À haut débit Fluorometric Mesure de sol Potentiel activités enzymatiques extracellulaires

L’objectif général de cette procédure est de quantifier les taux potentiels maximaux auxquels les enzymes extracellulaires des sols dégradent leurs substrats cibles. Pour ce faire, il suffit d’abord de combiner un sol humide et un tampon dans un mélangeur, puis de pipeter les échantillons mélangés dans une plaque d’échantillonnage à puits profond et des plaques standard à puits profond. Les plaques de puits profonds sont incubées et centrifugées avant que 250 microlitres ne soient transférés de chaque puits des plaques de puits profonds vers les puits correspondants à fond plat noir.

Plaques à 96 puits. Les trois plaques sont ensuite rouges sur le fluorimètre et les données résultantes sont analysées. En fin de compte, les activités enzymatiques extracellulaires potentielles du sol sont déterminées par la vitesse à laquelle le colorant fluorescent est libéré du substrat par une réaction catalysée par une enzyme où une fluorescence plus élevée indique une plus grande dégradation du substrat.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est la possibilité de mesurer les activités enzymatiques dans un grand nombre d’échantillons en tirant parti du format de microplaque profonde à 96 puits. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons vu l’opportunité d’augmenter le volume d’échantillon par rapport aux microplaques standard en adaptant d’autres protocoles au format de la plaque à puits profonds. Les implications de cette technique nous permettent de mieux relier la physiologie microbienne aux processus à l’échelle de l’écosystème.

La démonstration visuelle est essentielle pour cette technique car il existe de nombreuses nuances et manipulations d’échantillons qui ne sont pas faciles à suivre dans une procédure écrite. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’écologie microbienne et de la biogéochimie des sols, telles que la façon dont les microbes du sol réagissent aux changements de leur environnement et comment leurs réponses physiologiques affectent-elles les processus écosystémiques critiques, tels que la décomposition et le cycle des nutriments. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la décomposition de la matière organique du sol, du cycle des nutriments et des écosystèmes terrestres, elle peut également être appliquée aux systèmes marins et d’eau douce.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés avec les compétences de pipetage et les problèmes de sensibilité au temps liés à ce protocole. De plus, la grande quantité de données générées dans cette procédure est parfois écrasante pour les nouveaux utilisateurs. Pour commencer la configuration du test, étiquetez trois plaques à puits profonds comme échantillon MUB standard pour quatre méthyles et beone et étalon MUC pour sept amino quatre méthyl coumarine.

Versez chaque étalon et substrat dans des réservoirs séparés et propres et pré-étiquetés orientés en rangées. Ensuite, pipetez l’étalon MUB approprié dans les puits correspondants de la plaque étalon MUB comme indiqué dans le protocole de texte. Répétez ce processus pour les étalons MUC dans les puits correspondants de la plaque standard MUC pour préparer les boues de sol.

Pour chaque échantillon de sol, pesez 2,75 grammes de sol humide avant de l’ajouter dans un mélangeur. Ajouter 91 millilitres, un tampon de 50 millimolaires, mélanger à puissance élevée pendant une minute. Versez le contenu du mélangeur dans un bol en verre propre au moins aussi large qu’une pipette à huit canaux avec une barre d’agitation.

La boue de sol peut être cuite à travers une passoire d’environ un millimètre avant d’être versée dans le bol. Placez le bol sur une plaque d’escalier et mélangez le lisier de terre. Ensuite, pipetez 800 microlitres de lisier de sol dans la première colonne de la plaque d’échantillon.

Faites de même pour la première colonne de l’étalon MUB et des plaques étalons MUC. Rincez le mélangeur, la plaque d’agitation et la barre d’agitation avec de l’eau déminéralisée ou un tampon entre les échantillons de sol. Répétez ce processus pour chaque échantillon de sol.

Passage à la colonne suivante avec chaque échantillon suivant. Ensuite, pipetez le substrat approprié dans les puits correspondants de la plaque d’échantillon. Comme indiqué dans le protocole textuel, préparer une plaque d’échantillonnage pour chaque température d’incubation à tester.

