour assembler et utiliser un support d’échantillon microfluidique disponible dans le commerce. Ces supports spécialisés utilisent des micropuces de nitrure de silicium produites avec des entretoises intégrées pour former une chambre liquide qui renferme des volumes infimes de solution. Des fenêtres minces et transparentes sont gravées dans les micropuces à des fins d’imagerie12. Nous démontrons l’utilisation appropriée d’un support microfluidique pour examiner les particules à double couche (DLPs) du rotavirus simien dans un liquide à l’aide d’une TEM. Pour s’assurer que les assemblages biologiques, tels que les DLP, ne diffusent pas rapidement sur de grandes distances lors de l’imagerie, nous utilisons l’approche Affinity Capture pour les attacher à la surface de la chambre microfluidique16. Cette étape de capture moléculaire présente un avantage majeur par rapport aux techniques alternatives d’imagerie des échantillons biologiques dans un liquide, car elle permet l’acquisition d’images qui seront utilisées pour les routines de traitement en aval. Cette étape de capture utilisée en conjonction avec l’imagerie microfluidique est unique à nos procédures17. Les lecteurs qui utilisent des applications de biologie structurale à l’aide de la TEM ou de chambres d’imagerie microfluidiques peuvent envisager l’utilisation de techniques de capture d’affinité lorsque les observations dynamiques au niveau moléculaire sont l’objectif final.

<table><tbody><tr><td>Puces électroniques, puce d’espacement</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 &mu ; m x 50 &mu ; m fenêtre</td></tr><tr><td>E-chip, puce supérieure</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 &mu ; m x 50 &mu ; m window</td></tr><tr><td>Ni-NTA lipide</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td>Forme poudre</td></tr><tr><td>DLPC (12:0)</td><td>lipide Avanti Polar Lipids</td><td>850335P</td><td>Forme poudre</td></tr><tr><td>Fioles jaugées&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-812A ; 20-812C</td><td>1 ml ; 5 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hamilton Seringues</td><td>Hamilton Co.</td><td>80300, 80400</td><td>1-10 &mu ; l; 1-25 &mu ; l</td></tr><tr><td>Papier filtre Whatman #1</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 pièces, 90 mm</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri en verre</td><td>Corning</td><td>70165-101</td><td>100 mm x 15 mm Pipettes</td></tr><tr><td>Pasteur en verre</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>Tubes de culture en verre</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Chloroforme&nbsp ;</td><td>Microcopie électronique Sciences</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Protéine A étiquetée par son</td> nom <td>Abcam, Inc.</td><td>ab52953</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Milli-Q système d’eau</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>Eau ultrapure</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Équipement&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poséidon In situ porte-échantillon</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp ; Compatible FEI</td></tr><tr><td>Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td> Caméra CCD <td>120 kV</td></tr><tr><td>Eagle 2k HS</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>10&nbsp ; Échantillonnage par pixels à la station de pompage sèche 30 000X</td></tr><tr><td>Gatan 655 Gatan</td><td>, Inc.</td><td></td><td>Embout du porte-pompe à 10-6&nbsp ; range</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, unité de décharge luminescente</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&nbsp ; Mode de polarité négative</td></tr><tr><td>Isotemp plaque d’agitation chauffée</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Heat à 150 &ordm ; C pour 1,5 h</td></tr></tbody></table>

in situ tem d’assemblages biologiques dans un liquide

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Les chercheurs utilisent régulièrement des microscopes électroniques à transmission (TEMs) pour examiner des entités biologiques et évaluer de nouveaux matériaux. Ici, nous décrivons une application supplémentaire pour ces instruments: la visualisation d’assemblages viraux dans un environnement liquide. Cette méthode passionnante et nouvelle de visualisation des structures biologiques utilise un porte-spécimen à base de microfluidique récemment développé. Notre article vidéo montre comment assembler et utiliser un support microfluidique pour imager des spécimens liquides dans un TEM. En particulier, nous utilisons des particules à double couche (DLP) du rotavirus simien comme système modèle. Nous décrivons également les étapes pour recouvrir la surface de la chambre liquide de biofilms d’affinité qui attachent les DLP à la fenêtre de visualisation. Cela nous permet d’imager les assemblages d’une manière adaptée à la détermination de la structure 3D. Ainsi, nous présentons un premier aperçu des particules subvirales dans un environnement liquide natif.

