Analyse vidéomorphométrique de la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des artères intra-pulmonaires à l’aide de tranches pulmonaires coupées de précision murine

L’objectif global de cette procédure est d’analyser la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des artères intra-pulmonaires de diamètres intérieurs de 20 à 100 microns. Ceci est accompli en remplissant d’abord les voies respiratoires des poumons avec des aros à bas point de fusion. La deuxième étape consiste à utiliser un vibromasseur pour couper les poumons isolés en tranches de 200 microns d’épaisseur.

Ensuite, l’aros est retiré des sections pulmonaires par incubation à 37 degrés Celsius, un milieu chaud, qui est rempli de gaz normoxique. Ainsi, les sections se déplacent lentement dans le fluide. Ensuite, une section pulmonaire individuelle est transférée dans une chambre de superfusion, suivie d’une analyse morphométrique vidéo de la réactivité vaso de l’artère sectionnelle.

En fin de compte, les changements dans la zone luminale du vaisseau en réponse à différents traitements sont évalués. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie intra vitale des micro vaisseaux sous-pleuraux, sont la mesure de la tension vasculaire dans les artères pulmonaires proximales isolées est qu’elle permet l’analyse quantitative de la réactivité VA des artères intra pulmonaires de diamètres compris entre 20 et 100 micromètres. Anna Goldenberg et deux techniciens de ce laboratoire feront la démonstration de la procédure.

Immédiatement après avoir tué une souris par luxation cervicale, ouvrez la cavité abdominale, écartez les anses intestinales et sectionnez les gros vaisseaux abdominaux pour le saignement. Ensuite, utilisez des ciseaux fins pour pénétrer dans le diaphragme. Cela provoque l’affaissement des poumons à la suite de l’entrée d’air dans la cavité pleurale.

Continuez à couper pour détacher le diaphragme de l’ouverture thoracique inférieure. Coupez maintenant les côtes et la clavicule latéralement. Pour retirer la partie ventrale de la cage thoracique, retirez le thymus.

Remplissez une seringue avec un tampon de perfusion chaud. Ensuite, faites un petit trou dans le ventricule gauche du cœur. Ajustez l’écoulement du tampon de perfusion et perfuser lentement le système vasculaire pulmonaire via le ventricule droit jusqu’à ce que les poumons apparaissent blancs.

Ensuite, retirez les glandes salivaires, les petits muscles et le tissu conjonctif de la trachée. Déconnectez la trachée du tissu conjonctif environnant et insérez un morceau de coton à coudre entre l’œsophage et la trachée pour une ligature ultérieure. Ensuite, à l’aide d’un micro ciseaux, découpez un petit trou dans la partie supérieure de la trachée entre deux cartilages trachéaux voisins.

Après avoir rempli une seringue à 37 degrés Celsius, réchauffez-la et à faible point de fusion, connectez-la à une canule en plastique flexible et enfoncez lentement le piston jusqu’à ce que l’air soit évacué de la canule. Insérez la canule dans le petit trou de la trachée et ancrez-la soigneusement en place avec du coton à coudre. Ensuite, remplissez lentement les voies respiratoires avec les aros et observez les poumons.

Au début, le poumon droit commence à se dilater, suivi du poumon gauche. Après 30 à 40 secondes, le remplissage est terminé et les deux poumons sont gonflés à un volume comparable à la situation in vivo, qui est d’environ 1,2 à 2,0 millilitres. Selon le sexe, l’âge et le poids, il est important d’injecter l’œuf rose suffisamment rapidement pour qu’il ne se solidifie pas au cours de la procédure, mais pas trop rapidement pour n’endommager les poumons.

Une fois les poumons remplis simultanément, retirez la canule en plastique et ligaturez la trachée avec le coton à coudre pour éviter les fuites de l’aros. Ensuite, coupez la trachée au-dessus de la ligature et pour détacher les poumons et le cœur sur bloc de la poitrine, transférez les organes dans des tas de glace pour solidifier l’agros, ce qui se produit en quelques minutes pendant l’attente. Utilisez de la super colle pour fixer un morceau de bouchon de champagne au porte-échantillon du vibromasseur afin d’agir comme une oblique vers l’arrière pour le tissu pulmonaire Une fois l’agros solidifié, séparez les lobes pulmonaires individuels.

Ensuite, super colle, un lobe sur le porte-échantillon. Pour obtenir des coupes transversales des petites artères intra-asner, prenez le lobe crânien du poumon droit et super-collez-le avec la surface du hile sur le support, à l’aide d’un vibrato équipé d’une lame de rasoir fraîche coupée de la périphérie, en coupant le lobe pulmonaire en tranches de 200 microns d’épaisseur. Pour obtenir des coupes transversales des artères pré aser plus grandes, alignez le hile du poumon gauche avec le bouchon de champagne et collez le lobe dans cette orientation sur le support, puis coupez à partir de la périphérie pour enlever les aros.

Transférez les sections d’orgue dans un bécher en verre rempli d’environ 200 millilitres à 37 degrés Celsius. MEM place le bécher dans une armoire chauffante et fait des bulles de gaz normoxique de sorte que les sections pulmonaires se déplacent lentement dans le milieu. Après environ deux heures, les plaques aros remplissant l’air auront été retirées du tissu pulmonaire et les sections se seront déposées au fond du bécher.

Pour l’analyse morphométrique vidéo des artères intra-pulmonaires, transférez une section pulmonaire dans la chambre d’écoulement à travers la chambre de superfusion, qui est montée sur un microscope et remplie de 1,2 millilitre de gaz normoxique. MEM. Fixez la section pulmonaire au fond de la chambre avec des cordes en nylon reliées à un anneau en platine. Commencez à perfuser la chambre avec un milieu gazé normoxique.

