Name: Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Découvrez la spectroscopie de force à molécule unique par AFM pour étudier les propriétés mécaniques et les états de repliement des protéines du cellulosome. Cette méthode révèle les interactions récepteur-ligand avec une précision nanométrique.

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Les auteurs remercient Hermann Gaub d’avoir bénéficié d’une subvention avancée du Conseil européen de la recherche. Michael A. Nash tient à remercier le soutien financier de Society in Science - The Branco Weiss Fellowship Program. Les auteurs remercient Edward A. Bayer, Yoav Barak et Daniel B. Fried de l’Institut Weizmann des sciences pour avoir généreusement fourni les protéines utilisées dans cette étude. Les auteurs remercient Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner et Stefan W. Stahl pour leurs discussions utiles.

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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Pour obtenir des données significatives à partir d’expériences de spectroscopie de force à molécule unique, il est crucial d’obtenir des géométries de traction bien définies et reproductibles. Le protocole utilisé ici aboutit à l’immobilisation spécifique au site de complexes protéiques dans une géométrie de traction définie.
Les porte-à-faux utilisés dans cette étude ont été choisis en raison de leur sensibilité à la force et de leur fréquence de résonance élevée dans l’eau. De plus, la petit...

Les cellulosomes sont de grands complexes multienzymatiques présents à la surface de bactéries cellulolytiques anaérobies (par exemple C. thermocellum) qui ont évolué pour dépolymériser efficacement la lignocellulose de la paroi cellulaire végétale en oligosaccharides solubles1. Un attribut central des cellulosomes est l’interaction cohésine-dockerine de haute affinité. Dans le paradigme le plus important, un module dockerin de type I de 60 à 75 acides aminés hautement conservé est affiché à l’extrémité C-terminale des différentes enzymes bactériennes. Le module dockerin dirige l'assemblage de combinaisons synergiques d'enzymes sur la protéine d'échafaudage non catalytique (« scaffoldin »), qui comprend une polyprotéine de domaines de cohésine spécifiques du module dockerin de type I. À des niveaux plus élevés, l’architecture des cellulosomes peut devenir très complexe, incorporant des paires alternatives de cohésine et de dockerine (par exemple de type II, de type III) qui ancrent les structures à la surface de la cellule et permettent l’assemblage de structures ramifiées contenant plusieurs échafaudages2. Les différents types de cohésine-dockerine, bien qu’ayant des structures apparentées, présentent des spécificités de liaison différentielles supprimant la réactivité croisée avec des échaffoldines involontaires ou des composants d’autres espèces bactériennes productrices de cellulosomes. Bien que les approches bioinformatiques aient réussi à identifier des milliers de composants cellulosomales uniques au niveau génétique, relativement peu de structures protéiques sont connues, et les mécanismes à l’œuvre dans la détermination de la spécificité cohésine-dockerine restent un domaine actif de la recherche en biologie structurale.
Depuis l’invention du microscope à force atomique (AFM) par Binnig et al.3, divers modes de fonctionnement AFM ont été développés et continuellement améliorés, notamment l’imagerie sans contact, l’imagerie en mode oscillation4 et la spectroscopie de force à molécule unique (SMFS)5,6. SMFS est devenu une technique largement utilisée pour sonder directement les protéinesindividuelles 7-11, les acides nucléiques12-15 et les polymères synthétiques16-19. Dans une expérience SMFS typique visant à étudier la liaison récepteur-ligand20,21, une pointe en porte-à-faux AFM est modifiée avec l’un des partenaires de liaison, tandis qu’une surface de verre plate est modifiée avec le partenaire de liaison complémentaire. Le cantilever modifié est mis en contact avec la surface, ce qui permet aux partenaires de se lier. La base du porte-à-faux est ensuite retirée à vitesse constante et la force est mesurée à l’aide de la méthode de déviation optique du levier. Les traces de données force-distance résultantes présentent des pics en dents de scie si la liaison était établie. Dans les cas où les partenaires de liaison sont fusionnés à plusieurs domaines protéiques, chaque pic de la trace force-distance peut être corrélé au déploiement d’un seul domaine protéique ou d’un sous-domaine replié, tandis que le dernier pic correspond à la rupture de l’interface de liaison protéique. Les positions spécifiques des éléments résistants à la force peuvent être utilisées comme une empreinte digitale pour identifier les différents domaines protéiques d’intérêt. Cette méthode peut être utilisée pour interroger les acides aminés importants impliqués dans le repliement et la stabilisation des protéines. De nombreux modèles ont été rapportés dans la littérature pour traiter le comportement caractéristique d’extension de la force observé dans les expériences SMFS. Les modèles les plus couramment utilisés comprennent la chaîne à articulation libre (FJC) modèle22, la chaîne à vis sans fin (WLC) modèle18,23-25 et la chaîne à rotation libre (FRC) modèle25,26.
Dans nos travaux précédents11, nous avons utilisé la spectroscopie de force à molécule unique pour étudier l’interaction des modules de cohésine et de dockerine. Ici, nous présentons un protocole expérimental pour la fonctionnalisation de la surface du verre et du cantilever avec des constructions protéiques enzymatiques-dockerine et CBM-cohésine. Nous présentons également un protocole SMFS basé sur AFM comprenant des procédures d’acquisition et d’analyse de données. Le protocole décrit peut facilement être généralisé à d’autres systèmes moléculaires, et devrait s’avérer particulièrement utile aux chercheurs intéressés par les paires de ligands de récepteurs de haute affinité.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyl diméthyl éthoxysilane</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimide</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Gel réducteur de disulfure</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini cantilevers en nitrure de silicium</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Lots souples</td></tr><tr><td>XYZ Actionneurs piézoélectriques</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared " large spectre" Laser IR</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D Contrôleur AFM</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Acquisition et analyse de données</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>sodium Chlorure</td><td></td><td></td><td></td>de calcium</tr><tr><td>pH mètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borate</td><td></td><td></td><td></td> de sodium</tr><tr><td>Pince à</td><td></td><td></td><td></td>épiler</tr><tr><td>Lunettes de protection</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml ; ser</td><td></td><td>24 mm de diamètre, 0,5 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Porte-échantillon</td><td></td><td></td> en PTFE <td>sur mesure</td></tr><tr><td>Bain</td><td></td><td></td><td></td>sonicateur</tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td>Pureté analytique</td></tr><tr><td>Acide sulfurique (concentré)</td><td></td><td></td><td>pureté analytique</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (30 %)</td><td></td><td></td><td>pureté analytique</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pureté analytique</td>du <td>toluène</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier</td><td></td><td></td><td></td>filtre</tr><tr><td>Lames</td><td></td><td></td><td></td>de verre</tr><tr><td>Microtubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td><td>adaptée aux microtubes</td></tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Pétri Béchers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td> optique</tr></tbody></table>

enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-afm unique molécule spectroscopie de force

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Les cellulosomes sont des complexes multienzymatiques discrets utilisés par un sous-ensemble de bactéries anaérobies et de champignons pour digérer les substrats lignocellulosiques. L’assemblage des enzymes sur la protéine d’échafaudage non catalytique est dirigé par des interactions entre une famille de paires récepteur-ligand apparentées comprenant des modules de cohésine et de dockerine en interaction. La liaison extrêmement forte entre les modules de cohésine et de dockerine entraîne des constantes de dissociation dans la gamme picomolaire faible à nanomolaire, ce qui peut entraver la précision des mesures hors taux avec les méthodes de masse conventionnelles. La spectroscopie de force à molécule unique (SMFS) avec le microscope à force atomique mesure la réponse des biomolécules individuelles à la force et, contrairement à d’autres méthodes de manipulation de molécules uniques (c’est-à-dire les pinces optiques), est optimale pour étudier les interactions récepteur-ligand de haute affinité en raison de sa capacité à sonder le régime de force élevée (>120 pN). Nous présentons ici notre protocole complet pour l’étude des assemblages de protéines cellulosomiques au niveau de la molécule unique. À l’aide d’une topologie protéique dérivée du cellulosome natif, nous avons travaillé avec des protéines de fusion enzyme-dockerine et module de liaison aux glucides-cohésine (CBM-cohésine), chacune avec un groupe thiol libre accessible sur un résidu de cystéine modifié. Nous présentons notre protocole d’immobilisation de surface spécifique au site, ainsi que notre procédure de mesure et d’analyse de données pour obtenir des paramètres de liaison détaillés pour le complexe de haute affinité. Nous montrons comment quantifier les forces de dépliage d’un seul sous-domaine, les forces de rupture complexes, les taux de décalage cinétique et les largeurs potentielles du puits de liaison. L’application réussie de ces méthodes dans la caractérisation de l’interaction cohésine-dockerine responsable de l’assemblage de complexes cellulolytiques multidomaines est décrite plus en détail.

Nous avons utilisé la procédure décrite pour étudier une paire cohésine-dockerine de type I provenant de C. thermocellum. Après la liaison réussie de la paire cohésine-dockerine, les courbes force-distance enregistrées ont révélé des profils de pics caractéristiques. Une courbe typique est présentée dans la figure 4a. Chaque pic de la courbe représente le dépliement d'un sous-domaine protéique, le dernier pic correspondant à la dissociation du complexe récepteur-ligand.
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Les cellulosomes sont des complexes multienzymatiques conçus pour digérer la cellulose. Le SMFS basé sur l’AFM a été utilisé pour étudier les propriétés mécaniques et la configuration de repliement des assemblages de protéines associées au cellulosome. Nous présentons un flux de travail complet pour l’immobilisation des protéines, l’acquisition de données et l’analyse de données afin d’étudier les interactions des complexes récepteurs-ligands individuels impliqués dans l’assemblage des cellulosomes.

