Name: A Novel tridimensionnelle chambre découlement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions découlement physiologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Découvrez une chambre d'écoulement tridimensionnelle pour étudier l'extravasation cellulaire dirigée par chimiokines sous contrainte de cisaillement physiologique. Cette méthode permet de quantifier les interactions entre cellules circulantes et endothéliales.

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Nous remercions Chuck Scott et Victor McKnight de la CBS Scientific Company Inc. ( <a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">www.cbsscientific.com</a> ) pour l&#39;assistance technique et la fabrication de la chambre 3D, l&#39;unité d&#39;échange de gaz et inserts. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (subventions R21DK067084 et R43CA141782 à SKK).

1. Préparer les insertions supérieures et inférieures pour la croissance cellulaire en collagène Coating <ol><li> Calculer le nombre de plaquettes nécessaires pour l&#39;expérience. Placez chaque insert dans une boîte de Pétri stérile séparée (35 x 10 mm) et stériliser par irradiation (11 Gy). </li><li> Préparer la solution de collagène pour le revêtement de membranes: 50 pg / ml, 154 pi par insert (insérer Surface 1,54 cm 2). </li><li> Placez quelques gouttes (~ 20 pi par goutte) de solution de collagène dans un cercle sur la surface de la membrane d&#39;insertion (ne laissez pas la pointe de la pipette toucher la surface), puis ajouter délicatement le reste de l&#39;aliquote pour former une forte baisse sur le surface de la membrane. S&#39;assurer que la solution de collagène reste hémisphérique et ne s&#39;écoule pas à partir de la surface de la membrane. </li><li> Couvrir le plat de Pétri avec un couvercle et incuber pendant 1 heure à température ambiante sur une surface plane. </li><li> Aspirer la solution de collagène et laver la membrane une fois en couvrant avec 160 pi de PBS. </li><li> Aspirate le PBS et remettre le couvercle. Si vous utilisez le même jour, placez la boîte de Pétri dans un endroit sec à température ambiante. Sinon, placez le plat à 4 ° C et utiliser l&#39;insert dans les 7 jours. </li></ol> 2. Culture cellules endothéliales sur les inserts supérieurs <ol><li> Préparer suspension CE dans le milieu de culture souhaitée. Assurez-vous que la viabilité cellulaire est&gt; 98% et l&#39;utiliser immédiatement. </li></ol> Note: Pour veine ombilicale humaine CE (HUVEC), 4 x 10 5 cellules dans 160 ul par insert est utilisé. <ol start="2"><li> Prenez les boîtes de Pétri avec des inserts revêtus de collagène préparés à la section 1, ne pas retirer les inserts de la vaisselle. Placez quelques petites gouttes de la suspension cellulaire (environ 20 pi par goutte) dans un cercle sur la surface de la membrane enduite de collagène (ne pas laisser la pointe de la pipette contact de la surface), puis ajouter délicatement le reste de la suspension de cellules pour former une forte baisse. Assurez-vous que la suspension cellulaire reste hemis<html> pherical et ne s&#39;écoule pas à partir de la surface de la membrane. </li><li> Remplacer les couvercles et placer soigneusement les plats dans un 5% de CO 2 incubateur de culture cellulaire et incuber (sans agitation) à 37 ° C pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de se fixer sur la membrane. </li><li> Ajouter lentement 5 ml de milieu de culture de chaque boîte de Petri en sorte que l&#39;insert reste sur le fond de la boîte et est complètement recouvert par le support. Remplacer les couvercles et placer soigneusement les plats de retour dans l&#39;incubateur. Culture des cellules à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Utilisez la même méthode pour préparer le second (facultatif) insert inférieur avec des cellules qui représentent le micro-environnement local, qui sera placée sous l&#39;insert contenant la couche CE. </li></ol> Remarque: si les inserts inférieurs sont inclus dans les expériences, les inserts supérieurs et inférieurs sont d&#39;abord reliés les uns aux autres avant de placer les inserts dans le dispositif 3D (figure 4B). e &quot;&gt; 3. Assemblez la chambre d&#39;écoulement périphérique 3D <ol><li> Visser les plaques supérieure et inférieure, connecter les plaques de l&#39;unité d&#39;échange de gaz en utilisant un tube, placer le dispositif assemblé dans un sac en plastique propre, et stériliser le sac et son contenu par irradiation (11 Gy). </li><li> Enlevez un plateau-plateau de l&#39;incubateur de culture cellulaire, la placer dans une hotte de culture de tissus stériles, pulvérisation avec de l&#39;éthanol à 70%, essuyer, puis recouvrir le plateau avec une grande serviette stérile. </li><li> Placez le sac en plastique irradié dans le capot, retirez le périphérique dans le sac et le placer sur le plateau incubateur stérile. Connecter le dispositif à la pompe péristaltique avec la tubulure prévue. Programme de la pompe pour une vitesse optimale de 0,2 ml / min. </li></ol> Remarque: Pour raccorder la pompe à la prise de courant, extruder le cordon électrique à travers le trou dans la face arrière de l&#39;incubateur. Utilisez fiche de voleur autour du cordon afin de s&#39;assurer que le trou est hermétique. <ol start="4"><li&gt; La place 5-7 ml de milieu de culture désirées dans un tube stérile 15 ml (pour le &quot;entrée&quot;). </li></ol> 4. Premier