À haut débit Fluorometric Mesure de sol Potentiel activités enzymatiques extracellulaires

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les taux maximaux potentiels auxquels les enzymes extracellulaires présentes dans les sols dégradent leurs substrats cibles. Cela est réalisé en mélangeant d'abord du sol humide prélevé sur le terrain et un tampon dans un homogénéisateur, puis en pipetant les échantillons mélangés dans une plaque d'échantillonnage à puits profonds et des plaques de standard à puits profonds. Les plaques à puits profonds sont incubées puis centrifugées avant de transférer 250 microlitres de chaque puits des plaques à puits profonds vers les puits correspondants d'une plaque noire à fond plat.

Plaques de 96 puits. Les trois plaques sont ensuite lues au fluorimètre et les données obtenues sont analysées. En fin de compte, les activités potentielles des enzymes extracellulaires du sol sont déterminées par la vitesse à laquelle le colorant fluorescent est libéré à partir du substrat par une réaction catalysée par une enzyme, une fluorescence plus élevée indiquant une dégradation plus importante du substrat.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la possibilité de mesurer l'activité enzymatique dans un grand nombre d'échantillons en exploitant le format de microplaque profonde à 96 puits. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en identifiant la possibilité d'augmenter le volume d'échantillon par rapport à la microplaque standard, en adaptant d'autres protocoles au format de plaque à puits profonds. Les implications de cette technique nous permettent d'établir des liens plus étroits entre la physiologie microbienne et les processus à l'échelle des écosystèmes.

La démonstration visuelle est essentielle pour cette technique, car de nombreuses subtilités et manipulations d'échantillons ne sont pas faciles à suivre dans une procédure écrite. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'écologie microbienne et de la biogéochimie des sols, telles que la manière dont les micro-organismes du sol réagissent aux changements de leur environnement, et comment leurs réponses physiologiques influencent des processus écosystémiques essentiels, comme la décomposition et le recyclage des nutriments. Bien que cette méthode puisse fournir des éclairages sur la décomposition de la matière organique du sol, le recyclage des nutriments et les écosystèmes terrestres, elle peut également être appliquée à des systèmes marins et dulçaquicoles.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés avec les compétences de pipetage et les contraintes liées au temps dans le cadre de ce protocole. De plus, la grande quantité de données générées par cette procédure peut parfois sembler accablante pour les nouveaux utilisateurs. Pour commencer la mise en place du test, étiquetez trois plaques à puits profonds comme suit : échantillon, MUB standard pour quatre méthyl et béone, et MUC standard pour sept amino quatre méthyl coumarin.

Verser chaque standard et substrat dans des réservoirs propres et préalablement étiquetés séparés, disposés en lignes. Ensuite, pipeter le standard MUB approprié dans les puits correspondants de la plaque de standard MUB, comme indiqué dans le protocole écrit. Répéter ce processus pour les standards MUC dans les puits correspondants de la plaque de standard MUC afin de préparer les boues de sol.

Pour chaque échantillon de sol, peser 2,75 grammes de sol frais avant de l'ajouter à un mixeur. Ajouter 91 millilitres d'un tampon à 50 millimolaire et mixer à pleine puissance pendant une minute. Verser le contenu du mixeur dans un bol en verre propre, d'au moins la largeur d'une pipette à huit canaux, muni d'un barreau aimanté.

La boue de sol peut être versée à travers un tamis d'environ un millimètre avant de l'ajouter au bol. Placer le bol sur une plaque chauffante et mélanger la boue de sol. Ensuite, prélever à la pipette 800 microlitres de boue de sol et les transférer dans la première colonne de la plaque d'échantillons.

Procédez de la même manière pour la première colonne des plaques témoins MUB et MUC. Rincez le broyeur, la plaque chauffante agitée et l'agitateur magnétique avec de l'eau désionisée ou du tampon entre chaque échantillon de sol. Répétez ce processus pour chaque échantillon de sol.

Passer à la colonne suivante pour chaque échantillon successif. Ensuite, pipeter le substrat approprié dans les puits correspondants de la plaque d'échantillons. Comme indiqué dans le protocole écrit, préparer une plaque d'échantillons pour chaque température d'incubation à tester.

Sceller les plaques à puits profonds avec des films protecteurs. Inverser manuellement chaque plaque scellée jusqu'à ce que la solution soit complètement homogénéisée. Placer les plaques dans l'incubateur approprié pendant la durée d'incubation requise indiquée dans le protocole écrit, enregistrer l'heure initiale comme temps zéro, ainsi que les temps d'incubation appropriés à la fin de chaque période d'incubation.

