Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules dendritiques et des cellules épithéliales à partir du thymus humain. Cela est réalisé en fragmentant d'abord le tissu disséqué par une disruption mécanique. Ensuite, les fragments de tissu sont soumis à une digestion enzymatique supplémentaire afin d'obtenir une suspension monocellulaire.

Enfin, la suspension cellulaire est enrichie en fraction de cellules de faible densité par séparation sur gradient de Percoll. En définitive, les cellules dendritiques et épithéliales peuvent être isolées à partir de cette fraction par tri magnétique ou par tri FACS, ou par une combinaison des deux méthodes. La méthode que nous présentons ici offre une procédure efficace, reproductible et rentable pour l'isolement réussi et l'étude ultérieure de populations cellulaires rares telles que les cellules dendritiques et les cellules épithéliales thymiques présentes dans le thymus humain.

I rotta, une étudiante diplômée de notre laboratoire, vous montrera la procédure. Commencez par placer le tissu thymique dans une boîte de Pétri contenant du PBS stérile à température ambiante, puis rincez tout sang résiduel. Ajoutez ensuite du PBS frais dans la boîte de Pétri et utilisez une pince et des ciseaux pour éliminer les caillots sanguins, les tissus conjonctif et adipeux, ainsi que toutes les parties du tissu qui ne semblent pas saines.

Une fois le tissu thymique propre, pesez-le à titre de référence, puis découpez-le en morceaux uniformes d'un centimètre cube. Recouvrez ensuite les morceaux de PBS et placez-les sur de la glace. Utilisez alors l'extrémité arrière du piston d'une seringue stérile de 10 à 20 millilitres pour appliquer rapidement une pression douce sur le tissu, éliminant ainsi la majorité des thymocytes et réduisant le volume global du tissu à digérer.

La solution deviendra visiblement trouble. Au fur et à mesure que les thymocytes sont libérés, remuez doucement la boîte puis utilisez un aspirateur en verre pour éliminer le surnageant contenant les thymocytes, en prenant soin de ne pas aspirer accidentellement les morceaux de tissu. Il peut être utile d'utiliser un grattoir stérile pour culture cellulaire afin de regrouper tous les morceaux de tissu sur un côté de la boîte, puis d'incliner la boîte à un angle de 45 degrés et d'aspirer le surnageant restant.

Rincez la boîte avec du PBS frais et continuez à recueillir le surnageant jusqu'à ce que le PBS soit relativement transparent. Effectuez un dernier lavage avec du RPMI, puis utilisez des ciseaux bien aiguisés pour hacher les morceaux de tissu aussi finement que possible, suffisamment petits pour pouvoir entrer dans une pipette de cinq millilitres afin d'isoler les cellules dendritiques ou dc. Placez d'abord jusqu'à 10 grammes de morceaux de tissu en treillis dans des tubes de 50 millilitres contenant 10 millilitres de solution de collagénase ADN et 10 millilitres de RPMI pour chaque cinq grammes de tissu.

Incubez ensuite la suspension tissulaire pendant 40 minutes sous agitation lente dans un incubateur thermique à 37 degrés Celsius. La solution enzymatique deviendra trouble au fur et à mesure que les cellules seront libérées. À la fin de la digestion, centrifugez la suspension cellulaire pendant deux minutes à 110 G et à température ambiante pour faire sédimenter les fragments tissulaires, récupérez le surnageant, puis mettez en pellet la suspension cellulaire.

Cette fois, éliminez le surnageant et resuspendez les cellules dans 10 à 50 millilitres de RPMI complet. En fonction de la taille du culot, déterminez le nombre de cellules viables par exclusion au bleu de trypan, puis placez la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius avec un bouchon lâche afin d'isoler les cellules épithéliales thymiques ou t. Ensuite, resuspendez les restes de tissu dans 10 millilitres de solution fraîche de collagénase ADN, plus 10 millilitres de RPMI et de trypsine EDTA.

Poursuivre la digestion des fragments de tissu pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius avec une rotation douce. Pendant les 10 à 15 dernières minutes de l'incubation, ajouter du sérum de veau fœtal dans un rapport de un à cinq pour neutraliser la trypsine. Après avoir centrifugé les fragments de tissu, récupérer le surnageant et centrifuger à nouveau la suspension cellulaire.

