Utilisation d' Galleria mellonella Comme un organisme modèle pour l'étude Legionella pneumophila Maladies infectieuses

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser les larves de la teigne de la cire Galleria melanoma pour analyser la pathogenèse de l’agent pathogène bactérien Legionella pneumophila. Pour commencer. Ceci est accompli en infectant les larves avec des souches de pneumophila par injection pendant les 72 heures suivantes.

L’induction de la mortalité larvaire est indiquée par une perte de mobilité et l’apparition d’une pigmentation noire : les larves sont sacrifiées pour leur hémolymphe à divers moments dans le temps. L’hémolymphe est ensuite plaquée pour énumérer les bactéries et visualiser les cellules d’insectes. En fin de compte, l’analyse de la croissance bactérienne et l’utilisation de la microscopie d’immunofluorescence permettent de mieux comprendre la niche intracellulaire des légionelles établie lors d’une infection in vivo et les différences de virulence entre les souches.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux modèles de souris et de culture cellulaire de légionelle est qu’elle est plus acceptable sur le plan éthique et qu’elle permet une analyse rapide et rentable d’un grand nombre de souches de légionelles dans un organisme multicellulaire, démontrant que la procédure sera claire. Harding, un étudiant au doctorat de mon laboratoire, travaille toujours avec L Pneumophila au niveau de confinement de biosécurité deux dans des enceintes de sécurité microbienne selon les règles locales, incubez d’abord les plaques bactériennes pendant quatre jours. Puis, un jour avant d’infecter les larves, Resus suspend une boucle pleine de bactéries contenant plusieurs colonies dans un millilitre de bouillon préchauffé, A YE et mesure l’absorbance des suspensions à 600 nanomètres.

Ensuite, inoculez une culture fraîche de trois millilitres à une OD 600 de 0,1. Incuber les cultures à 37 degrés Celsius sur un agitateur à 200 tr/min pendant 21 heures jusqu’à la phase post-exponentielle afin qu’elles puissent être utilisées pour l’infection. Mesurer l’absorbance des suspensions à 600 nanomètres.

Diluez ensuite la culture pour donner un milliard d’UFC par millilitre. Dans le DPBS, préparez un récipient pour les larves de mélanome G en plaçant un papier filtre circulaire de 10 centimètres au fond d’une boîte de Pétri de 10 centimètres à l’aide d’une pince à épiler à pointe émoussée. Placez 10 larves saines d’environ la même taille sur le papier filtre, jetez les insectes malsains de couleur brune ou tachetée.

Les larves saines sont uniformément de couleur crème, sans zones de décoloration foncée, et sont capables de s’écrire rapidement. S’il est retourné, préparez la plate-forme d’injection en collant du papier filtre sur une enceinte de sécurité. Collez ensuite un embout P 1000 sur le papier filtre.

Stérilisez maintenant une seringue de 20 microlitres en aspirant 70 % d’éthanol et en incubant la seringue dans 70 % d’éthanol pendant au moins 10 minutes. Retirez tout résidu d’éthanol de la seringue en aspirant et en expulsant plusieurs fois de l’eau stérile. Aspirez ensuite 10 microlitres de la suspension de pneumophile de 1 milliard d’UFC par millilitre.

Prenez une larve et doucement mais fermement. Allumez-le. Son dos est courbé sur la pointe du P 1000.

Placez l’extrémité de la seringue sur la patte avant droite des larves. Insérez ensuite délicatement la pointe de l’aiguille dans la jambe professionnelle. Assurez-vous que l’aiguille est à l’intérieur de la larve et en douceur.

Injectez tout le bolus de 10 microlitres. Si la seringue est correctement insérée, il devrait être possible de prélever les larves en utilisant uniquement la seringue et de les transférer dans la chambre. Injectez un total de 10 larves par condition et injectez 10 autres larves avec seulement du DPBS comme témoins.

Le processus d’injection est le plus difficile techniquement de la procédure et nécessitera de la pratique. Enfin, fermez la vaisselle avec du ruban adhésif et placez-la dans un confinement secondaire. Conservez-les à 37 degrés Celsius pendant toute la durée de l’expérience.

La mortalité doit être analysée à plusieurs points après l’infection. Pour examiner la mortalité des larves infectées, utilisez une pince à épiler à pointe émoussée pour retourner les larves et rechercher le mouvement des pattes. Les larves saines doivent s’écrire rapidement.

