Analyse vidéomorphométrique de la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des artères intra-pulmonaires à l’aide de tranches pulmonaires coupées de précision murine

L'objectif général de cette procédure est d'analyser la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des artères pulmonaires internes dont les diamètres internes varient de 20 à 100 microns. Cela est réalisé en remplissant d'abord les voies respiratoires des poumons avec du paraffine à bas point de fusion. La deuxième étape consiste à utiliser un vibrosectionneur pour découper les poumons isolés en tranches de 200 microns d'épaisseur.

Ensuite, les aros sont retirés des sections pulmonaires par incubation dans un milieu chaud à 37 degrés Celsius, saturé avec un gaz normoxique, de sorte que les sections se déplacent lentement dans le liquide. Puis une section pulmonaire individuelle est transférée dans une chambre de superfusion en flux continu, suivie d'une analyse morphométrique vidéo de la vasoréactivité de l'artère en coupe transversale.

En fin de compte, les modifications de la surface luminaire du vaisseau en réponse à différents traitements sont évaluées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie intravitale des microvaisseaux sous-pleuraux, est que la mesure de la tension vasculaire dans des artères pulmonaires proximales isolées permet une analyse quantitative de la réactivité des artères pulmonaires de diamètre compris entre 20 et 100 micromètres. La procédure sera démontrée par Anna Goldenberg et deux techniciens de ce laboratoire.

Immédiatement après avoir sacrifié une souris par dislocation cervicale, ouvrez la cavité abdominale, déplacez les anses intestinales sur le côté et sectionnez les gros vaisseaux abdominaux pour provoquer l'hémorragie. Ensuite, utilisez des ciseaux fins pour pénétrer le diaphragme. Cela provoque l'effondrement des poumons en raison de l'entrée d'air dans la cavité pleurale.

Continuer à découper pour détacher le diaphragme de l'ouverture thoracique inférieure. Découper maintenant les côtes et la clavicule latéralement. Pour retirer la partie ventrale de la cage thoracique, extraire le thymus.

Remplissez une seringue avec du tampon de perfusion tiède. Ensuite, faites un petit trou dans le ventricule gauche du cœur. Ajustez le débit de sortie du tampon de perfusion et perfusez lentement le réseau vasculaire pulmonaire par le biais du ventricule droit jusqu'à ce que les poumons apparaissent blancs.

Ensuite, retirez les glandes salivaires, les petits muscles et les tissus conjonctifs de la trachée. Détachez la trachée du tissu conjonctif environnant et insérez un morceau de coton à coudre entre l'œsophage et la trachée pour la ligature ultérieure. Puis, à l’aide de ciseaux microchirurgicaux, pratiquez une petite ouverture dans la partie supérieure de la trachée, entre deux cartilages trachéaux voisins.

Après avoir rempli une seringue avec de l'agarose à bas point de fusion, tiède à 37 degrés Celsius, reliez-la à une canule en plastique souple et poussez lentement le piston jusqu'à ce que l'air soit expulsé de la canule. Insérez la canule dans le petit trou de la trachée et fixez-la soigneusement en place à l'aide de fil de couture. Ensuite, remplissez lentement les voies respiratoires avec l'agarose et observez les poumons.

Au départ, le poumon droit commence à se dilater, suivi par le poumon gauche. Après 30 à 40 secondes, le remplissage est terminé et les deux poumons sont gonflés à un volume comparable à la situation in vivo, soit environ 1,2 à 2,0 millilitres. Selon le sexe, l'âge et le poids, il est important d'injecter rapidement la rose d'œuf afin qu'elle ne solidifie pas trop pendant la procédure, mais pas si rapidement que cela endommage les poumons.