Cette fois, aspirez soigneusement et jetez le surnageant, en prenant soin de préserver le culot lâche. Après avoir dénombré le nombre de cellules viables, placez cette suspension cellulaire à 37 degrés Celsius également. Pour enrichir la fraction de faible densité ou les cellules LDF, commencez par centrifuger les suspensions cellulaires précédemment mises de côté pour l'enrichissement en DC et en tech pendant que les cellules sédimentent.

Préparez un gradient de densité de 1,07 gramme par millilitre de solution de Percoll. Selon ce tableau, resuspendez les deux culots jusqu'à une concentration de 1 × 10⁹ cellules dans 6 millilitres de la solution de Percoll préparée. Mélangez suffisamment la suspension cellulaire pour obtenir une suspension homogène, puis transférez les solutions dans des tubes à centrifuger en polycarbonate Oakridge de 50 millilitres munis de bouchons à vis.

Ensuite, utilisez une pipette pour superposer lentement 30 millilitres de RPMI complet par tube au-dessus de la suspension de cellules perca. En prenant soin de ne pas mélanger les couches, transférez délicatement les tubes dans une centrifugeuse prérefroidie équipée d'un rotor à angle fixe et séparez les cellules pendant 35 minutes. Puis, à l'aide de pipettes stériles, transférez soigneusement les fractions enrichies en cellules de faible densité situées à l'interface entre les cellules perca et le milieu vers des tubes de 50 millilitres contenant du RPMI complet froid.

Ensuite, je remplis les tubes avec du RPMI complet supplémentaire pour diluer le reste par cellule. Enfin, je lave les cellules enrichies deux fois dans du RPMI incomplet, je resuspend le culot dans un milieu frais et je détermine le nombre de cellules viables dans cette première figure. Un fragment de tissu assez important de neuf centimètres de diamètre, obtenu à partir d'un enfant de 6 ans, est présenté tel qu'indiqué ci-dessus.

Une première étape importante consiste à nettoyer le tissu des parties indésirables. Comme indiqué par les flèches blanches, une suspension de cellules uniques de tissu thymique a ensuite été obtenue et enrichie en cellules de la fraction de faible densité. Alors qu'une suspension typique de cellules uniques contient environ 3 % de cellules positives pour H-L-A-D-R après séparation par gradient de densité, ce pourcentage augmente de 15 à 40 % dans la cellule de grande taille.

Fraction de faible densité dans la fraction de haute densité, qui se compose principalement de thymocytes de petite taille et uniformes. Il existe pratiquement aucun de ces cellules thymiques.

Les cellules dendritiques myéloïdes peuvent être identifiées par l'expression de plusieurs marqueurs membranaires, notamment le CD11c. Cette figure montre l'isolement efficace des cellules positives pour le CD11c à l'aide d'un protocole modifié de séparation magnétique des cellules après isolement. La pureté des cellules dendritiques positives pour le CD11c était de 93 %, comme établi par immunomarquage des cellules isolées. En moyenne, le rendement des cellules positives pour le CD11c isolées est de 5 × 10⁵ à 5 × 10⁶ cellules dendritiques myéloïdes par 10⁹ cellules thymiques totales.

Dans ce tableau, des données représentatives obtenues à partir de plusieurs échantillons individuels de thymus d'âges et de masses tissulaires différents, avec une gamme de suspensions cellulaires uniques en entrée, ainsi que le nombre total de cellules de la fraction de faible densité et le rendement et la pureté subséquents en CD11c positif, sont présentés pour la fraction enrichie en cellules présentatrices d'antigène uniquement. Environ 0,5 % des cellules sont des cellules épithéliales corticales CD45, EPCA positif faible ou CD45 négatif EPAM positif, et des cellules épithéliales médullaires peuvent être triées à partir des cellules stromales enrichies CD45 faible ou négatif après digestion à la trypsine comme étant respectivement EPAM faible, CD2 positif et EPAM élevé, CD2 négatif. L'isolement des cellules dendritiques et des sous-populations de cellules épithéliales thymiques à partir de thymus humains.

La procédure est sensible au temps. Plus la procédure d'ultrasonication est rapide, meilleur est l'état des cellules. Une fois ce protocole maîtrisé, les cellules dendritiques peuvent être isolées en cinq à six heures et les cellules épithéliales thymiques en huit à dix heures.

Après avoir visionné cette vidéo aujourd'hui, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la manipulation du tissu thymique humain afin d'isoler avec succès les cellules dendritiques et les cellules épithéliales thymiques. Les cellules isolées peuvent ensuite être utilisées dans de nombreuses applications en aval pour des études ultérieures, permettant ainsi de caractériser davantage ces cellules et de mieux comprendre leur biologie.