Agroinfiltration et PVX Agroinfection dans la pomme de terre et Nicotiana benthamiana

L’objectif général de l’expérience suivante est de vérifier si les effecteurs d’agents pathogènes sont reconnus par des protéines résistantes chez les plantes. Ceci est réalisé en infectant d’abord les feuilles de la plante avec une culture liquide d’agrobacterium ou par une infection par PVX agro, qui exprimera transitoirement des effecteurs dans le tissu végétal. Ensuite, les plantes sont laissées incuber et les plantes sont marquées pour la mort cellulaire.

On obtient des résultats qui montrent des réponses de mort cellulaire lors de la reconnaissance de transfuges exprimés transitoirement par des protéines de résistance chez les plantes. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes telles que les études génétiques avec des marqueurs moléculaires est qu’il s’agit de tests fonctionnels. Ils montrent non seulement que le gène de résistance est présent dans la plante, mais aussi qu’il fonctionne et que les réponses de défense sont activement induites.

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés en pathologie moléculaire des plantes, telles que la découverte rapide de la résistance des bots et des gènes AFI de l’AR et des criminels, dont la disponibilité des deux séquences génomiques La démonstration de la procédure sera effectuée par du, un doctorant d’un laboratoire Pour générer des plants de pomme de terre. Conservez les plantules in vitro dans des bocaux en plastique stériles contenant plus de milieu shige, scoog ou MS dans des chambres climatiques à 18 degrés Celsius avec un régime de 16 heures, huit heures de jour et de nuit pendant deux semaines. Lorsque les plantes poussent, les racines blanches les transfèrent dans des pots de terre stérilisée.

Dans les compartiments de serre réglementés, pour les plantes utilisées dans ces expériences, utilisez des graines de quatre à cinq semaines cultivées NCOA hamana et des plants de pommes de terre de quatre à cinq semaines générés in vitro. Pour préparer la culture d’agrobactéries, commencez par remplir des tubes de 50 millilitres avec 10 millilitres de milieu YEB, complété par un microlitre d’acétophénone, 100 microlitres de MES et les antibiotiques appropriés. Ensuite, pipetez 20 microlitres de stock de glycérol des souches souhaitées d’agrobacterium contenant le gène d’intérêt dans le YEB.

Incuber les cultures à 28 degrés Celsius et 200 RPM pendant un à deux jours jusqu’à une OD 600 d’environ 1,0. Récoltez les cellules par centrifugation à 3000 GS pendant 10 minutes. Versez ensuite le supernat et remettez la pastille en suspension.

En MMA moyen fraîchement préparé à un OD 600 de 0,3. Vortex doucement les cellules pour les ressusciter, les suspendre pour la co-infiltration de deux souches bactériennes. Mélangez la culture dans un rapport de un pour un.

Laissez les cultures reposer à température ambiante pendant une à six heures avant d’infiltrer les plantes. Entre-temps, étiquetez les plantes à infiltrer avec la souche et la date de l’expérience pour effectuer les infiltrations en portant une protection oculaire. À l’aide d’une seringue d’un millilitre sans aiguille, injectez soigneusement et lentement des suspensions d’agrobacterium dans les panneaux de feuilles.

Injectez au moins trois plants et trois feuilles par plant pour servir de triples afin d’éviter les contaminations croisées. Changez ou stérilisez les gants entre les infiltrations et évitez d’arroser les plantes jusqu’au lendemain. L’inoculation environ trois jours après l’infiltration permet d’évaluer la mort cellulaire des plantes sur une échelle de zéro à 100 %, zéro ne représentant aucun symptôme.

100 %indiquant la mort cellulaire de confluence et des valeurs intermédiaires allant de la sclérose à des niveaux croissants de mort cellulaire. Réaliser l’agro-infection PVX chez les plantes âgées de deux à trois semaines et les plantes cultivées en graines de hamana et les plants de pommes de terre de deux à trois semaines cultivés in vitro à trois millilitres de YEB complétés par des antibiotiques. Ajouter 20 microlitres de stock de glycérol d’agrobacterium incuber à 28 degrés Celsius et 200 RPM à un OD 600 d’environ 1,0.

Étalez environ 300 microlitres de chaque souche d’agrobacterium sur des plaques de gélose LB avec des antibiotiques et incubez à 28 degrés Celsius pendant un à deux jours. À l’aide d’une spatule, prélevez l’agrobactérie. Ensuite, inoculer une feuille avec une grande quantité de bactéries.

Trempez un cure-dent dans la culture et utilisez-le pour percer la plante. Feuille inoculer chaque feuille à plusieurs endroits à travers les feuilles par plante et trois plantes par souche. Deux semaines après l’inoculation, notez macroscopiquement en enregistrant qualitativement chaque tache comme un oui ou un non.

Calculez ensuite le pourcentage de sites répondants et comparez-le aux contrôles présentés. Voici les résultats représentatifs de l’agro-infiltration chez l’hamana final et deux espèces de pommes de terre, Solenium JI 3 49 dash trois et CV Desiree environ trois jours après l’inoculation. Il y a une mort cellulaire de confluence dans le panneau foliaire co-infiltré avec le mélange de la souche d’agrobactérie AGL un PVRG contenant P bin plus R trois A et PK sept WG deux A VR trois A tandis qu’aucune réponse de mort ne se produit avec le témoin négatif PI plus R trois A ou PK sept WG deux A VR trois A dans cette figure PVX agro-infection de n et deux espèces de pomme de terre S un Kae 3 54 dash one et S micro DOUM 360 dash one sont montrés environ deux semaines après l’inoculation.

Il y a une expansion de la mort cellulaire sur les sites inoculés avec le contrôle positif PGR 1 0 6 CRN deux. Celui-ci code pour un gène général induisant la mort cellulaire de Phytophthora Infest, et PGR 1, 0, 6, pour un gène qui code pour un gène illicite de P Infest. Aucune mort cellulaire en expansion n’est observée sur le site inoculé avec le témoin négatif PGR 1 0 6 puits vide.

Il est important de ne pas oublier de cultiver du matériel végétal de bonne qualité. Cette technique a ouvert la voie à l’exploration des effets omiques chez la pomme de terre et d’autres espèces végétales pour les chercheurs en pathologie moléculaire des plantes et en sélection végétale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse fonctionnelle efficace et robuste à haut débit du gène de la boîte chez les plantes.