Milliseconde conformationnels changements dans les protéines résolues par Photothermal déviation du faisceau

L'objectif général de l'expérience suivante est de caractériser les changements conformationnels associés à la liaison du ligand aux transducteurs calciques à l'échelle du sous-millisecond. La transition conformationnelle entre la protéine APO et la protéine liée au calcium est déclenchée par le clivage photochimique d'un composé de calcium piégé, le DM nitro de calcium, qui entraîne la libération photochimique de calcium libre. Le changement associé de l'indice de réflexion est mesuré comme un déplacement du faisceau sonde à l'aide d'un détecteur quadruple sensible à la position.

Ensuite, les tracés de déflexion du faisceau photothermique sont mesurés en fonction de la température pour l'échantillon et le témoin. Une analyse combinée des tracés de déflexion du faisceau lumineux fournit des informations sur le mécanisme du commutateur conformationnel induit par le calcium, en termes de variations de volume réactionnel et d'enthalpie. Le principal avantage de la déflexion du faisceau photothermique par rapport aux méthodes existantes, telles que le flux ascendant, est que cette technique permet une détection simultanée des variations de volume et d'entropie à une échelle de temps submilliseconde.

La démonstration visuelle de cette technique est nécessaire, car l'alignement précis de l'appareil est essentiel pour la récupération des paramètres thermodynamiques. La procédure sera réalisée par Walter Gonzalez, étudiant diplômé de mon laboratoire. Effectuez la préparation des échantillons et toutes les manipulations en chambre noire afin d'éviter tout démasquage indésirable. Dans cette vidéo, les étapes sont démontrées à la lumière pour des raisons de tournage.

Pour commencer, solubilisez le DM Nitro dans un tampon contenant 50 millimolaires de heaps et 100 millimolaires de chlorure de potassium, pH 7,0, jusqu'à une concentration finale de 400 micromolaires. Ajoutez du chlorure de calcium à partir de la solution mère 0,1 molaire afin d'obtenir le rapport désiré entre la concentration en calcium et celle en DN nitro. Ensuite, solubilisez le composé de référence, le cyanure de potassium ou le chromate de sodium, dans le même tampon.

Pour ce qui concerne l'échantillon, reportez-vous au protocole écrit pour un schéma de la configuration expérimentale de base utilisée en déflexion photothermique du faisceau. Lors de la mise en place de l'expérience, faites passer le faisceau sonde au centre d'une cellule placée dans un support de cellule thermostaté. Ensuite, à l’aide d’un diaphragme à sténopé, ajustez le diamètre du faisceau sonde à un millimètre, puis utilisez un second miroir placé derrière l’échantillon pour centrer le faisceau sonde sur le centre du détecteur sensible à la position.

Positionnez le faisceau pro au centre du détecteur de manière à ce que la différence de tension entre les deux photodiodes supérieures et les deux photodiodes inférieures, ainsi que la différence de tension entre les deux photodiodes situées respectivement à gauche et à droite du détecteur, soit nulle. Ensuite, mettez en forme le diamètre du faisceau de pompe, une sortie à 355 nanomètres d’un laser ND YAG. À l’aide d’un diaphragme de trois millimètres placé entre deux miroirs laser à 355 nanomètres, faites co-propager le faisceau de pompe au centre du vete.

Il est important que les deux faisceaux laser traversent le centre de la cellule optique de manière presque colinéaire. Pour obtenir un angle de déviation mesurable, et donc une amplitude élevée du signal de déviation photothermique ou PBD, utilisez un composé de référence afin d'aligner les faisceaux de sonde et de pompe pour obtenir un signal PBD satisfaisant, caractérisé par un bon rapport signal sur bruit et une amplitude PBD stable sur de longues périodes. Positionnez ensuite le faisceau de pompe par rapport au faisceau de sonde en ajustant progressivement les miroirs du laser de 355 nanomètres.

Mesurez l'amplitude du signal de référence PBD comme la différence entre les deux photodiodes supérieure et inférieure sur le détecteur sensible à la position. Le signal PBD doit présenter une augmentation rapide de l'amplitude à une échelle de temps courte et rester stable à l'échelle de temps de 100 millisecondes. Vérifiez la linéarité de l'amplitude du signal PBD par rapport à l'énergie thermique libérée en mesurant la dépendance linéaire du signal PBD par rapport à la puissance du laser d'excitation et au nombre d'Einstein absorbés.

