Name: Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Découvrez la spectroscopie de force à molécule unique par AFM pour étudier les propriétés mécaniques et les états de repliement des protéines du cellulosome. Cette méthode révèle les interactions récepteur-ligand avec une précision nanométrique.

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Les auteurs remercient Hermann Gaub d’avoir bénéficié d’une subvention avancée du Conseil européen de la recherche. Michael A. Nash tient à remercier le soutien financier de Society in Science - The Branco Weiss Fellowship Program. Les auteurs remercient Edward A. Bayer, Yoav Barak et Daniel B. Fried de l’Institut Weizmann des sciences pour avoir généreusement fourni les protéines utilisées dans cette étude. Les auteurs remercient Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner et Stefan W. Stahl pour leurs discussions utiles.

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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Pour obtenir des données significatives à partir d’expériences de spectroscopie de force à molécule unique, il est crucial d’obtenir des géométries de traction bien définies et reproductibles. Le protocole utilisé ici aboutit à l’immobilisation spécifique au site de complexes protéiques dans une géométrie de traction définie.
Les porte-à-faux utilisés dans cette étude ont été choisis en raison de leur sensibilité à la force et de leur fréquence de résonance élevée dans l’eau. De plus, la petit...

Les cellulosomes sont de grands complexes multienzymatiques présents à la surface de bactéries cellulolytiques anaérobies (par exemple C. thermocellum) qui ont évolué pour dépolymériser efficacement la lignocellulose de la paroi cellulaire végétale en oligosaccharides solubles1. Un attribut central des cellulosomes est l’interaction cohésine-dockerine de haute affinité. Dans le paradigme le plus important, un module dockerin de type I de 60 à 75 acides aminés hautement conservé est affiché à l’extrémité C-terminale des différentes enzymes bactériennes. Le module dockerin dirige l'assemblage de combinaisons synergiques d'enzymes sur la protéine d'échafaudage non catalytique (« scaffoldin »), qui comprend une polyprotéine de domaines de cohésine spécifiques du module dockerin de type I. À des niveaux plus élevés, l’architecture des cellulosomes peut devenir très complexe, incorporant des paires alternatives de cohésine et de dockerine (par exemple de type II, de type III) qui ancrent les structures à la surface de la cellule et permettent l’assemblage de structures ramifiées contenant plusieurs échafaudages2. Les différents types de cohésine-dockerine, bien qu’ayant des structures apparentées, présentent des spécificités de liaison différentielles supprimant la réactivité croisée avec des échaffoldines involontaires ou des composants d’autres espèces bactériennes productrices de cellulosomes. Bien que les approches bioinformatiques aient réussi à identifier des milliers de composants cellulosomales uniques au niveau génétique, relativement peu de structures protéiques sont connues, et les mécanismes à l’œuvre dans la détermination de la spécificité cohésine-dockerine restent un domaine actif de la recherche en biologie structurale.
Depuis l’invention du microscope à force atomique (AFM) par Binnig et al.3, divers modes de fonctionnement AFM ont été développés et continuellement améliorés, notamment l’imagerie sans contact, l’imagerie en mode oscillation4 et la spectroscopie de force à molécule unique (SMFS)5,6. SMFS est devenu une technique largement utilisée pour sonder directement les protéinesindividuelles 7-11, les acides nucléiques12-15 et les polymères synthétiques16-19. Dans une expérience SMFS typique visant à étudier la liaison récepteur-ligand20,21, une pointe en porte-à-faux AFM est modifiée avec l’un des partenaires de liaison, tandis qu’une surface de verre plate est modifiée avec le partenaire de liaison complémentaire. Le cantilever modifié est mis en contact avec la surface, ce qui permet aux partenaires de se lier. La