Une fois les poumons remplis simultanément, retirer la canule en plastique et ligaturer la trachée avec du coton chirurgical afin d'éviter toute fuite de l'agros. Ensuite, sectionner la trachée au-dessus de la ligature et détacher l'ensemble cœur-poumons de la cage thoracique. Transférer les organes dans un tampon Ringer glacé afin de solidifier l'agros, ce qui se produit en quelques minutes pendant l'attente. Utiliser de la colle forte pour fixer un morceau de liège de champagne sur le porte-échantillon du vibrotrancheur, afin de servir de butée pour le tissu pulmonaire. Une fois l'agros solidifié, séparer les différents lobes pulmonaires.

Ensuite, fixez un lobe au porte-échantillon à l'aide d'une colle cyanoacrylate. Pour obtenir des coupes transversales des petites artères intra-asnéres, prenez le lobe crânial du poumon droit et collez-le au porte-échantillon par la surface du hile, puis, à l’aide d’un vibratome équipé d’une lame de rasoir neuve, effectuez des coupes depuis la périphérie afin de sectionner le lobe pulmonaire en tranches de 200 micromètres d'épaisseur. Pour obtenir des coupes transversales des artères pré-asnéres plus larges, alignez le hile du poumon gauche avec le bouchon de champagne et fixez le lobe dans cette orientation au porte-échantillon, puis effectuez des coupes depuis la périphérie pour enlever les aros.

Transférez les sections d'organe dans un bécher en verre rempli d'environ 200 millilitres de MEM à 37 degrés Celsius. Placez le bécher dans une enceinte chauffante et barbotez un gaz normoxique afin que les sections pulmonaires se déplacent lentement dans le milieu. Après environ deux heures, les plaques aéros remplissant les voies aériennes auront été éliminées du tissu pulmonaire et les sections se seront déposées au fond du bécher.

Pour l'analyse morphométrique par vidéo des artères intrapulmonaires, transférez une section de poumon dans une chambre de superfusion à écoulement, montée sur un microscope et remplie de 1,2 millilitre de MEM gazéifié normoxique. Fixez la section de poumon au fond de la chambre à l’aide de fils de nylon reliés à un anneau de platine. Commencez à perfuser la chambre avec le milieu gazéifié normoxique.

Utilisez un microscope à contraste de phase avec un objectif 10 x pour examiner la section pulmonaire à la recherche d'artères en coupe transversale dont les diamètres internes sont compris entre 20 et 100 microns. Une fois un vaisseau candidat raisonnable localisé, utilisez l'objectif 20 x pour prendre une image d'une artère pré-asnérale ou, comme illustré ici, l'objectif 40 x pour prendre une image d'une artère intra-asnérale afin de mesurer le diamètre interne du vaisseau. Avant de commencer l'expérience, configurez le logiciel pour prendre des images de l'artère en coupe transversale toutes les minutes pendant toute la durée de l'expérience.

Après avoir déclenché la prise de photographies, poursuivre la perfusion de la chambre avec le milieu gazeux normoxique pendant 10 minutes. Ensuite, immerger la section pulmonaire dans l'U 466 19 pendant 10 minutes sans flux, afin d'analyser la contractilité de l'artère, en utilisant uniquement les vaisseaux dont la surface luminaire a été réduite d'au moins 30 % par l'U 466 19. Éliminer le médicament par lavage avec le milieu gazeux normoxique pendant 10 minutes.

Ensuite, dilater l'artère par application de res pendant 10 minutes sans flux faible. Retirer à nouveau le médicament par un lavage de 10 minutes avec un milieu gazéifié normoxique à un débit de six millilitres par minute, suivi de 10 minutes à un débit de 0,7 millilitre par minute. Puis, incuber la coupe de poumon avec un milieu gazéifié fortement hypoxique pendant 40 minutes.

Faites également circuler le mélange gazeux hypoxique dans l'espace aérien de la chambre de perfusion via un jeu supplémentaire de tubulures. Éliminez le milieu hypoxique par un lavage de 20 minutes avec un milieu gazéifié normoxique et passez du flux gazeux hypoxique au flux gazeux normoxique dans l'espace aérien de la chambre afin de vérifier la viabilité du vaisseau. À la fin de l'expérience, ajoutez U 466 19 dans la chambre de perfusion et incubez pendant 20 minutes sans flux pour induire une vasoconstriction.

