Milliseconde conformationnels changements dans les protéines résolues par Photothermal déviation du faisceau

L’objectif global de l’expérience suivante est de caractériser les changements de confirmation associés à la liaison du ligand aux transducteurs calciques sur une échelle de temps inférieure à la milliseconde. La transition de confirmation entre la protéine APO et la protéine liée au calcium est déclenchée par le photoclivage d’un composé calcique en cage, le calcium DM nitro, qui conduit à la photolibération de calcium libre. La variation associée de l’indice de réflexion est mesurée comme un déplacement du faisceau de la sonde à l’aide d’un détecteur sensible à la position quadruple.

Ensuite, les traces de déviation du faisceau photothermique sont mesurées en fonction de la température de l’échantillon et de la référence. L’analyse composée des traces de déviation du faisceau photoélectrique donne un aperçu du mécanisme de commutation de confirmation induite par le calcium en termes de volume de réaction et de changements d’enthalpie. Le principal avantage de la déviation du faisceau photothermique sur le mât existant, comme l’écoulement supérieur, est que cette technique permet une détection simultanée des changements de volume et d’entropie sur une échelle de temps inférieure à la milliseconde.

La démonstration visuelle de cette technique est nécessaire car l’alignement précis de l’instrument est essentiel pour la récupération des paramètres thermodynamiques. Walter Gonzalez, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure, effectuera la préparation des échantillons et toutes les manipulations d’échantillons dans une pièce sombre pour éviter tout décantage indésirable. Dans cette vidéo, des marches sont montrées à la lumière à des fins de tournage.

Pour commencer, solubiliser DM Nitro en tas de 50 millimolaires tamponne 100 millimolaires de chlorure de potassium, pH 7,0 jusqu’à une concentration finale de 400 micromolaires. Ajouter du chlorure de calcium de la solution mère 0,1 molaire pour obtenir le rapport souhaitable entre la concentration de calcium et de DN nitro. Ensuite, solubilisez le composé de référence cyanure de potassium ou chromate de sodium dans le même tampon.

En ce qui concerne l’échantillon, reportez-vous au protocole textuel pour un schéma de la configuration expérimentale de base pour la déviation du faisceau photothermique. Lors de la mise en place de l’expérience, propagez le faisceau prob à travers le centre d’une cellule, placée dans un support de cellule à température contrôlée. Ensuite, à l’aide d’un sténopé, ajustez le diamètre du faisceau de la sonde à un millimètre, utilisez un deuxième miroir derrière l’échantillon pour centrer le faisceau de la sonde au centre du détecteur sensible à la position.

Focalisez le faisceau pro au centre du détecteur de sorte que la différence de tension entre les deux diodes supérieures et les deux diodes inférieures, ainsi que la différence de tension entre les deux diodes situées à gauche et à droite du détecteur soient nulles. Façonnez ensuite le diamètre du faisceau de la pompe, une sortie de 355 nanomètres d’un laser ND YAG. À l’aide d’un sténopé de trois millimètres placé entre des miroirs laser de 2 355 nanomètres, on peut propager le faisceau de la pompe à travers le centre du vété.

Il est important que les deux faisceaux laser se propagent à travers le centre de la cellule optique de manière presque colinéaire. Pour obtenir un angle de déviation mesurable et donc une amplitude élevée de déviation du faisceau photothermique ou de signal PBD, utilisez un composé de référence pour aligner la sonde et pompez le faisceau afin d’obtenir un signal PBD satisfaisant caractérisé par un bon rapport signal/bruit et une amplitude PBD stable sur des échelles de temps plus longues. Positionnez ensuite le faisceau de la pompe par rapport au faisceau de la sonde par réglage incrémentiel des miroirs laser de 355 nanomètres.

Mesurez l’amplitude du signal de référence PBD en tant que différence entre deux photodiodes supérieure et inférieure sur le détecteur sensible à la position. Le signal PBD doit présenter une augmentation rapide de l’amplitude sur une échelle de temps rapide et rester stable sur une échelle de temps de 100 millisecondes. Vérifiez la linéarité de l’amplitude du signal PBD par rapport à l’énergie thermique libérée en mesurant la dépendance linéaire du signal PBD sur la puissance du laser d’excitation et sur le nombre d’Einstein absorbés.