de la chambre d&#39;écoulement périphérique 3D <ol><li> Déconnecter la tubulure d&#39;entrée de la prise en tirant l&#39;aiguille métallique de la tubulure (utiliser de petites serviettes stériles pour maintenir la stérilité de la tubulure). Utilisation de l&#39;aiguille métallique reliée à la tubulure en tant que &quot;entrée&quot; et l&#39;extrémité coupée du tube en tant que &quot;sortie&quot;. Placez l&#39;entrée de l&#39;aiguille métallique dans le tube de 15 ml avec les médias; placer la sortie dans le tube de vide ml 15. </li><li> Mettre la pompe de sorte que le flux est réglé dans le sens antihoraire et la vitesse d&#39;écoulement de 0,2 ml / min. Permettre à la pression négative pour attirer le fluide à partir du tube d&#39;admission de 15 ml dans le tube et d&#39;arrêter la pompe lorsque le support atteint la fin du tube immédiatement avant qu&#39;il se connecte à l&#39;appareil (figure 2, arrêt n ° 1). </li><li> Dévisser les plaques supérieure et inférieure de l&#39;appareil. Retirez délicatement la plaque supérieure et le lieu 1,500 - 1,550 l de médecineUM (soit le milieu seul ou en plus des chimiokines expérimentales) dans les puits inférieurs. Vérifiez que le support contient également suffisant pour former une demi-sphère qui atteint environ 1 - 2 mm au-dessus de la plaque inférieure. </li><li> Transférer l&#39;insert préparé à partir de la boîte de Petri dans les puits de la plaque inférieure à l&#39;aide des pinces stériles, en s&#39;assurant qu&#39;aucune bulle sont piégés sous les inserts. Aspirer tout support qui apparaît sur la surface de la plaque inférieure de sorte que la plaque reste sèche. Placer la plaque supérieure en arrière sur la plaque inférieure et re-connecter les plaques à l&#39;aide des vis. </li><li> Tournez immédiatement à la pompe péristaltique et permettre au milieu de circuler à travers le dispositif 3D. Élever l&#39;extrémité de sortie du dispositif et de maintenir la chambre dans cette position, pour empêcher la formation de bulles à l&#39;intérieur de l&#39;espace entre les plaques. </li><li> Laisser le milieu de remplissage de la chambre et la tubulure reliant la chambre à l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Arrêtez immédiatement la pompe avant que le milieu atteigne le gaz eunité de Xchange (Figure 2; Arrêt n ° 2). Placer 3 ml de milieu dans l&#39;unité d&#39;échange de gaz, tourner sur la pompe, et de permettre aux bulles d&#39;air de s&#39;échapper à travers l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Élever l&#39;unité d&#39;échange de gaz pour permettre au moyen de remplir le tube sortant de l&#39;unité d&#39;échange de gaz et d&#39;arrêter la pompe lorsque le produit arrive jusqu&#39;à 2-3 cm avant la fin de la tubulure de sortie (figure 2, l&#39;arrêt # 3). </li><li> Connecter l&#39;aiguille métallique entrée vers la sortie à l&#39;aide de petites serviettes stériles. Reprogrammer la pompe de sorte que les flux de fluide dans le sens inverse (sens horaire) vers l&#39;unité d&#39;échange de gaz et d&#39;assurer toutes les bulles d&#39;air sont éliminées une fois qu&#39;ils atteignent l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Vérifiez qu&#39;aucune bulle d&#39;air dans le système. </li><li> Reprogrammer la pompe de sorte que le fluide circule dans le sens antihoraire. Ajouter 100 pl de la suspension cellulaire de test à l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Fermer le couvercle de l&#39;unité d&#39;échange de gaz, placer le plateau avec l&#39;arrière du système de travail dans l&#39;incubateur, et permettent aux cellules de test pour circulantdans le dispositif électronique 3D à 37 ° C pendant le temps souhaité. </li></ol> Remarque: Nettoyer le cordon électrique de la pompe à l&#39;éthanol 70% et le placer à l&#39;intérieur de l&#39;incubateur. 5. Mettre fin à l&#39;essai et de recueillir des échantillons pour essai <ol><li> Retirez le plateau avec le système de travail de l&#39;incubateur et le placer dans la hotte. Arrêter la pompe, débrancher l&#39;entrée et à la sortie, et placez les extrémités dans vides stériles tubes de 15 ml. </li><li> Mettre la pompe et recueillir la suspension de cellules à partir du système; lieu de la suspension cellulaire sur de la glace, le cas échéant, jusqu&#39;à son utilisation. </li><li> Démonter la chambre en retirant les vis et soulevant la plaque supérieure. Retirer les inserts de la plaque inférieure et les transférer sur des boîtes de Pétri. </li></ol> Note: Les inserts peuvent être colorées de visualiser et de compter les cellules in situ (cristal violet 0,05% en dH 2 O) ou la trypsine pour recueillir la CE pour de plus amplestest. <ol start="4"><li> Retirez le support et les cellules des puits inférieurs dans des tubes et centrifuger pendant 5 min à 210 x g. Retirer le surnageant, laver et remettre en suspension les cellules comme souhaité, et traiter les cellules selon les objectifs expérimentaux spécifiques (voir plus loin). </li></ol>

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Cascade LifeSciences Inc. possède les droits exclusifs de brevet n ° US 7,927,867 B2 &quot;Dispositif d&#39;évaluation dans la migration cellulaire in vitro dans des conditions d&#39;écoulement et les méthodes de leurs usages». SKK est un inventeur de la technologie de l&#39;appareil de la chambre de flux 3D et un co-fondateur scientifique et actionnaire de Cascade LifeSciences Inc.