Des images représentatives de DLP dans un liquide à l’aide de puces électroniques qui ont été déchargées par lueur(figure 3A)montrent moins de DLP dans une zone de visualisation donnée, probablement en raison de la diffusion, par rapport aux DLP qui sont enrichis sur des dispositifs de capture d’affinité(Figure 3B). L’ajout de formate d’uranyle dans la chambre d’imagerie améliore le contraste de l’échantillon et donc la visibilité des DLP individuels en solution(figure 3C,</stron...

Nous décrivons ici une procédure pour imager des complexes viraux dans un liquide à une résolution nanométrique à l’aide d’un microscope électronique à transmission.

In situ TEM d’assemblages biologiques dans un liquide

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

L'objectif général de cette procédure est d'observer des assemblages biologiques et des liquides afin d'étudier leurs comportements dynamiques à une résolution nanométrique. Cela est réalisé en préparant d'abord des micropuces en nitrure de silicium dotées d'une surface de capture par affinité, permettant ainsi d'ancrer les macromolécules à la surface de la micropuce et d'empêcher leur diffusion dans le liquide. La deuxième étape consiste à charger des échantillons biologiques sur la micropuce afin de recruter des particules de rotavirus.Ensuite, la micropuce contenant les particules virales est lavée avec un agent de contraste, puis chargée sur le support d'échantillon microfluidique. La dernière étape consiste à installer la puce supérieure et la plaque frontale afin de former un récipient clos renfermant l'échantillon liquide. Enfin, des images sont enregistrées en MET afin de révéler les caractéristiques de l'échantillon viral à l'intérieur de la microchambre liquide.Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes pour examiner des entités en milieu liquide réside dans le fait que nos échantillons ne se diffusent pas rapidement sur de grandes distances pendant l'imagerie, grâce au revêtement de capture par affinité appliqué sur les micropuces. Les implications de cette technique s'étendent à l'évaluation en temps réel de systèmes de délivrance de médicaments basés sur des nanoparticules ou au développement de vaccins contre des agents pathogènes viraux, car nous pouvons observer pour la première fois comment des nanodispositifs dynamiques évoluent en solution. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur la visualisation de macromolécules biologiques, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que des applications en électrochimie.Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la préparation des dispositifs de capture d'affinité et le chargement du support de spécimen microfluidique peuvent poser des difficultés à un utilisateur novice. Pour commencer, nettoyez les puces en nitrure de silicium en les incubant dans 15 millilitres d'acétone pendant deux minutes, puis dans 15 millilitres de méthanol pendant deux minutes.Pour éliminer le photo-résine résiduel utilisé lors du processus de fabrication, laissez sécher rapidement les puces sous flux d'air laminaire. Une fois sèches, incubez les puces sur une plaque chauffée à 150 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Laissez-les ensuite refroidir à la température ambiante.Ensuite, utilisez des seringues Hamilton pour préparer un mélange lipidique dans un petit tube en verre. Ajoutez d'abord 25 % de chloroforme, puis ajoutez 55 % de DLPC dans le chloroforme à une concentration d'un milligramme par millilitre. Enfin, à l’aide d’une seringue distincte, ajoutez 20 % de lipide nickel NTA dans le chloroforme à une concentration d’un milligramme par millilitre, pour un volume total de 40 µL.Ensuite, découpez un morceau de paraffine pour qu’il s’adapte à l’intérieur d’une boîte de Petri en verre de 100 par 15 millimètres, puis ajoutez neuf gouttes de 15 microlitres d’eau Milli Q sur la surface de la paraffine. Appliquez un aliquot de un microlitre du mélange lipidique sur chacune des gouttes de 15 microlitres d’eau Milli Q et placez la boîte sur de la glace dans un environnement humide pendant au moins 60 minutes, le temps qu’une monocouche lipidique se forme à la surface des gouttes. Placez un EIP doté d’un espaceur intégré de 150 nanomètres au-dessus de la goutte de monocouche lipidique et incubez-les ensemble pendant une minute.Ensuite, soulevez délicatement la puce à partir de la goutte et ajoutez trois microlitres de protéine A marquée par une étiquette hist à 0,01 milligramme par millilitre directement sur la surface de