Maintenez la puissance laser en dessous d’environ 1000 microjoules pour éviter l’absorption de plusieurs photons. De plus, maintenez l’absorbance de l’échantillon ou du composé de référence à une longueur d’onde d’excitation inférieure à 0,5 pour éviter une diminution de la puissance du faisceau de la pompe. Ces étapes permettront d’assurer la linéarité du signal PBD.

Commencez par la mesure des traces PBD. Pour la référence, placez la solution du composé de référence dans une pile de quartz et positionnez la cellule dans le support à température contrôlée. Détectez le signal PBD de référence en fonction de la température dans la plage de température de 16 à 35 degrés Celsius avec un incrément de température de trois degrés Celsius.

À chaque changement de température. Vérifiez la position du faisceau de sondage sur le détecteur sensible à la position et réajustez la position au centre du détecteur. Si nécessaire, vérifiez la linéarité du signal PBD telle que décrite dans le protocole texte.

Placez ensuite la solution d’échantillon dans la même cellule optique que celle utilisée pour le composé de référence, en gardant la même orientation que la cellule optique pour la mesure de référence. Procédez à la détection des traces PBD de l’échantillon dans la même plage de température que pour la référence, et vérifiez la linéarité de l’amplitude PBD de l’échantillon. Prenez l’amplitude du signal PBD de référence comme la différence entre le signal PBD avant déclenchement et le signal PBD après déclenchement.

De la même manière, déterminez l’amplitude de la phase rapide et lente du signal PBD de l’échantillon. Pour éliminer le paramètre de réponse de l’instrument, mettez à l’échelle l’amplitude du signal PBD de l’échantillon en fonction de l’amplitude du signal PBD. Pour la référence, le rapport entre le signal d’échantillon et le signal de référence donne une équation à partir de laquelle le dégagement de chaleur dans la solution et la variation de volume non thermique associés à une réaction photo-initiée peuvent être déterminés à partir de la pente et de l’ordonnée à l’origine du graphique du rapport d’amplitude multiplié par l’énergie en fonction du terme dépendant de la température pour déterminer le volume de réaction et la variation d’enthalpie pour l’échelle de processus rapide et lente, Le volume et l’enthalpie observés changent jusqu’au rendement quantique approprié.

Selon les équations trouvées dans le protocole textuel, les amplitudes et les durées de vie des étapes individuelles sont analysées en ajustant les données à la fonction dépendante du temps qui décrit les changements de volume et d’enthalpie. L’amplitude de l’étape rapide correspond à l’amplitude de la phase d’invite du signal PBD de l’échantillon et l’amplitude de l’étape suivante correspond à l’amplitude de la phase lente du signal PBD de l’échantillon. Pour chaque processus individuel, à partir de la dépendance de la température de la constante de vitesse pour des processus individuels, les paramètres d’enthalpie d’activation et d’entropie peuvent être facilement déterminés à l’aide de tracés IR.

Un exemple représentatif de traces de PBD pour la photolibération de calcium à partir de calcium DM nitro est présenté ici. La phase rapide correspond au photoclivage du calcium DM nitro et à la libération de calcium, tandis que la phase lente reflète la liaison du calcium à la cage non photoisée. La trace PBD de l’association du calcium au domaine terminal C de l’antagoniste de l’élément régulateur neuronal du capteur de calcium neuronal, du régulateur ou du rêve est montrée ici lors de la photodissociation du calcium.

Le ligand de la photo publiée s’associe au domaine terminal C du rêve avec la constante de temps de 1,3 plus ou moins 0,3 millisecondes à 20 degrés Celsius de la dépendance de la température de la constante de vitesse observée. La barrière d’activation de la liaison du calcium au domaine C terminal du rêve a été déterminée à 9,2 plus ou moins 0,4 kilocalories par mole. Bien qu’il soit important de tenter cette procédure, il est important de ne pas oublier de mesurer les traces de PBD de l’échantillon dans des conditions identiques à celles de la référence.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de l’échantillon, de l’alignement de l’instrumentation et de l’analyse des données pour obtenir un paramètre thermodynamique reproductible.