Scellez les plaques à puits profond avec des tapis de plaques. Retournez chaque plaque scellée à la main jusqu’à ce que la solution soit bien mélangée. Placez les plaques dans l’incubateur approprié pour la période d’incubation requise, telle qu’indiquée dans le protocole texte, enregistrez le temps initial comme temps zéro, ainsi que les temps d’incubation appropriés à la fin de chaque période d’incubation.

Centrifugez les plaques scellées pendant trois minutes à environ 2 900 G.Après transfert de centrifugation, 250 microlitres de chaque puits des plaques à puits profonds incubés dans les puits correspondants de plat noir. Fond 96 plaques de puits. Une plaque noire sera utilisée pour chaque plaque à puits profond incubée.

Il est important de transférer les échantillons des plaques de puits profonds incubées dans les puits correspondants dans le plat noir. Plaques inférieures à 96 puits suivant les instructions du fabricant pour le lecteur de plaques métriques Flora utilisé. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 365 nanomètres et la longueur d’onde d’émission à 450 nanomètres.

Chargez l’une des plaques standard, réglez le fluorimètre sur gain automatique et lisez la plaque. Réglez ensuite le gain sur manuel et diminuez la valeur de optimal au nombre le plus bas suivant arrondi au cinq le plus proche. Pour chaque plaque standard, répétez la mesure deux fois pour chaque plaque.

Ensuite, chargez la plaque d’échantillon. Réglez le gain sur automatique et exécutez la plaque d’échantillonnage. Réexécutez la plaque d’échantillonnage manuellement pour obtenir le gain le plus élevé pour chacune des plaques standard.

Commencez l’analyse des données en saisissant les données de fluorescence de la courbe standard dans une feuille de calcul pour la MUB et la norme MUC. Convertissez les concentrations micromolaires en micromoles pour chaque échantillon. Données de fluorescence de la courbe standard, calculer la pente y et les valeurs R au carré pour les concentrations standard MUB et MUC.

Les valeurs acceptables de r au carré doivent être supérieures à 0,98 pour chaque échantillon. Les courbes standard peuvent être visualisées dans un nuage de points avec les lectures de fluorescence tracées comme variable dépendante et la concentration standard tracée comme variable indépendante. Entrez l’échantillon et les données de fluorescence brutes du substrat dans une nouvelle feuille de calcul.

Incluez également le temps d’incubation et le poids sec du sol pour chaque échantillon, soustrayez les valeurs d’interception de la courbe standard des valeurs de fluorescence de l’échantillon correspondantes, puis divisez par la pente de la courbe standard correspondante. À l’aide de l’équation linéaire standard, multipliez les micromoles de l’échantillon par 91 millilitres, c’est-à-dire le volume tampon utilisé dans le lisier de sol. Divisez la valeur obtenue par le temps d’incubation spécifique de l’échantillon et la masse de sol sec.

Enfin, multipliez la valeur obtenue par 1000 pour obtenir les unités souhaitées. Les résultats d’une étude expérimentale sur le climat comparant des sols qui ont connu des conditions climatiques ambiantes à des sols qui ont été exposés à des traitements élevés de dioxyde de carbone et de chaleur. Dans cet exemple, les activités potentielles d’acquisition d’enzymes de carbone, d’azote et de phosphore à des profondeurs de sol de zéro à cinq centimètres ne différaient pas selon le traitement expérimental.

Cependant, à des profondeurs de sol de cinq à 15 centimètres, plusieurs EEE potentiels différaient considérablement. Par exemple, les enzymes dégradant le carbone bêta-un quatre glucocide et bêta D violoncelle biolace étaient plus faibles dans les parcelles de traitement à forte teneur en dioxyde de carbone et à chaleur par rapport aux parcelles de conditions climatiques ambiantes. À des profondeurs de sol de cinq à 15 centimètres.