extravasation des cellules est le processus par lequel les cellules circulantes quittent la circulation sanguine et est une composante essentielle de nombreuses réactions physiologiques dans l&#39;organisme. Le processus est aussi important pour la régénération des tissus, comme par exemple, lorsque les cellules thérapeutiques mobilisés à partir de tissus dans les vaisseaux sanguins (ou injecté par voie intraveineuse) migrent à travers le système vasculaire et sortent de la circulation sur les sites de blessure ou de dégénérescence. Extravasation est également une composante essentielle de la pathogenèse de nombreuses maladies, y compris l&#39;inflammation, le rejet immunitaire, l&#39;auto-immunité, et la métastase des tumeurs. Extravasation est un processus à plusieurs étapes complexe qui implique l&#39;interaction de cellules avec des cellules endothéliales (EC) circulant dans des conditions d&#39;écoulement physiologique. Le procédé consiste à (a) de roulement de la cellule, (b) l&#39;adhésion ferme à la surface luminale des CE, et (c) la transmigration à travers la CE. Surtout, chaque étape de la cascade d&#39;extravasation est régulée par un sous-ensemble de cell spécifique au type et des molécules spécifiques à l&#39;espèce. Cependant, les mécanismes moléculaires détaillées qui régissent l&#39;extravasation des sous-ensembles de cellules spécifiques sont pas bien comprises, en grande partie en raison de la difficulté technique de rappeler les conditions dans le sang. Le dispositif 3D roman décrit ici est conçu pour surmonter ces défis techniques et permettre d&#39;effectuer des essais qui permettront d&#39;améliorer notre compréhension de la biologie de la migration cellulaire. Les molécules qui interviennent dans la migration cellulaire sont des cibles thérapeutiques importantes. Une compréhension détaillée des événements moléculaires qui contrôlent la migration des types cellulaires spécifiques aidera à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la promotion ou l&#39;inhibition de l&#39;extravasation. Par exemple, les interventions qui améliorent la migration des cellules souches thérapeutiques (qu&#39;elles dérivent de tissus fœtaux adultes, néonatale ou même d&#39;) vers des sites de lésion ou de la dégénérescence serait d&#39;une grande utilité dans la régénération tissulaire.Il ya un intérêt croissant pour la production in vitro de cellules souches thérapeutiques, y compris les cellules dérivées de sources pluripotentes, et dans des cellules ex vivo manipulés souches adultes (élargi, manipulé génétiquement et prétraité avec différentes enzymes) 1. Ainsi, il existe un besoin pour de nouvelles technologies à évaluer la qualité des cellules souches avant qu&#39;ils ne soient utilisés à des fins thérapeutiques. Parmi les autres paramètres, les cellules doivent être en mesure de sortir efficacement la circulation, car les traitements pour les troubles multifocales peuvent nécessiter une administration intraveineuse des cellules souches 2. En effet, l&#39;un des défis actuels de la biologie des cellules souches est de remédier à la très faible efficacité avec laquelle les cellules souches maison aux sites des lésions tissulaires 3-6, soulignant la nécessité de combler cette lacune dans notre compréhension de la migration des cellules souches. En revanche, les stratégies que la migration des cellules de bloc en ciblant des molécules spécifiques homing serait utile pour le traitement de l&#39;enmaladies inflammatoires et auto-immunes ainsi que le cancer métastatique. Ainsi, la compréhension des mécanismes moléculaires qui interviennent dans les interactions entre les cellules circulantes et la CE au cours de la migration cellulaire et extravasation est pertinent pour la médecine translationnelle et la découverte de médicaments ainsi que de la science fondamentale. Il ya actuellement un certain nombre de méthodes disponibles pour étudier les différents aspects de la migration cellulaire. Cependant, ces méthodes présentent des inconvénients qui peuvent être surmontés avec le nouveau dispositif 3D. Les modèles animaux: Les modèles animaux, tels que des souris immunodéprimées et les souris génétiquement manipulées, ont été des outils utiles pour étudier la migration des cellules humaines in vivo. Cependant, un inconvénient important pour ces modèles est que les cellules humaines interagissent faiblement avec les molécules d&#39;adhésion présentes sur les souris CE, en partie à cause des différences de séquences spécifiques d&#39;espèces dans de nombreuses molécules de surface cellulaire. Ainsi, l&#39;utilisation des rongeurs pour étudiermigration cellulaire humaine est peu susceptible de refléter authentiquement les événements de lits vasculaires spécifiques d&#39;organes humains. En outre, dans des modèles in vivo ne sont pas adaptés pour le criblage à haut débit de candidats-médicaments. Le classique des modèles in vivo à l&#39;aide d&#39;étudier cellule homing ne discriminent pas entre les différentes étapes de la cascade d&#39;extravasation, il est difficile d&#39;identifier et de cibler de nouvelles molécules à tête chercheuse. L&#39;approche de microscopie intravitale a été développé pour répondre à ce besoin et a été instructif, mais cette technique demande beaucoup de temps et de main-d&#39;œuvre 7,8. Dosages de transmigration statiques: Transwell ou Boyden chambre essais migration des cellules de mesure à travers une membrane poreuse et sont largement utilisés dans les études sur la migration. Le test a l&#39;avantage qu&#39;il peut être utilisé pour étudier non seulement la motilité cellulaire et la matrice des interactions cellule-extracellulaire (MEC), mais aussi la migration chimiokine médiée par des cellulesà travers une monocouche CE cultivées sur des membranes poreuses. Malheureusement, le phénotype et la fonction des CE dans des conditions statiques diffèrent sensiblement de ceux sous flux physiologique 9,10. Ainsi, les événements chimiotactiques qui se produisent dans des dosages TRANSWELL ne fidèlement