Conservez la puissance du laser en dessous d'environ 1000 microjoules afin d'éviter l'absorption multiphotonique. De plus, maintenez l'absorbance de l'échantillon ou du composé de référence à une longueur d'onde d'excitation inférieure à 0,5 pour éviter une diminution de la puissance du faisceau pompe. Ces étapes garantiront la linéarité du signal PBD.

Commencez par la mesure des traces de PBD. Pour la référence, placez la solution du composé de référence dans une cuve en quartz et insérez la cuve dans le support thermostaté. Détectez le signal PBD de référence en fonction de la température dans la plage allant de 16 à 35 degrés Celsius, avec un incrément de température de trois degrés Celsius.

À chaque changement de température, vérifiez la position du faisceau de la sonde sur le détecteur sensible à la position et réajustez-la au centre du détecteur. Si nécessaire, vérifiez la linéarité du signal du détecteur sensible à la position conformément à la procédure décrite dans le protocole.

Placez ensuite la solution échantillon dans la même cellule optique que celle utilisée pour le composé de référence, en conservant la même orientation de la cellule optique par rapport à la mesure de référence. Procédez à la détection des traces PBD de l'échantillon dans la même plage de température que celle utilisée pour la référence, et vérifiez la linéarité de l'amplitude PBD de l'échantillon. Prenez l'amplitude du signal PBD de référence comme étant la différence entre le signal PBD avant le déclenchement et après le déclenchement.

De la même manière, déterminez l'amplitude de la phase rapide et de la phase lente du signal PBD de l'échantillon. Pour éliminer le paramètre de réponse de l'instrument, normalisez l'amplitude du signal PBD de l'échantillon par l'amplitude du signal PBD du témoin. Le rapport entre le signal de l'échantillon et le signal de référence fournit une équation à partir de laquelle le dégagement de chaleur dans la solution et la variation de volume non thermique associée à une réaction photo-induite peuvent être déterminés, à partir de la pente et de l'ordonnée à l'origine du tracé du rapport des amplitudes multiplié par l'énergie en fonction du terme dépendant de la température, afin de déterminer respectivement le volume de réaction et la variation d'enthalpie pour les processus rapide et lent. Enfin, rapportez les variations de volume et d'enthalpie observées au rendement quantique approprié.

Conformément aux équations figurant dans le protocole du texte, les amplitudes et durées de vie des étapes individuelles sont analysées en ajustant les données à la fonction dépendante du temps qui décrit les variations de volume et d'enthalpie. L'amplitude de l'étape rapide correspond à l'amplitude de la phase initiale du signal PBD de l'échantillon, et l'amplitude de l'étape suivante correspond à l'amplitude de la phase lente du signal PBD de l'échantillon. Pour chaque processus individuel, à partir de la dépendance en température de la constante de vitesse des processus individuels, les paramètres d'enthalpie et d'entropie d'activation peuvent être facilement déterminés à l'aide de diagrammes IR.

Un exemple représentatif de tracés PBD de la libération photo-induite de calcium à partir du nitro DM de calcium est montré ici. La phase rapide correspond au clivage photochimique du nitro DM de calcium et à la libération de calcium, tandis que la phase lente reflète la liaison du calcium à la cage non photo-dissociée. Le tracé PBD de l'association du calcium au domaine C-terminal du senseur neuronal du calcium, élément régulateur en aval, antagoniste du régulateur ou DREAM, est montré ici suite à la photodissociation du calcium.

Le ligand libéré par la photo s'associe au domaine C-terminal de DREAM avec une constante de temps de 1,3 ± 0,3 milliseconde à 20 degrés Celsius, déterminée à partir de la dépendance en température de la constante de vitesse observée. La barrière d'activation pour la fixation du calcium au domaine C-terminal de DREAM a été déterminée à 9,2 ± 0,4 kilocalories par mole. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de mesurer les tracés PBD de l'échantillon dans des conditions identiques à celles du témoin.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer un échantillon, aligner l'appareillage et analyser les données afin d'obtenir un paramètre thermodynamique reproductible.