Répétez ces étapes avec une nouvelle section pulmonaire pour mesurer la réactivité vasculaire d'un autre vaisseau. Commencez l'analyse en chargeant les images des artères en coupe transversale dans un logiciel d'analyse d'image. Utilisez ensuite un curseur pour délimiter la surface luminaire du vaisseau.

Le séchage des mains est nécessaire car il évite les artefacts dus, par exemple, aux cellules sanguines attachées à la paroi vasculaire. Poursuivez l'analyse des images en coupe de manière similaire. Chaque image doit être analysée lorsque l'on modifie une condition dans la chambre d'incubation en flux, mais analyser une image sur deux suffit lorsque les conditions ne changent pas.

La vasoconstriction pulmonaire hypoxique est observable sur ces images en contraste de phase d'une artère pré-ASIN en coupe transversale, qui longe une bronche en coupe transversale. Les images ont été prises aux points temporels indiqués par des cercles sur le graphique : au début de la mesure, à la fin de la mesure avec U 466 19, à la fin de l'exposition aux RAs après 30 ou 40 minutes dans un milieu gazéifié en conditions hypoxiques, après lavage avec un milieu gazéifié en conditions normoxiques, puis après l'application finale d'U 466 19. La réactivité vasculaire est enregistrée sous forme de variations relatives de la surface luminaire de l'artère en coupe transversale en fonction du temps. La surface au début de l'expérience est définie comme 100 %, et la vasoconstriction est exprimée en valeurs relatives par rapport à la surface initiale.

Dans ce cas, l'exposition à l'hypoxie induit une réduction de 60 % de la surface luminaire afin de mieux illustrer la réponse hypoxique. La phase initiale de l'expérience, au cours de laquelle la réactivité vasculaire a été testée, n'est pas représentée ici, et la valeur obtenue juste avant l'exposition à l'oxygène réduit est fixée à 100 %. L'autre type de vaisseaux examinés dans ces études est constitué des artères intra-ASIN, situées au niveau des renforts des septa alvéolaires. Dans cette série d'expériences, l'impact de la sidal, un ouvreur non sélectif des canaux potassiques sensibles à l'ATP mitochondriaux, sur la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des petites artères intra-asnaires est analysé à cet effet.

Les tranches sont incubées dans un milieu hypoxique. En l'absence ou en présence de 50 micromolaire de sidal, des incubations témoins sont réalisées dans un milieu gazeux normoxique afin de mieux présenter la réponse à la normoxie, à l'hypoxie ou à l'hypoxie combinée au sidal. Les valeurs obtenues immédiatement avant l'exposition au milieu gazeux normoxique ou hypoxique sont fixées à 100 %. L'artère exposée au pineal ne présente pas de diminution de la surface, contrairement à l'artère incubée dans un milieu hypoxique sans additifs.

Dans un milieu normoxique, aucune modification de la surface luminaire n'est détectable. Les enregistrements d'artères intra-ASIN de petit calibre exposées à un milieu gastrique hypoxique avec ou sans 50 micromolaire de sidal sont présentés comme des moyennes ± SEM. Sur ce graphique, les données relatives par rapport à la valeur au début de l'incubation hypoxique sont indiquées.

Aucune réactivité vasculaire n'est détectable. Dans les tranches de poumon exposées à un gaz hypoxique, le rétrécissement vasculaire induit par l'U 466 19 dans le milieu contenant de la pinéale n'est pas modifié par le médicament. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de tranches de poumon de précision, de la manière de les découper, et de leur utilisation pour la mesure quantitative de la réactivité vasculaire des petites artères intra-alvéolaires dont les diamètres varient entre 20 et 40 micromètres, situées au niveau des cloisons alvéolaires, ainsi que des artères pré-alvéolaires plus larges dont les diamètres se situent entre 40 et 100 micromètres, qui longent les bronches et les bronchioles.