À l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un objectif 10 x, on peut scanner la section pulmonaire à la recherche d’artères sectionnées d’un diamètre intérieur compris entre 20 et 100 microns. Une fois qu’un vaisseau candidat raisonnable est localisé, utilisez l’objectif 20 x pour prendre une photo d’un vaisseau pré-asner ou, comme indiqué ici, l’objectif 40 x pour prendre une photo d’une artère intra-asner pour mesurer le diamètre interne du vaisseau. Avant de commencer l’expérience, configurez le logiciel pour qu’il prenne des photos de l’artère sectionnée toutes les minutes pendant toute la durée de l’expérience.

Après avoir déclenché la photographie, continuez la perfusion de la chambre avec du gaz normoxique pendant 10 minutes. Ensuite, baignez la section pulmonaire dans U 466 19 pendant 10 minutes sans écoulement pour analyser la contractilité de l’artère en utilisant uniquement des vaisseaux dont les zones luminales ont été réduites d’au moins 30 %Avec l’U 466 19. Lavez le médicament avec un milieu gast normoxique pendant 10 minutes.

Dilater ensuite l’artère par application de res pendant 10 minutes sans débit faible. Encore une fois, retirez le médicament avec un lavage de 10 minutes avec un milieu gazeux normoxique à un débit de six millilitres par minute, suivi de 10 minutes à un débit de 0,7 millilitres par minute. Ensuite, incubez la tranche pulmonaire avec un milieu gazeux à forte hypoxie pendant 40 minutes.

Diffusez également le mélange de gaz hypoxique dans l’espace d’air de la chambre de perfusion via un jeu supplémentaire de tubulures. Retirez le milieu hypoxique avec un lavage de 20 minutes avec un milieu gazeux normoxique et passez d’un flux de gaz hypoxique à un flux de gaz normoxique dans l’espace d’air de la chambre pour vérifier la viabilité du récipient. À la fin de l’expérience, appliquer l’U 466 19 dans la chambre de perfusion et incuber pendant 20 minutes sans écoulement pour induire une vasoconstriction.

Répétez ces étapes avec une nouvelle section pulmonaire pour mesurer la réactivité vaso d’un autre vaisseau. Commencez l’analyse en chargeant les images des artères sectionnées dans un programme d’analyse d’images. Utilisez ensuite un curseur pour délimiter la zone lumineuse du récipient.

Le séchage des mains est nécessaire car il permet d’éviter les artefacts dus, par exemple, aux cellules sanguines attachées à la paroi vasculaire. Continuez à analyser les images en coupe transversale de la même manière. Chaque image doit être analysée lorsqu’une condition dans la chambre d’incubation est remplacée par une autre, mais l’analyse de chaque autre image est suffisante lorsque les conditions ne changent pas.

Une vasoconstriction pulmonaire hypoxique est observable dans ces images en contraste de phase d’une artère pré-ASIN en coupe transversale, qui passe à proximité d’une bronche en coupe transversale. Les images sont prises à des points temporels indiqués par des cercles dans le graphique au début de la mesure à la fin de la mesure avec U 466 19 à la fin de l’exposition aux AR après 30 ou 40 minutes dans un milieu gazeux hypoxique après lavage avec un milieu gazé normoxique, et après l’application finale de U 466 19 la réactivité vaso est enregistrée comme des changements relatifs de la surface luminale de la section transversale artère contre le temps. L’aire au début de l’expérience est définie à 100 % et la vasoconstriction est donnée sous forme de valeurs par rapport à l’aire initiale.

Dans ce cas, l’exposition à l’hypoxie induit une réduction de 60 % de la surface luminale pour une présentation plus claire de la réponse hypoxique. La phase initiale de l’expérience dans laquelle la réactivité vasale a été testée n’est pas montrée ici, et la valeur obtenue immédiatement avant l’exposition à l’oxygène réduit est fixée à 100 %Les autres types de vaisseaux examinés dans ces études sont les artères intra-ASIN, qui sont situées au niveau des goussets des septa alvéolaires. Dans cette série d’expériences, l’impact de sidal, un ouvreur non sélectif des canaux potassiques mitochondriaux sensibles à l’A TP sur la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des petites artères intra-asner est analysé à cette fin.

Les tranches sont incubées en milieu hypoxique. En l’absence ou en présence de 50 micromolaires sidals, des incubations sont réalisées en milieu gast normoxique pour une présentation plus claire de la réponse à la normoxie ou à l’hypoxie ou à l’hypoxie plus sidal. Les valeurs obtenues immédiatement avant l’exposition au milieu gast normoxique ou hypoxique sont fixées à 100 %L’artère exposée à la glande pinéale ne présente pas de diminution de surface, tout comme l’artère incubée en milieu hypoxique sans additifs.

En milieu normoxique, aucun changement dans la zone luminale n’est détectable. Les enregistrements de petites artères intra ASIN exposées à un milieu gast hypoxique avec ou sans 50 micromolaires sidals sont présentés sous forme de moyennes plus ou moins SEM. Dans ce graphique, les données relatives par rapport à la valeur au début de l’incubation hypoxique sont présentées.

Aucune réactivité vaso n’est détectable. Dans les coupes pulmonaires exposées au gast hypoxique, le milieu contenant la vasoconstriction pinéale induite par l’U 466 19 n’est pas affecté par le médicament. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des coupes pulmonaires de précision miroir, et comment les utiliser pour la mesure quantitative de la réactivité VA de petites artères intra asina de diamètres compris entre 20 et 40 micromètres, qui sont situées au gaz des septa alvéolaires, et des artères pré Athéna plus grandes avec des diamètres compris entre 40 et 100 micromètres, qui longent Bronchi et Bronchioli.