Le calcul et le tracé de la somme de tous les cycles potentiels du carbone, de l’azote ou du phosphore dans les EEE peuvent être une approche utile pour observer des modèles plus larges concernant les cycles potentiels du carbone, de l’azote et/ou du phosphore dans le sol. Dans cet exemple, la somme des EEE potentiels de bêta un quatre glucco, de bêta D cello, de bio hydrolase, de bêta xlo et d’alpha un quatre glucco potentiels a été calculée pour représenter les activités potentielles du cycle du carbone. La somme de bêta-un, quatre, N-acétylglucose, de dase et de L-leucine amino peptidase a été calculée pour représenter les activités potentielles du cycle de l’azote.

La phosphatase a été utilisée pour représenter les activités potentielles du cycle du phosphore. Les EEE potentiels pour le cycle total du carbone, de l’azote et du phosphore ont eu tendance à baisser dans les parcelles de traitement du dioxyde de carbone et du chauffage élevées par rapport aux parcelles des conditions climatiques ambiantes à des profondeurs de sol de cinq à 15 centimètres. Cependant, cette tendance n’était significative que pour les activités de cycle total de l’azote et du phosphore, et les EEE du sol ne différaient pas significativement entre les placettes de traitement.

À une profondeur de sol de zéro à cinq centimètres. Les résultats suggèrent des tendances contrastées dans l’activité enzymatique, le groupe fonctionnel entre les parcelles de traitement en réponse à la profondeur du sol, le rapport des EEA potentiels est un moyen d’évaluer les besoins en nutriments microbiens. Ici, les enzymes du sol, la géométrie tochi, le carbone à l’azote, le carbone au phosphore ou l’azote au phosphore diffèrent considérablement entre les parcelles de traitement à des profondeurs de sol de zéro à cinq centimètres.

Cependant, les rapports enzymatiques carbone/phosphore et azote/phosphore potentiels étaient plus élevés dans les parcelles de traitement à forte teneur en dioxyde de carbone et en chauffage. Par rapport aux conditions climatiques ambiantes, à une profondeur de sol de cinq à 15 centimètres, la température peut fortement influencer les EEE du sol. Pourtant, dans les tests de laboratoire typiques, les enzymes du sol sont mesurées à une seule température qui peut ne pas correspondre à deux conditions de température C.

Les graphiques d’Aran sont utilisés pour visualiser l’énergie d’activation et sont tracés à l’aide du logarithme de l’activité enzymatique en fonction de la température inverse convertie en degrés kelvin sur l’axe des x. L’énergie d’activation est généralement définie comme l’énergie minimale requise pour catalyser une réaction chimique et est utilisée ici comme indicateur de la sensibilité à la température des réactions catalysées par des enzymes. Une énergie d’activation plus élevée indique une sensibilité à la température de l’enzyme.

De même, les énergies d’activation correspondent directement à Q 10. Les valeurs des coefficients de température et la cinétique enzymatique potentielle pour les EEA de carbone, d’azote et de phosphore ont été évaluées entre les deux placettes de traitement à deux profondeurs de sol, et les résultats ont démontré que la sensibilité à la température des EEA n’était pas significativement différente entre les placettes de traitement à l’une ou l’autre profondeur du sol. Une fois maîtrisés, 12 échantillons peuvent être inoculés dans les plaques de microtitration à 96 roues en 30 minutes ou moins.

De plus, après les temps d’incubation prescrits, vous pouvez généralement essorer, transférer et lire à nouveau les plaques sur l’uromètre dans la demi-heure qui suit. Il est important de pipeter régulièrement. Tout air dans le pipetage affectera négativement vos résultats Suite à cette procédure.

D’autres méthodes telles que l’extraction et le séquençage de l’ADN peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires liées au rôle de la composition de la communauté microbienne du sol dans la fonction du sol après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’écologie microbienne pour explorer le cycle des nutriments et les processus biogéochimiques dans les écosystèmes terrestres. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne idée de la façon de quantifier les activités enzymatiques potentielles.

De plus, vous devriez être en mesure d’interpréter les données pour refléter les réponses microbiennes potentielles à des facteurs tels que le climat et les différents types de sols au sein de différents écosystèmes. N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec des matériaux fluorescents, des précautions doivent toujours être prises pour minimiser l’exposition à la lumière en raison de la sensibilité à la lumière de la fraction fluorée.