A Novel tridimensionnelle chambre d'écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d'écoulement physiologiques

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer quantitativement la migration de cellules circulantes en direction d'un gradient de chimiokine. Dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique, cette migration est obtenue en cultivant d'abord une monocouche de cellules endothéliales sur des inserts microporeux revêtus de collagène, puis en assemblant ces inserts dans une chambre à flux où ils recouvrent un compartiment statique distinct contenant des chimiokines. Ensuite, une contrainte de cisaillement est appliquée aux cellules afin de reproduire les conditions physiologiques observées dans la vascularisation.

En tant que deuxième étape, on laisse circuler des cellules d'intérêt, telles que des leucocytes, des cellules souches ou des cellules tumorales, dans le système 3D pendant la circulation. Les composants présents dans le compartiment statique influencent l'efficacité des interactions entre les cellules circulantes et les cellules endothéliales, ainsi que le taux de transmigration des cellules d'essai à travers la couche endothéliale. Ensuite, le système 3D est désassemblé et les cellules d'essai transmigrées sont récupérées à partir du compartiment statique inférieur afin de mesurer quantitativement la migration cellulaire à l'aide de diverses méthodes de pointe. Les résultats obtenus illustrent la capacité des cellules d'essai circulantes à interagir avec les cellules endothéliales dans des conditions d'écoulement physiologique et à quitter la circulation en fonction de la concentration de chimioattractants présents dans le compartiment statique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation de chambres à écoulement laminaire parallèle et les essais de transfert statique, est qu'elle combine à la fois le stress de cisaillement dans le compartiment supérieur et le chimiotactisme dans le compartiment inférieur statique. Cela permet aux chercheurs de mesurer quantitativement l'externalisation des cellules circulantes en réponse au gradient chimiotactique ainsi que dans des conditions d'écoulement physiologique. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier l'effet de la communication croisée entre les cellules du microenvironnement local et les cellules endothéliales sur l'extravasation des cellules circulantes.

En aidant à ajouter une couche supplémentaire de cellules sur un insert séparé placé sous les cellules endothéliales, la procédure sera démontrée par Valentina contre Rova, une technicienne de mon laboratoire. Pour commencer, calculez le nombre d'inserts nécessaires pour l'expérience et placez chaque insert dans une boîte de Pétri stérile séparée. Stérilisez-les par irradiation gamma jusqu'à ce que la dose totale atteigne 11 gray, selon les paramètres individuels.

Ensuite, diluez la solution mère de collagène. Type un à 50 microgrammes par millilitre à l'aide d'acide chlorhydrique 0,01 molaire conservé à quatre degrés Celsius et préparez des aliquotes de 154 microlitres de la solution finale pour chaque insert. Puis déposez plusieurs gouttes provenant d'un Eloqua sur la surface de l'insert selon un motif circulaire.

Ensuite, ajoutez le reste de l'aliquote pour former une goutte plus grande sur la surface de l'insert. Veillez à ce que la pointe de la pipette ne touche jamais l'insert et à ce que le collagène recouvre entièrement la surface de l'insert, sans s'écouler. Une fois l'insert recouvert, placez le couvercle sur la boîte de Pétri et déposez-la soigneusement sur une surface plane.

Incuber les inserts pendant une heure à température ambiante ; après l'incubation, aspirer la solution de collagène et laver la membrane avec 160 microlitres de PBS. Ensuite, aspirer le PBS. Remettre le couvercle et envelopper la boîte avec du paraforme.

Si les inserts doivent être utilisés le jour même, placez la boîte de Pétri dans un endroit sec à température ambiante. Sinon, placez la boîte à quatre degrés Celsius et utilisez l'insert dans les sept jours. Récoltez les cellules endothéliales humaines de veine ombilicale cultivées juste avant utilisation et remettez-les en suspension dans le milieu de culture souhaité à raison de 2,5 millions de cellules par millilitre.

Lors du comptage des cellules, s'assurer que la viabilité cellulaire est supérieure à 98 % en utilisant le bleu de trypan, puis ajouter 160 microlitres de la suspension cellulaire sur chaque insert. Commencer par déposer plusieurs petites gouttes sur la surface de l'insert recouvert de collagène en formant un cercle, puis ajouter soigneusement le reste de la suspension cellulaire afin de former une goutte unique et plus grande. Une fois terminé, remettre les couvercles en place et placer délicatement les boîtes dans un incubateur contenant 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, puis incuber pendant 30 minutes afin de permettre aux cellules de s'attacher à la membrane.

Après 30 minutes, retirez les plaques de l’incubateur et ajoutez délicatement cinq millilitres de milieu de culture préchauffé au-dessus de chaque insert. Veillez à ce que l’insert reste au fond de la boîte et soit entièrement recouvert par le milieu. Remettez ensuite les couvercles et replacez soigneusement les boîtes dans l’incubateur pour la culture.

Les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour monter la chambre d'écoulement, vissez d'abord les plaques supérieure et inférieure ensemble. Ensuite, reliez les plaques à l'unité d'échange gazeux à l'aide d'un tube en PVC de 1,42 millimètre de diamètre intérieur et de parois de 0,8 millimètre d'épaisseur.

Ensuite, placez l'appareil assemblé dans un sac en plastique propre et stérilisez-le par irradiation gamma jusqu'à ce que la dose totale atteigne 11 gray. L'étape suivante consiste à retirer un plateau d'incubateur, à le placer dans une hotte stérile de culture tissulaire et à le stériliser avec de l'éthanol à 70 %. Puis recouvrez le plateau d'une grande serviette stérile.