base du porte-à-faux est ensuite retirée à vitesse constante et la force est mesurée à l’aide de la méthode de déviation optique du levier. Les traces de données force-distance résultantes présentent des pics en dents de scie si la liaison était établie. Dans les cas où les partenaires de liaison sont fusionnés à plusieurs domaines protéiques, chaque pic de la trace force-distance peut être corrélé au déploiement d’un seul domaine protéique ou d’un sous-domaine replié, tandis que le dernier pic correspond à la rupture de l’interface de liaison protéique. Les positions spécifiques des éléments résistants à la force peuvent être utilisées comme une empreinte digitale pour identifier les différents domaines protéiques d’intérêt. Cette méthode peut être utilisée pour interroger les acides aminés importants impliqués dans le repliement et la stabilisation des protéines. De nombreux modèles ont été rapportés dans la littérature pour traiter le comportement caractéristique d’extension de la force observé dans les expériences SMFS. Les modèles les plus couramment utilisés comprennent la chaîne à articulation libre (FJC) modèle22, la chaîne à vis sans fin (WLC) modèle18,23-25 et la chaîne à rotation libre (FRC) modèle25,26.
Dans nos travaux précédents11, nous avons utilisé la spectroscopie de force à molécule unique pour étudier l’interaction des modules de cohésine et de dockerine. Ici, nous présentons un protocole expérimental pour la fonctionnalisation de la surface du verre et du cantilever avec des constructions protéiques enzymatiques-dockerine et CBM-cohésine. Nous présentons également un protocole SMFS basé sur AFM comprenant des procédures d’acquisition et d’analyse de données. Le protocole décrit peut facilement être généralisé à d’autres systèmes moléculaires, et devrait s’avérer particulièrement utile aux chercheurs intéressés par les paires de ligands de récepteurs de haute affinité.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyl diméthyl éthoxysilane</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimide</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Gel réducteur de disulfure</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini cantilevers en nitrure de silicium</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Lots souples</td></tr><tr><td>XYZ Actionneurs piézoélectriques</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared " large spectre" Laser IR</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D Contrôleur AFM</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Acquisition et analyse de données</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>sodium Chlorure</td><td></td><td></td><td></td>de calcium</tr><tr><td>pH mètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borate</td><td></td><td></td><td></td> de sodium</tr><tr><td>Pince à</td><td></td><td></td><td></td>épiler</tr><tr><td>Lunettes de protection</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml ; ser</td><td></td><td>24 mm de diamètre, 0,5 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Porte-échantillon</td><td></td><td></td> en PTFE <td>sur mesure</td></tr><tr><td>Bain</td><td></td><td></td><td></td>sonicateur</tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td>Pureté analytique</td></tr><tr><td>Acide sulfurique (concentré)</td><td></td><td></td><td>pureté analytique</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (30 %)</td><td></td><td></td><td>pureté analytique</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pureté analytique</td>du <td>toluène</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier</td><td></td><td></td><td></td>filtre</tr><tr><td>Lames</td><td></td><td></td><td></td>de verre</tr><tr><td>Microtubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td><td>adaptée aux microtubes</td></tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Pétri Béchers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td> optique</tr></tbody></table>

enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-afm unique molécule spectroscopie de force