imiter les interactions entre les cellules migrantes et des CE au titre de la contrainte de cisaillement. En outre, l&#39;étape de «roulement» de la cascade homing, ce qui ajoute une dimension supplémentaire de la sélectivité à l&#39;ensemble du processus, ne se produit pas dans des essais statiques TRANSWELL. Ainsi, alors que cette technologie ne permettra l&#39;évaluation quantitative de la migration cellulaire chimiokine induite à travers la monocouche CE, elle est limitée par son incapacité à fournir la contrainte de cisaillement qui imite le flux sanguin in vivo. Des essais sous contrainte de cisaillement: Mur contrainte de cisaillement est connue pour jouer un rôle important dans la régulation de la fonction CE 9,10. Les forces de cisaillement induisent une activation rapide des cascades de signalisation, transcLes facteurs de Ription, et l&#39;expression différentielle des gènes dans l&#39;affaire CE 11,12. Cette information a conduit au développement de la prochaine génération de tests d&#39;adhésion - chambres à flux laminaire parallèles et capillaires - étudier roulement et l&#39;adhérence des cellules à la CE dans des conditions de contrainte de cisaillement 7,13. Le facteur limitant pour ces tests est qu&#39;ils peuvent mesurer seulement de roulement et l&#39;adhérence, mais ne fait pas de différence entre une cellule adhérente qui irait à transmigrer et une cellule adhérente qui est «arrêté» sur la monocouche CE et ne serait pas transmigrer. De plus, ces tests ne peuvent pas mesurer la migration des cellules vers un gradient de chimiokine. Plusieurs rapports ont décrit la capacité des cellules adhérentes à ramper sous une monocouche CE cultivées sur des lames de verre dans des conditions d&#39;écoulement 14. Les limites de cette technique ramper comprennent: il analyse seulement un nombre limité de cellules, c&#39;est non quantitative, il analyse cellulaire rampant sur la matrice et celL surface mais pas la migration vers un gradient chimiotactique, et il ne permet pas aux cellules transmigré à être isolés. Ainsi, bien que ce test a l&#39;avantage de l&#39;application de la contrainte de cisaillement à la monocouche CE, il ne peut pas quantifier la migration des cellules vers un gradient de chimiokine. La technologie 3D roman décrit ici surmonte un grand nombre de ces lacunes en combinant la force de cisaillement (compartiment supérieur) avec un gradient de chimiokine statique (compartiment inférieur) et permet une évaluation quantitative de chaque étape de la cascade d&#39;extravasation (Figure 1). Le dispositif peut également être utilisé pour étudier comment la diaphonie entre la CE et le microenvironnement influe sur la capacité de la CE à soutenir extravasation des cellules circulantes. Le protocole suivant décrit la méthode étape par étape pour l&#39;utilisation du dispositif de chambre de flux 3D.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>Réactif/Matériau</fort></td></tr><tr><td>Tube PVC (alésage 1,42, paroi 0,8)</td><td>Watson-Marlow Limitid</td><td>981.0142.000</td><td></td></tr><tr><td>Chambre 3D</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Échangeur de gaz</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FCR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Inserts</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FCI-1005U</td><td></td></tr><tr><td>Collagène Bovin, Type I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique 0.1M</td><td>VWR</td><td>BDH3200-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>CC- 2517</td><td></td></tr><tr><td>EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)</td><td>Lonza</td><td>CC - 3124</td><td></td></tr><tr><td>Solution neutralisante de trypsine</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>R7D System</td><td>460-SD</td><td></td></tr><tr><td>Extracel Trial 2.5 Kit</td><td>Glycosam Byosystems</td><td>GS211</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine, humaine , nature</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Cerveau humain Cellules endothéliales microvasculaires</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Milieu cellulaire endotélial (ECM) pour cellules cérébrales</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>StemCells Tecnologies</td><td>7050</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa, 10 &mu ; g</td><td>Invitrogen</td><td>PHC3015</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1, souris anti-humaine, CD106-FITC</td><td>Southern Bioteck</td><td>9519-02</td><td></td></tr><tr><td>Coloration à l’iodure de propidium Solutuion</td><td>BD Pharmingen</td><td># 556463 Sang</td><td></td></tr><tr><td>de cordon humain congelé CD34+ cellules</td><td>StemCell</td><td>CB007F</td><td></td></tr><tr><td>Sang de cordon humain congelé CD34+ cellules</td><td>Zenbio</td><td>SER - CD34-F</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>StemCells Tecnologies</td><td>GFM3434</td><td></td></tr><tr><td>Souris Méthylcellulose média complet</td><td>R& D</td><td>HSC007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Von Willibrand Factor</td><td>anticorps abcam</td><td>C# ab11713</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Petry (35 x 10 mm)</td><td>VWR</td><td>CA25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>VWR Fisher</td><td>21008 - 918</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture tissulaire 75cm2</td><td>VWR</td><td>BD353136</td><td></td></tr><tr><td>Cristal violet</td><td>Sigma</td><td>C-3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection, courbe</td><td>VWR</td><td>82027-384</td><td></td></tr><tr><td>1 000 &mu ; l Pointes de pipette</td><td>VWR</td><td>83007-380</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu ; l Pointes de pipette</td><td>VWR</td><td>37001-530</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Watson-Marlow Limitid</td><td>403U/VM3</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel tridimensionnelle chambre d&#39;écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d&#39;écoulement physiologiques