Ensuite, retirez l'appareil du sac en plastique et placez-le sur le plateau stérile de l'incubateur. Puis, reliez l'appareil à la pompe péristaltique et programmez la pompe pour qu'elle fonctionne à une vitesse de 0,2 millilitre par minute. Prélevez à la pipette cinq à sept millilitres du milieu de culture souhaité dans un tube stérile de 15 millilitres destiné à l'entrée.

Ensuite, déconnectez le tube d'entrée du tube de sortie en retirant l'aiguille métallique du tube à l'aide de petits chiffons stériles afin de maintenir la stérilité du tube, insérez l'aiguille métallique d'entrée dans le tube de 15 millilitres contenant le milieu, et placez le tube de sortie dans un tube vide de 15 millilitres. Ensuite, allumez la pompe pour que le flux soit en sens inverse des aiguilles d'une montre. Laissez la pression négative aspirer le milieu depuis le tube d'entrée de 15 millilitres vers le tube, puis arrêtez la pompe lorsque le milieu atteint l'extrémité du tube, juste avant d'entrer dans le dispositif.

Ensuite, ouvrez l'appareil en dévissant les plaques du tube et retirez soigneusement la plaque supérieure. À l'aide d'une pipette, transférez de 1500 à 1 550 microlitres de milieu dans les puits inférieurs, en veillant à ce que les puits contiennent suffisamment de milieu pour former un hémisphère atteignant un à deux millimètres au-dessus de la plaque inférieure. Puis, transférez les inserts préparés des boîtes de Pétri vers les puits de la plaque inférieure. À l’aide d’une pince stérile, assurez-vous qu’aucune bulle n’est piégée sous les inserts et aspirez tout milieu apparaissant à la surface de la plaque inférieure.

Ensuite, remettez la plaque supérieure sur la plaque inférieure et reconnectez-les. À l’aide des vis, allumez immédiatement la pompe péristaltique et laissez le milieu circuler à travers le dispositif 3D. Surélevez l’extrémité de sortie du dispositif et maintenez la chambre dans cette position afin d’éviter la formation de bulles dans l’espace entre les plaques.

Continuez à remplir le tube reliant la chambre à l'unité d'échange gazeux avec du milieu jusqu'à ce qu'il atteigne l'unité d'échange gazeux. Ensuite, placez trois millilitres de milieu dans l'unité d'échange gazeux. Mettez la pompe en marche et laissez les bulles d'air s'échapper à travers celle-ci.

Élevez l'unité pour permettre au milieu de remplir le tube qui en sort, puis arrêtez la pompe lorsque le milieu se trouve à deux ou trois centimètres de l'extrémité. Une fois l'ensemble correctement amorcé, reliez l'aiguille d'entrée au tube de sortie à l'aide de petits chiffons stériles. Inversez ensuite le sens de la pompe afin que le milieu circule dans le sens horaire vers l'unité d'échange gazeux, et veillez à éliminer toutes les bulles d'air résiduelles.

Avec la pompe à nouveau en circulation dans le sens antihoraire, ajouter 100 microlitres de la suspension de cellules test dans l'unité d'échange gazeux. Puis fermer le couvercle du respirateur.

Replacez le plateau dans l’incubateur et laissez les cellules d’essai circuler dans le dispositif à 37 degrés Celsius. Une fois le temps souhaité écoulé, retirez le plateau contenant le système opérationnel de l’incubateur et placez-le dans la hotte. Arrêtez la pompe, déconnectez l’entrée et la sortie, puis placez les extrémités dans des tubes stériles vides de 15 millilitres.

Ensuite, allumez la pompe et récupérez la suspension cellulaire du système. Placez la suspension cellulaire sur de la glace jusqu'à son utilisation. Puis, démontez la chambre en retirant les vis et en soulevant la plaque supérieure.

Retirez les inserts de la plaque inférieure et transférez-les dans des boîtes de Pétri pour la coloration ou la collecte des cellules. Enfin, retirez la suspension cellulaire des puits inférieurs et placez-la dans des tubes de 15 millilitres. Rincez chaque puits deux fois avec 1,5 millilitre de milieu et ajoutez-le au tube correspondant.

Ensuite, centrifuger les tubes pendant cinq minutes à 200 G et traiter les cellules selon les objectifs expérimentaux spécifiques, tels que ceux énumérés dans le protocole accompagnant le texte illustré. Voici un exemple parmi les nombreux tests pouvant être réalisés à l’aide de ce système. Le dispositif comprend des cellules endothéliales dérivées de moelle osseuse cultivées sur des inserts présentant des pores de cinq microns ; sous les inserts, le facteur stromal un ou SDF un a été ajouté à des concentrations de 0,5 ou 50 nanogrammes par millilitre.

On a laissé les cellules de la moelle osseuse circuler dans le système 3D. Les cellules ayant migré à travers l'insert ont été recueillies, puis cultivées sur des plaques contenant un milieu à base de méthylcellulose. En présence de facteurs de croissance hématopoïétiques induisant la formation de colonies par les cellules progénitrices, le nombre de colonies a été décompté 14 jours plus tard afin de déterminer le nombre de progéniteurs dans chaque puits et d'évaluer leur capacité à migrer vers le sdf.

Un dans des conditions d'écoulement physiologique. Avec l'ajout de fibroblastes stromaux cultivés sur l'insert inférieur dans la chambre statique, un plus grand nombre de cellules hématopoïétiques ont migré depuis la circulation vers la chambre avec l'ajout de SDF-1 à 50 nanogrammes par millilitre, par rapport à la seule présence de SDF-1 après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans divers domaines des sciences médicales et biologiques pour modéliser in vitro des lits vasculaires spécifiques aux tissus et explorer les mécanismes cellulaires et moléculaires médiant la migration des cellules circulantes vers les tissus normaux par rapport aux tissus malades.