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Les cellulosomes sont des complexes multienzymatiques discrets utilisés par un sous-ensemble de bactéries anaérobies et de champignons pour digérer les substrats lignocellulosiques. L’assemblage des enzymes sur la protéine d’échafaudage non catalytique est dirigé par des interactions entre une famille de paires récepteur-ligand apparentées comprenant des modules de cohésine et de dockerine en interaction. La liaison extrêmement forte entre les modules de cohésine et de dockerine entraîne des constantes de dissociation dans la gamme picomolaire faible à nanomolaire, ce qui peut entraver la précision des mesures hors taux avec les méthodes de masse conventionnelles. La spectroscopie de force à molécule unique (SMFS) avec le microscope à force atomique mesure la réponse des biomolécules individuelles à la force et, contrairement à d’autres méthodes de manipulation de molécules uniques (c’est-à-dire les pinces optiques), est optimale pour étudier les interactions récepteur-ligand de haute affinité en raison de sa capacité à sonder le régime de force élevée (>120 pN). Nous présentons ici notre protocole complet pour l’étude des assemblages de protéines cellulosomiques au niveau de la molécule unique. À l’aide d’une topologie protéique dérivée du cellulosome natif, nous avons travaillé avec des protéines de fusion enzyme-dockerine et module de liaison aux glucides-cohésine (CBM-cohésine), chacune avec un groupe thiol libre accessible sur un résidu de cystéine modifié. Nous présentons notre protocole d’immobilisation de surface spécifique au site, ainsi que notre procédure de mesure et d’analyse de données pour obtenir des paramètres de liaison détaillés pour le complexe de haute affinité. Nous montrons comment quantifier les forces de dépliage d’un seul sous-domaine, les forces de rupture complexes, les taux de décalage cinétique et les largeurs potentielles du puits de liaison. L’application réussie de ces méthodes dans la caractérisation de l’interaction cohésine-dockerine responsable de l’assemblage de complexes cellulolytiques multidomaines est décrite plus en détail.

Nous avons utilisé la procédure décrite pour étudier une paire cohésine-dockerine de type I provenant de C. thermocellum. Après la liaison réussie de la paire cohésine-dockerine, les courbes force-distance enregistrées ont révélé des profils de pics caractéristiques. Une courbe typique est présentée dans la figure 4a. Chaque pic de la courbe représente le dépliement d'un sous-domaine protéique, le dernier pic correspondant à la dissociation du complexe récepteur-ligand.
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Les cellulosomes sont des complexes multienzymatiques conçus pour digérer la cellulose. Le SMFS basé sur l’AFM a été utilisé pour étudier les propriétés mécaniques et la configuration de repliement des assemblages de protéines associées au cellulosome. Nous présentons un flux de travail complet pour l’immobilisation des protéines, l’acquisition de données et l’analyse de données afin d’étudier les interactions des complexes récepteurs-ligands individuels impliqués dans l’assemblage des cellulosomes.