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

L&#39;extravasation des cellules du sang circulant joue un rôle central dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques, y compris les cellules souches métastases homing et de la tumeur. Le dispositif de chambre écoulement tridimensionnel (ci-après le dispositif 3D) est une nouvelle technologie in vitro qui reproduit la contrainte de cisaillement physiologique et permet à chaque étape de la cascade de l&#39;extravasation des cellules à quantifier. Dispositif 3D consiste en un compartiment supérieur dans lequel les cellules d&#39;intérêt circulent sous contrainte de cisaillement, et un compartiment inférieur de puits statiques qui contiennent des facteurs chimiotactiques d&#39;intérêt. Les deux compartiments sont séparés par des inserts poreux revêtu d&#39;une monocouche de cellules endothéliales (EC). Un second insert en option avec les cellules du microenvironnement d&#39;intérêt peut être placé immédiatement sous la couche CE. Un appareil d&#39;échange de gaz permet à l&#39;optimal tension de CO 2 pour être maintenu et fournit un point d&#39;accès pour ajouter ou retirer des cellules ou des composés au cours de l&#39;expérience. Les cellules de test circulent dans le compartiment supérieur à la contrainte de cisaillement souhaitée (débit) contrôlée par une pompe péristaltique. A la fin de l&#39;expérience, les cellules circulantes et migré sont collectés pour des analyses plus poussées. Le dispositif 3D peut être utilisé pour examiner cellule rouler sur et l&#39;adhésion à la CE sous la contrainte de cisaillement, transmigration en réponse aux gradients de chimiokines, la résistance au cisaillement, la formation de grappes, et la survie cellulaire. En outre, le second insert en option permet des effets de diaphonie entre la CE et les cellules du microenvironnement à examiner. Les applications de translation du dispositif 3D comprennent des tests de médicaments candidats que la migration de la cellule cible et prédire le comportement in vivo des cellules après injection intraveineuse. Ainsi, le dispositif de 3D roman est un outil polyvalent et peu coûteux d&#39;étudier les mécanismes moléculaires qui interviennent dans extravasation cellulaire.