La pigmentation indique une forte réaction immunitaire à l’infection. S’il y a le moindre mouvement, comptez les larves comme vivantes à divers moments. Sélectionnez au hasard trois larves et placez-les dans un tube de 14 millilitres.

Mettez le tube sur de la glace pendant cinq à 10 minutes jusqu’à ce qu’aucun mouvement de jambe ne soit observé. Transférez ensuite les larves dans une boîte de Pétri. Utilisez maintenant un scalpel pour faire une incision entre deux segments près de la queue pour recueillir chaque hémolymphe de larve.

Gardez les incisions éloignées de l’intestin pour éviter la contamination par les bactéries intestinales. Pressez l’hémolymphe des larves dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 millilitre. Une seule larve donne entre 15 et 50 microlitres d’hémolymphe.

Maintenant, l’hémolymphe doit être utilisé dans les 10 minutes ou il coagulera pour déterminer la viabilité de l’insecte. Les cytes mélangent 20 microlitres de l’hémolymphe avec 20 microlitres de solution trian blue dans un puits d’une plaque de 96 puits chargée trois puits de cette façon. Incuber les réactions pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, pour chaque réaction, utilisez 10 microlitres pour compter les cellules non bleues viables à l’aide d’un hémocytomètre. Pour traiter les hémocytes pour la microscopie. Pipetez la collection d’hémolymphe sur une lamelle en verre de 10 à 15 millimètres dans une plaque à 24 puits.

Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de DPBS et mélangez bien l’hémolymphe avec une action douce. À l’aide d’un porte-plaque de centrifugeuse étanche aux aérosols, centrifugez la plaque pendant 10 minutes à 500 G à température ambiante. Ensuite, examinez chaque puits à l’aide d’un microscope inversé pour vérifier que les cytes ont adhéré.

Ensuite, retirez le surnageant et lavez soigneusement les cellules trois fois en ajoutant 0,5 millilitre de DPBS à la paroi du puits. Secouez la plaque plusieurs fois et aspirez le DPBS. Des détails sur la fixation et la coloration sont fournis dans le protocole textuel.

Pour quantifier les UFC bactériennes, procéder à des dilutions décuplées en série de l’hémolymphe dans des milieux stériles a YE. Ensuite, divisez la base d’une plaque CYE contenant de la mycine SPECT en six secteurs égaux. Plaquez trois gouttes de 25 microlitres de chaque dilution en commençant par la dilution la plus diluée dans chaque section de la plaque.

Incuber ces plaques et compter plus tard les colonies. Les larves de G melan étaient infectées par le type sauvage et déficientes en ICM. L’infection par 10 millions d’UFC de la souche un 30 B a entraîné une mortalité de 100 % dans les 24 heures.

Cependant, la souche delta A, qui n’a pas de système de sécrétion ICM T quatre SS fonctionnel, était virulente pour déterminer si l’absorption de la bactérie est cruciale dans sa pathogenèse. Dans ce modèle, les larves ont été prétraitées avec le cyto D, puis le traitement infecté avec l’inhibiteur seul n’a pas affecté la survie à 24 heures, cependant, les larves infectées prétraitées ont montré une survie significativement plus élevée par rapport aux témoins. Afin de valider l’expression et de déterminer la localisation subcellulaire d’une protéine effectrice dans g Melan Legionella exprimant un fragment de l’effecteur localisé LCV bien défini.

Les larves de CINÉTIQUE ont été sacrifiées à plusieurs moments après l’infection et l’UFC par gramme d’hémolymphe extraite a été déterminée après un plongeon initial à cinq heures, l’UFC des bactéries de type sauvage augmente. Cependant, la souche delta a ne subit aucune réplication et est éliminée au bout de 18 heures. Les cytes ont été extraits des insectes infectés et les cellules viables ont été comptées En utilisant la méthode d’exclusion du bleu trian cinq heures après l’infection, il n’y avait aucune différence.

Nombre d’incytes entre les souches. Cependant, au bout de 18 heures, il y avait une baisse significative de la concentration d’hémo chez les larves de type sauvage, mais pas chez les larves infectées par le delta A. Ce résultat in vivo suggère que L pneumophila se réplique à l’intérieur des cytes puis les couche.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter les larves, l’extrait, l’hémo, la lymphe et le processus. Il cyte pour analyser divers aspects de la pathogenèse de la légionelle.