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier les propriétés mécaniques et les états de repliement de partenaires de liaison de protéines de fusion à l'aide d'une spectroscopie de force unique molécule basée sur la MF. Cela est réalisé en immobilisant de manière covalente les partenaires de liaison protéiques sur une lame de verre et sur un levier de MF afin d'obtenir une géométrie de traction bien définie dans une deuxième étape. La surface de verre est comprimée à l'aide du levier, ce qui permet d'établir une liaison entre le récepteur et le ligand.Ensuite, le levier est rétracté à une vitesse constante afin de déplier des domaines protéiques individuels et d'associer les résultats du complexe récepteur-ligand, ce qui met en évidence des éléments de structure tertiaire agissant comme des barrières énergétiques le long du chemin de dépliage, barrières révélées par les modèles d'élasticité des polymères. Des informations supplémentaires sur les aspects cinétiques et énergétiques des partenaires d'interaction peuvent être obtenues en ajustant des modèles cinétiques au spectre de force dynamique. L'objectif global de cette procédure est d'étudier les voies de dépliage des protéines sous l'effet d'une force.Cette méthode peut fournir des informations sur la stabilité mécanique des protéines. Elle peut être appliquée à tout système de récepteur protéique et de ligand pouvant être conçu avec un groupe fonctionnel accessible. Les chercheurs utilisant cette méthode pour la première fois peuvent éprouver des difficultés, car le moment est crucial et la manipulation des leviers peut s'avérer délicate.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biophysique, comme la manière dont une protéine multifonctionnelle se déplie. Pour commencer, placez deux lamelles de verre de 24 millimètres de diamètre et de 0,5 millimètre d'épaisseur dans un support A-P-T-F-E, puis soumettez les lamelles à une sonication dans un mélange éthanol/eau ultrapure à 50/50 pendant 15 minutes.Lorsque la sonication est terminée, rincez les lamelles avec de l'eau ultrapure et attaquez-les dans une solution piranha pendant 30 minutes. Après 30 minutes, retirez les lamelles, rincez-les avec de l'eau ultrapure et séchez-les sous un flux doux d'azote. Ensuite, immergez les lamelles dans un mélange éthanol/eau ultrapure/3-aminopropyl diméthyl ethoxy silane de rapport 45:5:1.Placer les échantillons immergés sur un agitateur à température ambiante pendant 60 minutes à environ 50 tours par minute. Ensuite, plonger la lame couvre-objet successivement dans de l'éthanol à 100 %, puis dans de l'eau ultrapure, deux fois pour chaque solvant. Sécher à nouveau les lames couvre-objets sous un flux doux d'azote.Une fois sèches, faire cuire les lamelles dans un four à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Conserver les lamelles inutilisées sous Argonne jusqu'à six semaines pour effectuer l'amination des pointes en silicone. Placer d'abord quatre cantilevers en silicone sur une lame de verre propre et les traiter avec de l'ozone UV pendant 15 minutes.Ensuite, plonger les leviers pendant trois minutes dans une solution à 50/50 d'éthanol et de diméthyl-oxyde de trois amino propyle, ainsi que 0,25 % d'eau ultrapure. Puis rincer les leviers successivement pendant 60 secondes dans des bains de toluène, d'éthanol et d'eau ultrapure. Sécher soigneusement les leviers sur du papier filtre entre les rinçages après le dernier rinçage.Placer les leviers sur une lame de verre propre et les faire chauffer à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Préparer deux microtubes de billes TEP dissulfure réductrices en coupant d'abord l'extrémité d'une pointe de pipette de 200 microlitres pour en élargir le diamètre, puis en pipetant 100 microlitres de la solution mère de billes dans chacun des deux microtubes de 1,5 millilitre. Ensuite, ajouter un millilitre de TBS à la suspension de billes TEP dans les microtubes, et rincer les billes en vortexant brièvement les microtubes.Ensuite, faire tomber les billes en pellet en centrifugeant les échantillons à 850 G pendant trois minutes. Retirer soigneusement et jeter le surnageant à l’aide d’une micropipette, puis rincer les billes deux fois supplémentaires avec un millilitre de TBS. Après chaque rinçage, effectuer une centrifugation. Après le dernier rinçage, ajouter une solution protéique concentrée à trois milligrammes par millilitre aux billes TEP selon un rapport de un à deux, puis mélanger délicatement la suspension en agitant avec la pointe d’une micropipette afin d’éviter d’introduire des bulles d’air.Ensuite, placer le mélange en suspension de billes de protéine TEP sur un agitateur rotatif pendant 2,5 heures. Imprégner les leviers-amortisseurs aminés et les lamelles dans un tampon de bate de sodium à un pH de 8,5 pendant 45 minutes afin de déprotoner les groupes amine primaires à la surface. Puis porter la poudre de malam N-H-S-P-E-G à température