Centrifuger les plaques scellées pendant trois minutes à environ 2 900 ×g. Après la centrifugation, transférer 250 microlitres de chaque puits des plaques à puits profonds incubées dans les puits correspondants de plaques noires plates à fond 96 puits. Une plaque noire sera utilisée pour chaque plaque à puits profonds incubée.

Il est important de transférer les échantillons des plaques profondes incubées vers les puits correspondants des plaques 96 puits noires à fond plat, en suivant les instructions du fabricant pour le lecteur de plaque Flora Metric utilisé. Régler la longueur d'onde d'excitation à 365 nanomètres et la longueur d'onde d'émission à 450 nanomètres.

Chargez l'une des plaques standard, réglez le fluorimètre sur le gain automatique et lisez la plaque. Ensuite, réglez le gain sur manuel et diminuez la valeur optimale jusqu'au prochain nombre inférieur arrondi au multiple de cinq le plus proche. Pour chaque plaque standard, répétez la mesure deux fois par plaque.

Ensuite, chargez la plaque d'échantillons. Réglez le gain sur automatique et exécutez la plaque d'échantillons. Réexécutez manuellement la plaque d'échantillons afin d'égaler le gain le plus élevé pour chacune des plaques standards.

Commencez l'analyse des données en entrant les données de fluorescence de la courbe standard dans un tableur pour les étalons MUB et MUC. Convertissez les concentrations en micromolaires en micromoles pour chaque échantillon. À partir des données de fluorescence de la courbe standard, calculez la pente, l'ordonnée à l'origine et les valeurs R² pour les concentrations standard de MUB et de MUC.

Les valeurs de r carré acceptables doivent dépasser 0,98 pour chaque échantillon. Les courbes standards peuvent être visualisées sur un graphique de dispersion, les mesures de fluorescence étant portées en tant que variable dépendante et la concentration des standards en tant que variable indépendante. Saisissez les données brutes de fluorescence de l’échantillon additionné du substrat dans un nouveau classeur.

Inclure également le temps d'incubation et la masse sèche du sol pour chaque échantillon, soustraire des valeurs de fluorescence des échantillons correspondants les valeurs d'ordonnée à l'origine de la courbe standard, puis diviser par la pente de la courbe standard correspondante. À l'aide de l'équation de la droite standard, multiplier les micromoles de l'échantillon par 91 millilitres, qui correspond au volume de tampon utilisé dans la suspension de sol. Diviser la valeur obtenue par le temps d'incubation spécifique à l'échantillon et par la masse de sol sec.

Enfin, multiplier la valeur obtenue par 1000 afin d'obtenir les unités souhaitées. Les résultats présentés proviennent d'une étude expérimentale sur le climat comparant des sols ayant subi des conditions climatiques ambiantes à des sols exposés à un enrichissement en dioxyde de carbone et à des traitements de chauffage ; les données illustrées ici correspondent aux activités enzymatiques extracellulaires potentielles, ou EEAs, sur le site de prairie soumis à un chauffage et à un enrichissement en dioxyde de carbone, dans les parcelles témoins et les parcelles traitées. Dans cet exemple, les activités enzymatiques potentielles liées à l'acquisition du carbone, de l'azote et du phosphore, mesurées à des profondeurs de sol de 0 à 5 centimètres, ne différaient pas selon le traitement expérimental.

Cependant, à des profondeurs de sol de cinq à quinze centimètres, plusieurs EAE potentielles différaient de manière significative. Par exemple, les enzymes dégradant le carbone, à savoir la bêta-1,4-glucosidase et la bêta-D-cellobiosidase, étaient plus faibles dans les parcelles soumises à une concentration élevée de dioxyde de carbone et à un réchauffement, par rapport aux parcelles sous conditions climatiques ambiantes ; les enzymes minéralisant l'azote et le phosphore étaient également plus faibles dans les parcelles traitées que dans celles sous conditions climatiques ambiantes, à des profondeurs de sol de cinq à quinze centimètres.