La moelle osseuse murine dérivée ligne CE STR-12 a été cultivé sur des plaquettes avec des pores de 5 um. Le taux de croissance CE a été contrôlée au microscope lors que la CE était de 100% de confluence, les inserts ont été transférés dans les puits dans le compartiment inférieur de l&#39;appareil 3D. Immédiatement avant de placer les inserts, les puits de la compartiment inférieur ont été remplis de milieu de culture seul (témoin négatif) ou avec un milieu additionné de stroma dérivée de cellules facteur-1 (SDF-1, 5 ng / ml et 50 ng / ml). Par la suite, le dispositif 3D a été assemblé et la chambre était remplie de fluide tel que décrit dans le protocole. Les cellules d&#39;essai doit être diffusé dans le compartiment supérieur de l&#39;appareil ont été fraîchement récoltées cellules de la moelle osseuse murine (3,5 x 10 6 cellules par chambre). Une contrainte de cisaillement défini de 0,8 dyn / cm 2 est appliquée en réglant le débit de la pompe péristaltique à 0,2 ml / min. Le système de travail ensemble est ensuite placé dans le 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C et la CElls ont été autorisés à circuler et d&#39;interagir avec la monocouche CE pendant 4 heures. Au bout de ce temps, les cellules circulantes ont été prélevés, la chambre a été démonté, et les inserts ont été retirés, comme décrit dans le protocole. Les cellules transmigré ont été récoltés dans les puits inférieurs, lavées, remises en suspension dans un milieu frais, et transférés aux cultures de méthylcellulose complétées par des facteurs de croissance hématopoïétiques pour cellulaire (CFC) essai de formation de colonies (figure 3). Comme prévu, nous avons trouvé un nombre significativement plus élevé de CFC avait migré à travers la monocouche CE dans les puits contenant 50 ng / ml SDF-1 que de puits contenant 5 ng / ml SDF-1 ou milieu seul. Comme nous l&#39;avons décrit précédemment, aucun des cours en techniques in vitro disponibles pour étudier la migration des cellules sont capables de tester l&#39;effet du micro-environnement local sur la capacité de la CE à soutenir extravasation des cellules migrantes. Pour illustrer comment cela peut être réalisé avec le dispositif 3D, nousextravasation examiné de cellules hématopoïétiques circulant à travers une couche de CE et d&#39;une couche de cellules stromales de la moelle osseuse. Pour cela, un deuxième insert (en bas) contenant une couche de cellules stromales est juxtaposée à la pièce supérieure contenant la monocouche CE dans la plaque inférieure (figure 4). L&#39;expérience a ensuite été réalisée comme décrit ci-dessus et les cellules transmigré ont été récoltées à partir des puits et comptés. Les résultats ont démontré que l&#39;insertion d&#39;une couche supplémentaire de cellules stromales sous la monocouche CE augmenté de façon significative la migration des cellules hématopoïétiques vers SDF-1 (figure 4). Ce résultat est cohérent avec l&#39;idée que le micro-environnement local contribue au recrutement de cellules circulant dans le tissu. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" /> <strong&gt; Figure 1. Dispositif de chambre de flux 3D. A: Le dispositif 3D scellé hermétiquement est composé de deux compartiments séparés par une membrane poreuse jetable (PM). CE sont cultivés sur la membrane, qui forme alors une barrière entre les compartiments supérieur et inférieur. Des contraintes de cisaillement déterminées sont appliquées au compartiment supérieur du dispositif 3D par médias perfuser à l&#39;aide d&#39;une pompe péristaltique de perfusion constante. Cellules circulantes sont soit sans interaction (NIC), d&#39;interagir avec la CE transitoire (&#39;roll »; RC), ou adhérer à la CE (AC). Une sous-population de cellules adhérentes transmigre à travers la couche de la CE au compartiment statique inférieure du dispositif (TM) B:. Une vue de dessus dessin (panneau supérieur) du dispositif 3D. La vue en coupe horizontale (panneau inférieur) montre la position de la membrane supérieure (rouge), la membrane inférieure (vert) et le fond du puits (bleu) C:. L&#39;isometric vue illustre les parties intégrantes du dispositif: quatre vis, un bloc acrylique haut, un joint de la chambre haute, supérieure et membranes inférieures, en bas o-ring, et un bloc de fond acrylique 3 et D:. une photographie de l&#39;écoulement 3D chambre reliée à une pompe péristaltique et d&#39;une unité d&#39;échange de gaz. Le système est assemblé dans une hotte stérile, puis transféré dans un incubateur de culture cellulaire. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" /> Figure 2. Une représentation schématique du système de dispositif 3D. Le dessin montre les trois arrêts nécessaires pour assembler le système. Le milieu de culture est aspiré à partir de l&#39;orifice d&#39;entrée par la pression négative créée par la pompe péristaltique. L&#39;écoulement du fluide est coupée par arrêt N ° 1 pour permettre aux inserts d&#39;être placés dans l&#39;appareil. Après la chambre est fermée, la pompe est Switched en marche et l&#39;enceinte est aussitôt remplie d&#39;un fluide pour empêcher le séchage des cellules cultivées sur les inserts. Arrêt n ° 2 permet milieu pour être placé dans l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Arrêter ° 3 permet l&#39;écoulement soit arrêté pour la connexion de l&#39;entrée et la sortie. Le flux peut être orienté dans une direction dans le sens horaire ou anti-horaire pour éliminer les bulles d&#39;air à travers l&#39;unité d&#39;échange de gaz à l&#39;aide d&#39;un interrupteur situé sur la pompe. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" /> Figure 3. Le dispositif 3D supporte transmigration SDF-1 médiée par des progéniteurs hématopoïétiques dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique. A: Trois dispositifs (contenant chacune trois puits dans le compartiment inférieur) ont été assemblés et fonctionnent en parallèle. Medium seul ou milieu contenant SDF-1 à 5 ou 50 ng / ml ont été ajoutés aux puits compartiment inférieur. Murin bocellules de la moelle NE ont été autorisés à circuler dans les dispositifs de 4 heures. Par la suite, chaque appareil a été démonté et les cellules qui avaient transmigré vers SDF-1 (jaune) ont été recueillies à partir des puits inférieurs, compté, et cultivé dans de la méthylcellulose complétée par des facteurs de croissance hématopoïétiques (GF). Quatorze jours plus tard, les colonies ont été marqués sous le microscope B:. Le nombre de progéniteurs (cellules formant des colonies, CFC) récupérée à partir des compartiments inférieurs est montré en moyenne ± SD de trois puits par condition. * P &lt;0,05. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;effet du microenvironnement sur ​​les interactions entre les cellules hématopoïétiques et des cellules endothéliales. A: L&#39;illustration montre la position d&#39;une seconde membrane poreuse avec st culturefibroblastes romal (SF) sous la membrane supérieure avec la CE. D&#39;autres abréviations sont comme décrit pour la figure 1A B:.. L&#39;membrane supplémentaire (insert inférieur) avec SF culture a été inséré sous la membrane supérieure C: Trois dispositifs (contenant chacun 3 puits) ont été exécutés en parallèle. Medium seul ou milieu contenant SDF-1 à 50 ng / ml SDF-1 a été ajouté aux puits de compartiment inférieur. Les chambres de commande négatives omises SC, SDF-1, ou les deux. les cellules de la moelle osseuse ont été autorisés à circuler pendant 4 heures à 37 ° C. Par la suite, chaque appareil a été démonté et les cellules transmigré ont été recueillies à partir des puits de compartiment inférieur et compté. Le nombre de cellules transmigré récupérés est présenté comme la moyenne ± SD de trois puits par condition. * P &lt;0,05.

Dispositif de chambre de flux en trois dimensions est une nouvelle<em&gt; In vitro</em&gt; Technologie pour l&#39;évaluation quantitative et progressive de la cascade de l&#39;extravasation des cellules circulantes dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique. Le dispositif vient donc combler un besoin critique pour les études de base, préclinique, clinique et de la migration cellulaire.

A Novel tridimensionnelle chambre d&#39;écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d&#39;écoulement physiologiques