ambiante et préparer 210 microlitres à 25 micromolaire en vortexant dans le tampon de boy huit de sodium.La solution doit être utilisée aussi rapidement que possible en raison de la demi-vie extrêmement courte du NHS. À pH 8,5, déposez rapidement des gouttelettes de 30 microlitres de solution de N-H-S-P-E-G malam dans une boîte de Pétri et 90 microlitres sur chaque autre lame de verre. Placez délicatement les leviers dans les gouttelettes de 30 microlitres.Ensuite, retourner la lame sans la goutte sur une autre contenant une solution de N-H-S-P-E-G malam afin de former un sandwich avec la solution de N-H-S-P-E-G MALAM. Incuber au milieu les leviers et les lames avec la solution de N-H-S-P-E-G MALAM à température ambiante pendant une heure. Centrifuger la perle TEP et la solution protéique réduite à 100 GS pendant une minute et recueillir le surnageant.Ensuite, diluez la solution protéique avec du TBS. Visez une concentration en protéine durant la conjugaison de surface comprise entre 0,5 et deux milligrammes par millilitre. Puis mettez de côté les solutions protéiques réduites et diluées pendant quelques minutes, le temps de rincer les leviers et les lamelles.Rincez les lamelles dans trois béchers successifs d'eau ultrapure. Éliminez le liquide résiduel des lamelles en touchant délicatement leurs bords avec du papier filtre. Ensuite, montez les lamelles dans un porte-échantillon approprié, compatible avec l'instrument de microscopie à force atomique (AFM), et faites sécher le liquide résiduel sous un léger courant d'azote.Appliquez 20 microlitres de la solution protéique diluée sous forme de goutte au centre des lamelles. Rincez ensuite les leviers dans trois béchers successifs d'eau ultrapure, suivis de gouttes de 30 microlitres de la seconde solution protéique diluée. Incubez les lamelles et les leviers PEGylés avec leurs solutions protéiques diluées respectives à température ambiante pendant une à deux heures dans une chambre humide.Ensuite, utilisez une pipette pour rincer les lamelles au moins 10 fois avec un millilitre de TBS, puis conservez-les dans du TBS jusqu'à la mesure. Rincez également les leviers à l’aide de trois béchers successifs contenant du TBS afin d’éliminer les protéines non liées, et conservez-les également dans du TBS. Montez les leviers fonctionnalisés ainsi que les lames de verre dans un modèle de microscope à force atomique (AFM) adapté aux mesures en milieu liquide et permettant une plage de vitesse accessible sur le piézo Z d’environ 200 à 5 000 nanomètres par seconde.Lors du montage, afin de minimiser l'exposition à l'air, veiller à ce que les surfaces restent recouvertes de tampon pendant tout le processus, une fois le faisceau laser correctement ajusté. Laisser le système s'équilibrer pendant au moins 30 minutes afin de réduire les effets de dérive et réajuster si nécessaire. Ensuite, commencer les mesures après une liaison réussie de la cohésion.Docker par paire les courbes enregistrées de force en fonction de la distance montrées ici. Elles présentent un profil de pics caractéristique. Chaque pic de la courbe représente le dépliement d'un sous-domaine protéique, le dernier pic correspondant à la dissociation du complexe récepteur-ligand.Les courbes enregistrées de force en fonction de la distance ont ensuite été transformées dans l'espace force-longueur de contour et assemblées en un histogramme de position de barrière. Les données montrent un incrément de longueur de contour d'environ 89 nanomètres, qui peut être attribué sans ambiguïté au dépliage du domaine xin afin d'explorer le paysage énergétique du docker cohésif et de l'interaction. Un total de 186 courbes de données a été obtenu à quatre vitesses de ramassage différentes.Le spectre de force dynamique résultant, représenté par de grands cercles bleus, illustre les forces de rupture les plus probables à un taux de chargement donné. Ces valeurs ont ensuite été ajustées au modèle de Bell-Evans, fournissant des valeurs pour Koff et delta X, qui se sont révélées en bon accord avec les résultats publiés précédemment. Une fois maîtrisée, la partie expérimentale de cette technique peut être réalisée en huit à neuf heures. Après cette procédure, une mutagenèse site-spécifique peut être réalisée dans une expérience de suivi afin de déterminer les acides aminés essentiels pour la liaison après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biophysique de la molécule unique pour explorer les paysages de repliement des protéines. Nous l'utilisons pour étudier les propriétés mécaniques des SOE de cellulose, qui comptent parmi les systèmes protéiques les plus stables mécaniquement connus.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer une spectroscopie de force à l'échelle d'une molécule unique sur des paires récepteur-protéine/ligand.

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Bioengineering

Bioingénierie

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