Le calcul et le tracé de la somme de toutes les activités enzymatiques extracellulaires (EEA) potentielles liées au cycle du carbone, de l'azote ou du phosphore peuvent constituer une approche utile pour observer des schémas plus larges concernant les cycles potentiels du carbone, de l'azote et/ou du phosphore dans le sol. Dans cet exemple, la somme des EEA potentielles de la bêta-1,4-glucosidase, de la bêta-D-cellobiosidase, de la bêta-xylosidase et de la alpha-1,4-glucosidase a été calculée pour représenter les activités potentielles de cyclage du carbone. La somme des EEA potentielles de la bêta-1,4-N-acétylglucosaminidase et de la L-leucine aminopeptidase a été calculée pour représenter les activités potentielles de cyclage de l'azote.

La phosphatase a été utilisée pour représenter les activités potentielles de cyclage du phosphore. Les PEA potentielles liées au cyclage du carbone, de l'azote et du phosphore totaux ont montré une tendance à la baisse dans les parcelles soumises à une concentration élevée de dioxyde de carbone et à un réchauffement, comparées aux parcelles exposées à des conditions climatiques ambiantes, à des profondeurs de sol comprises entre cinq et quinze centimètres. Toutefois, cette tendance n'était significative que pour les activités de cyclage de l'azote et du phosphore totaux, et les PEA du sol ne différaient pas de manière significative entre les parcelles expérimentales.

À des profondeurs de sol allant de zéro à cinq centimètres. Les résultats indiquent des tendances contrastées de l'activité enzymatique et des groupes fonctionnels parmi les parcelles traitées en fonction de la profondeur du sol ; le rapport des activités enzymatiques potentielles est une méthode permettant d'évaluer les besoins microbiens en nutriments. Ici, les enzymes du sol, la géométrie tochi, les rapports carbone sur azote, carbone sur phosphore ou azote sur phosphore présentent des différences significatives parmi les parcelles traitées à des profondeurs de sol allant de zéro à cinq centimètres.

Cependant, les rapports potentiels entre l'enzyme carbone et phosphore et entre azote et phosphore étaient plus élevés dans les parcelles soumises à une concentration élevée de dioxyde de carbone et à un traitement de réchauffement. Par rapport aux conditions climatiques ambiantes, la température aux profondeurs de sol de cinq à quinze centimètres peut fortement influencer les activités enzymatiques extracellulaires du sol. Toutefois, dans les essais de laboratoire typiques, les enzymes du sol sont mesurées à une température unique qui peut ne pas correspondre aux conditions de température C₂.

Les graphiques d’Arrhenius sont utilisés pour visualiser l’énergie d’activation et sont tracés en portant le logarithme de l’activité enzymatique en fonction de l’inverse de la température convertie en kelvins sur l’axe des abscisses. L’énergie d’activation est couramment définie comme l’énergie minimale requise pour catalyser une réaction chimique et est utilisée ici comme indicateur de la sensibilité à la température des réactions enzymatiques. Une énergie d’activation plus élevée indique une sensibilité accrue de l’enzyme à la température.

De même, les énergies d'activation correspondent directement au coefficient Q 10. Les valeurs du coefficient de température des cinétiques enzymatiques potentielles des EAE impliquant le carbone, l'azote et le phosphore ont été évaluées parmi les deux parcelles traitées à deux profondeurs de sol, et les résultats ont montré que la sensibilité à la température des EAE n'était pas significativement différente entre les parcelles traitées à aucune des deux profondeurs. Une fois maîtrisée, la technique permet d'ensemencer 12 échantillons dans des plaques microtitration à roue de 96 puits en 30 minutes ou moins.

En outre, après les durées d'incubation prescrites, vous pouvez généralement centrifuger, transférer et relire les plaques sur le uromètre dans un délai d'une demi-heure lors de la tentative de cette procédure. Il est important de pipeter de manière constante. Toute présence d'air lors du pipetage affectera négativement vos résultats suite à cette procédure.

D'autres méthodes, telles que l'extraction et le séquençage de l'ADN, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires liées au rôle de la composition des communautés microbiennes du sol dans la fonction du sol après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'écologie microbienne pour explorer le recyclage des nutriments et les processus biogéochimiques dans les écosystèmes terrestres. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne idée de la manière de quantifier les activités enzymatiques potentielles.

En outre, vous devriez être en mesure d'interpréter les données afin de refléter les réponses microbiennes potentielles à des facteurs tels que le climat et les différents types de sols au sein d'écosystèmes variés. N'oubliez pas que lors de la manipulation de matériaux fluorescents, des précautions doivent toujours être prises afin de minimiser l'exposition à la lumière en raison de la sensibilité à la lumière du groupe fluoro.