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier les propriétés mécaniques et les états de repliement de partenaires de liaison de protéines de fusion à l'aide d'une spectroscopie de force unique molécule basée sur la MF. Cela est réalisé en immobilisant de manière covalente les partenaires de liaison protéiques sur une lame de verre et sur un levier de MF afin d'obtenir une géométrie de traction bien définie dans une deuxième étape. La surface de verre est comprimée à l'aide du levier, ce qui permet d'établir une liaison entre le récepteur et le ligand.Ensuite, le levier est rétracté à une vitesse constante afin de déplier des domaines protéiques individuels et d'associer les résultats du complexe récepteur-ligand, ce qui met en évidence des éléments de structure tertiaire agissant comme des barrières énergétiques le long du chemin de dépliage, barrières révélées par les modèles d'élasticité des polymères. Des informations supplémentaires sur les aspects cinétiques et énergétiques des partenaires d'interaction peuvent être obtenues en ajustant des modèles cinétiques au spectre de force dynamique. L'objectif global de cette procédure est d'étudier les voies de dépliage des

investigating-receptor-ligand-systems-cellulosome-with-afm-based

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Bioengineering

Bioingénierie

Un protocole permettant de coupler de manière covalente une grande variété de molécules uniques sur une pointe AFM est présenté. Des procédures et des exemples pour déterminer la force d’adhésion et l’énergie libre de ces molécules sur des supports solides et des bio-interfaces sont fournis.

Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie

Nous décrivons un protocole de préparation de bicouches lipidiques supportées et sa caractérisation à l’aide de la microscopie à force atomique et de la spectroscopie de force.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Nous décrivons une technique permettant de mesurer simultanément la cinétique de liaison du récepteur unique et du ligand régulée par la force et l’imagerie en temps réel de la signalisation calcique dans un seul lymphocyte T.

Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

Nous présentons une méthode pour réaliser des images de résolution sous-nanomètre avec (mode tapping) modulation d'amplitude en microscopie à force atomique dans un liquide. La méthode est mise en évidence sur les microscopes à force atomique commerciales. Nous expliquons les raisons de nos choix de paramètres et de suggérer des stratégies d'optimisation de la résolution.

Imaging Résolution Sous-nanomètre avec modulation d&#39;amplitude en microscopie à force atomique en liquide

Nous décrivons les modalités et les stratégies pour mesurer les propriétés mécaniques et les voies qui se déroule mécaniques unique de molécules de protéines à l’aide d’un microscope à force atomique. Nous montrons également des résultats représentatifs comme référence pour la sélection et la justification des enregistrements de molécule de protéine seule bonne.

Spectroscopie de force unique de molécules de protéines à l’aide d’un Microscope à Force atomique

Ce protocole décrit l’immobilisation covalente de protéines avec un hétérobifonctionnel agent de couplage silane aux surfaces d’oxyde de silicium conçu pour la spectroscopie de force force atomique microscopie basée seule molécule qui est illustrée par la interaction de RrgA (adhésine pilus-1 pointe de S. pneumoniae) avec la fibronectine.

Immobilisation covalente de protéines pour la spectroscopie de Force seule molécule

Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser le microscope de force atomique (AFM) cantilevers avec une seule cellule T et particule de perle pour des études immunologiques. Des procédures pour sonder la liaison de cellule T-dendritic à paire simple par AFM et pour surveiller la réponse cellulaire en temps réel des macrophages à une seule particule solide par AFM avec la formation image de fluorescence sont montrées.

Fonctionnalisation des cantilevers de microscope de force atomique avec des cellules simples-T ou une seule particule pour la spectroscopie immunologique de force unicellulaire

Ici, nous présentons un protocole pour conjuguer le monomère de protéine par des enzymes formant le polymère de protéine avec une séquence commandée et l'immobiliser sur la surface pour des études de spectroscopie de force d'une molécule simple.

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

L’attachement covalent des molécules de sonde aux pointes de porte-à-faux de force atomique (AFM) est une technique essentielle pour l’étude de leurs propriétés physiques. Cela nous permet de déterminer la force d’étirement, la force de désorption et la longueur des polymères via la spectroscopie de force à molécule unique à base d’AFM avec une reproductibilité élevée.

Attachement covalent de molécules uniques pour la spectroscopie de force basée sur l’AFM

Ce protocole vise à automatiser les mesures AFM sur des centaines de cellules microbiennes. Tout d’abord, les microbes sont immobilisés dans des microstructures de tampon PDMS, puis des mesures de spectroscopie de force sont effectuées automatiquement sur des centaines de cellules immobilisées.

Automatisation des mesures de microscope à force bioatomique sur des centaines de cellules de C. albicans

La microscopie à force atomique-spectroscopie infrarouge (AFM-IR) fournit une plate-forme puissante pour les études bactériennes, permettant d’atteindre une résolution à l’échelle nanométrique. La cartographie des changements subcellulaires (p. ex., lors de la division cellulaire) ainsi que les études comparatives de la composition chimique (p. ex., découlant de la résistance aux médicaments) peuvent être menées à un seul niveau cellulaire chez les bactéries.

La microscopie à force atomique combinée à la spectroscopie infrarouge comme outil pour sonder la chimie d’une seule bactérie

Découvrez la spectroscopie de force à molécule unique par AFM pour étudier les propriétés mécaniques et les états de repliement des protéines du cellulosome. Cette méthode révèle les interactions récepteur-ligand avec une précision nanométrique.

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

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