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer quantitativement la migration de cellules circulantes en direction d'un gradient de chimiokine. Dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique, cette migration est obtenue en cultivant d'abord une monocouche de cellules endothéliales sur des inserts microporeux revêtus de collagène, puis en assemblant ces inserts dans une chambre à flux où ils recouvrent un compartiment statique distinct contenant des chimiokines. Ensuite, une contrainte de cisaillement est appliquée aux cellules afin de reproduire les conditions physiologiques observées dans la vascularisation.En tant que deuxième étape, on laisse circuler des cellules d'intérêt, telles que des leucocytes, des cellules souches ou des cellules tumorales, dans le système 3D pendant la circulation. Les composants présents dans le compartiment statique influencent l'efficacité des interactions entre les cellules circulantes et les cellules endothéliales, ainsi que le taux de transmigration des cellules d'essai à travers la couche endothéliale. Ensuite, le système 3D est désassemblé et les cellules d'essai transmigrées sont récupérées à partir du compartiment statique inférieur afin de mesurer quantitativement la migration cellulaire à l'aide de diverses méthodes de pointe. Les résultats obtenus illustrent la capacité des cellules d'essai circulantes à interagir avec les cellules endothéliales dans des conditions d'écoulement physiologique et à quitter la circulation en fonction de la concentration de chimioattractants présents dans le compartiment statique.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation de chambres à écoulement laminaire parallèle et les essais de transfert statique, est qu'elle combine à la fois le stress de cisaillement dans le compartiment supérieur et le chimiotactisme dans le compartiment inférieur statique. Cela permet aux chercheurs de mesurer quantitativement l'externalisation des cellules circulantes en réponse au gradient chimiotactique ainsi que dans des conditions d'écoulement physiologique. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier l'effet de la communication croisée entre les cellules du microenvironnement local et les cellules endothéliales sur l'extravasation des cellules circulantes.En aidant à ajouter une couche supplémentaire de cellules sur un insert séparé placé sous les cellules endothéliales, la procédure sera démontrée par Valentina contre Rova, une technicienne de mon laboratoire. Pour commencer, calculez le nombre d'inserts nécessaires pour l'expérience et placez chaque insert dans une boîte de Pétri stérile séparée. Stérilisez-les par irradiation gamma jusqu'à ce que la dose totale atteigne 11 gray, selon les paramètres individuels.Ensuite, diluez la solution mère de collagène. Type un à 50 microgrammes par millilitre à l'aide d'acide chlorhydrique 0,01 molaire conservé à quatre degrés Celsius et préparez des aliquotes de 154 microlitres de la solution finale pour chaque insert. Puis déposez plusieurs gouttes provenant d'un Eloqua sur la surface de l'insert selon un motif circulaire.Ensuite, ajoutez le reste de l'aliquote pour former une goutte plus grande sur la surface de l'insert. Veillez à ce que la pointe de la pipette ne touche jamais l'insert et à ce que le collagène recouvre entièrement la surface de l'insert, sans s'écouler. Une fois l'insert recouvert, placez le couvercle sur la boîte de Pétri et déposez-la soigneusement sur une surface plane.Incuber les inserts pendant une heure à température ambiante ; après l'incubation, aspirer la solution de collagène et laver la membrane avec 160 microlitres de PBS. Ensuite, aspirer le PBS. Remettre le couvercle et envelopper la boîte avec du paraforme.Si les inserts doivent être utilisés le jour même, placez la boîte de Pétri dans un endroit sec à température ambiante. Sinon, placez la boîte à quatre degrés Celsius et utilisez l'insert dans les sept jours. Récoltez les cellules endothéliales humaines de veine ombilicale cultivées juste avant utilisation et remettez-les en suspension dans le milieu de culture souhaité à raison de 2,5 millions de cellules par millilitre.Lors du comptage des cellules, s'assurer que la viabilité cellulaire est supérieure à 98 % en utilisant le bleu de trypan, puis ajouter 160 microlitres de la suspension cellulaire sur chaque insert. Commencer par déposer plusieurs petites gouttes sur la surface de l'insert recouvert de collagène en formant un cercle, puis ajouter soigneusement le reste de la suspension cellulaire afin de former une goutte unique et plus grande. Une fois terminé, remettre les couvercles en place et placer délicatement les boîtes dans un incubateur contenant 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, puis incuber pendant 30 minutes afin de permettre aux cellules de s'attacher à la membrane.Après 30 minutes, retirez les plaques de l’incubateur et ajoutez délicatement cinq millilitres de milieu de culture préchauffé au-dessus de chaque insert. Veillez à ce que l’insert reste au fond de la boîte et soit entièrement recouvert par le milieu. Remettez ensuite les couvercles et replacez soigneusement les boîtes dans l’incubateur pour la culture.Les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour monter la chambre d'écoulement, vissez d'abord les plaques supérieure et inférieure ensemble. Ensuite, reliez les plaques à l'unité d'échange gazeux à l'aide d'un tube en PVC de 1,42 millimètre de diamètre intérieur et de parois de 0,8 millimètre d'épaisseur.Ensuite, placez l'appareil assemblé dans un sac en plastique propre et stérilisez-le par irradiation gamma jusqu'à ce que la dose totale atteigne 11 gray. L'étape suivante consiste à retirer un plateau d'incubateur, à le placer dans une hotte stérile de culture tissulaire et à le stériliser avec de l'éthanol à 70 %. Puis recouvrez le plateau d'une grande serviette stérile.Ensuite, retirez l'appareil du sac en plastique et placez-le sur le plateau stérile de l'incubateur. Puis, reliez l'appareil à la pompe péristaltique et programmez la pompe pour qu'elle fonctionne à une vitesse de 0,2 millilitre par minute. Prélevez à la pipette cinq à sept millilitres du milieu de culture souhaité dans un tube stérile de 15 millilitres destiné à l'entrée.Ensuite, déconnectez le tube