la puce. Incubez la puce et la protéine A pendant une minute à température ambiante. Puis, éliminez le liquide excédentaire à l’aide d’un papier filtre Watman numéro un et ajoutez immédiatement trois microlitres de solution d’anticorps IgG à 0,01 milligramme par millilitre.Incubez l'échantillon pendant une minute à température ambiante. Ensuite, retirez la solution en excès à l’aide d’une seringue Hamilton et ajoutez immédiatement un aliquot de un microlitre de rotavirus, des particules doublement en couches à 0,1 milligramme par millilitre dans une solution tampon heaps, puis incubez la puce pendant au moins deux minutes à température ambiante. Un second IP plat est préparé par décharge luminescente pendant une minute ; assemblez la chambre microfluidique à l’aide d’un ST.Stereoscope en chargeant d’abord l’extrémité de la chambre à spécimen avec des joints toriques.Ensuite, chargez l'EIP humide contenant l'échantillon viral dans l'extrémité du support d'échantillon microfluidique. Puis, ajoutez l'EIP plat préalablement soumis à un éclairement lumineux par décharge sur le dessus de l'échantillon, et assemblez l'ensemble pour former une enceinte scellée maintenue mécaniquement en place dans le support par trois vis en laiton. Après l'assemblage, faites le vide à l'extrémité du support jusqu'à atteindre 10 à la puissance moins six torr.À l’aide d’une station de pompage à pompe turbo avant de placer le porte-objet dans le MET, insérez le porte-objet I deux dans un microscope électronique en transmission équipé d’un filament lab six fonctionnant à 120 kilovolts. Ensuite, allumez le filament du MET et réglez la hauteur centrée du porte-objet par rapport à l’échantillon à l’aide de la fonction de basculement, en inclinant l’échantillon de moins 15 degrés à plus 15 degrés alternativement. Dans la colonne, enregistrez des images aux grossissements de 6 000 à 30 000 fois sur les bords et dans les régions angulaires de la chambre microfluidique.Première image obtenue à l’aide d’une caméra CCD dans des conditions de faible dose, soit un à trois électrons par angström carré. Déterminez la valeur appropriée de défocalisation en mettant au point sur le bord de la chambre fluidique. En général, utilisez une valeur de défocalisation de moins 1,5 micromètre pour enregistrer les images à un grossissement de 30 000 fois, afin de garantir que la solution reste confinée dans la chambre microfluidique.Pendant toute la durée des expériences, focalisez le faisceau d'électrons jusqu'à ce que des bulles se forment dans le liquide à l'intérieur du dispositif. L'image présentée ici a été prise après deux minutes à cinq électrons par angström carré. Après cinq minutes, un nombre encore plus important de bulles s'est formé, accompagné d'une décharge lumineuse, et les puces électroniques se sont liées.Très peu de particules en double couche en solution, probablement en raison de la diffusion. En comparaison, les particules en double couche sont enrichies sur les micropuces fonctionnalisées par affinité ; les images présentées ici sont représentatives, ainsi qu'une reconstruction 3D de particules en double couche en milieu liquide contenant un agent de contraste. Le diamètre de la reconstruction est de 80 nanomètres.Les moyennes de classe des particules doublement enrobées et du liquide ont révélé des caractéristiques bien définies le long de leur surface externe. Les panneaux individuels mesurent 110 nanomètres. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de bien centrer l'E IPS à l'extrémité du porte-échantillon et de préparer le porte-échantillon (PrepU) avant de l'insérer dans le microscope électronique.Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'évaluation de l'activité transcriptionnelle, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple dans quelle mesure le faisceau d'électrons a-t-il affecté la capacité fonctionnelle des complexes viraux ? Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment produire des dispositifs de capture d'affinité, les décorer avec des adaptateurs moléculaires, charger des échantillons viraux dans le porte-objet microfluidique pour MET et imager les échantillons en utilisant des procédures de microscopie cche. N'oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes viraux peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de gants et d'équipements de protection oculaire doivent toujours être prises lors de l'exécution de procédures impliquant des pathogènes de niveau BSL 2.

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