d'entrée du tube de sortie en retirant l'aiguille métallique du tube à l'aide de petits chiffons stériles afin de maintenir la stérilité du tube, insérez l'aiguille métallique d'entrée dans le tube de 15 millilitres contenant le milieu, et placez le tube de sortie dans un tube vide de 15 millilitres. Ensuite, allumez la pompe pour que le flux soit en sens inverse des aiguilles d'une montre. Laissez la pression négative aspirer le milieu depuis le tube d'entrée de 15 millilitres vers le tube, puis arrêtez la pompe lorsque le milieu atteint l'extrémité du tube, juste avant d'entrer dans le dispositif.Ensuite, ouvrez l'appareil en dévissant les plaques du tube et retirez soigneusement la plaque supérieure. À l'aide d'une pipette, transférez de 1500 à 1 550 microlitres de milieu dans les puits inférieurs, en veillant à ce que les puits contiennent suffisamment de milieu pour former un hémisphère atteignant un à deux millimètres au-dessus de la plaque inférieure. Puis, transférez les inserts préparés des boîtes de Pétri vers les puits de la plaque inférieure. À l’aide d’une pince stérile, assurez-vous qu’aucune bulle n’est piégée sous les inserts et aspirez tout milieu apparaissant à la surface de la plaque inférieure.Ensuite, remettez la plaque supérieure sur la plaque inférieure et reconnectez-les. À l’aide des vis, allumez immédiatement la pompe péristaltique et laissez le milieu circuler à travers le dispositif 3D. Surélevez l’extrémité de sortie du dispositif et maintenez la chambre dans cette position afin d’éviter la formation de bulles dans l’espace entre les plaques.Continuez à remplir le tube reliant la chambre à l'unité d'échange gazeux avec du milieu jusqu'à ce qu'il atteigne l'unité d'échange gazeux. Ensuite, placez trois millilitres de milieu dans l'unité d'échange gazeux. Mettez la pompe en marche et laissez les bulles d'air s'échapper à travers celle-ci.Élevez l'unité pour permettre au milieu de remplir le tube qui en sort, puis arrêtez la pompe lorsque le milieu se trouve à deux ou trois centimètres de l'extrémité. Une fois l'ensemble correctement amorcé, reliez l'aiguille d'entrée au tube de sortie à l'aide de petits chiffons stériles. Inversez ensuite le sens de la pompe afin que le milieu circule dans le sens horaire vers l'unité d'échange gazeux, et veillez à éliminer toutes les bulles d'air résiduelles.Avec la pompe à nouveau en circulation dans le sens antihoraire, ajouter 100 microlitres de la suspension de cellules test dans l'unité d'échange gazeux. Puis fermer le couvercle du respirateur.Replacez le plateau dans l’incubateur et laissez les cellules d’essai circuler dans le dispositif à 37 degrés Celsius. Une fois le temps souhaité écoulé, retirez le plateau contenant le système opérationnel de l’incubateur et placez-le dans la hotte. Arrêtez la pompe, déconnectez l’entrée et la sortie, puis placez les extrémités dans des tubes stériles vides de 15 millilitres.Ensuite, allumez la pompe et récupérez la suspension cellulaire du système. Placez la suspension cellulaire sur de la glace jusqu'à son utilisation. Puis, démontez la chambre en retirant les vis et en soulevant la plaque supérieure.Retirez les inserts de la plaque inférieure et transférez-les dans des boîtes de Pétri pour la coloration ou la collecte des cellules. Enfin, retirez la suspension cellulaire des puits inférieurs et placez-la dans des tubes de 15 millilitres. Rincez chaque puits deux fois avec 1,5 millilitre de milieu et ajoutez-le au tube correspondant.Ensuite, centrifuger les tubes pendant cinq minutes à 200 G et traiter les cellules selon les objectifs expérimentaux spécifiques, tels que ceux énumérés dans le protocole accompagnant le texte illustré. Voici un exemple parmi les nombreux tests pouvant être réalisés à l’aide de ce système. Le dispositif comprend des cellules endothéliales dérivées de moelle osseuse cultivées sur des inserts présentant des pores de cinq microns ; sous les inserts, le facteur stromal un ou SDF un a été ajouté à des concentrations de 0,5 ou 50 nanogrammes par millilitre.On a laissé les cellules de la moelle osseuse circuler dans le système 3D. Les cellules ayant migré à travers l'insert ont été recueillies, puis cultivées sur des plaques contenant un milieu à base de méthylcellulose. En présence de facteurs de croissance hématopoïétiques induisant la formation de colonies par les cellules progénitrices, le nombre de colonies a été décompté 14 jours plus tard afin de déterminer le nombre de progéniteurs dans chaque puits et d'évaluer leur capacité à migrer vers le sdf.Un dans des conditions d'écoulement physiologique. Avec l'ajout de fibroblastes stromaux cultivés sur l'insert inférieur dans la chambre statique, un plus grand nombre de cellules hématopoïétiques ont migré depuis la circulation vers la chambre avec l'ajout de SDF-1 à 50 nanogrammes par millilitre, par rapport à la seule présence de SDF-1 après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans divers domaines des sciences médicales et biologiques pour modéliser in vitro des lits vasculaires spécifiques aux tissus et explorer les mécanismes cellulaires et moléculaires médiant la migration des cellules circulantes vers les tissus normaux par rapport aux tissus malades.

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Dans ce protocole, un test de microfluide biomimétique, qui peut reproduire un environnement microvasculaire physiologiquement pertinent et reproduire l’ensemble de la cascade d’adhésion / migration des leucocytes, est utilisé pour étudier les interactions leucocytes-cellules endothéliales dans les maladies inflammatoires.

Un système microphysiologique pour étudier l’interaction leucocytaire-endothéliale pendant l’inflammation

Découvrez une chambre d'écoulement tridimensionnelle pour étudier l'extravasation cellulaire dirigée par chimiokines sous contrainte de cisaillement physiologique. Cette méthode permet de quantifier les interactions entre cellules circulantes et endothéliales.

A Novel tridimensionnelle chambre découlement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions découlement physiologiques (Vidéo) | JoVE Journal

A Novel tridimensionnelle chambre d'écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d'écoulement physiologiques

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