Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les gouttelettes lipidiques à partir de tissu. Cela est réalisé en premier lieu par la dissection et la séparation du tissu placentaire. Ensuite, les cellules de l'oléine sont homogénéisées.

Ensuite, les organites sont séparés par plusieurs étapes de centrifugation. Enfin, la couche flottante contenant les gouttelettes lipidiques est recueillie et les gouttes lipidiques sont caractérisées. En dernier lieu, la microscopie de fluorescence et l'analyse western blot sont utilisées pour démontrer la pureté de la fraction de gouttelettes lipidiques.

Le principal avantage de cette technique est qu'il est possible d'isoler des gouttelettes lipidiques à partir de la plupart des cellules aortiques. Notez que dans certains tissus, le nombre de gouttelettes peut être inférieur à celui réduisant la couche flottante G et le nombre de gouttelettes. Les placentas ont été recueillis auprès de femmes en bonne santé ayant des grossesses uniques et subissant une césarienne programmée avant le début du travail spontané à terme ; les sujets ont donné leur consentement éclairé par écrit pour la collecte de leur placenta.

La collecte et l'utilisation ultérieure de placentas ont été effectuées avec l'approbation de l'Université du Tennessee et de l'École supérieure de médecine de l'Université du Tennessee à Knoxville. Dans la hotte de sécurité biologique, transférez le placenta dans un récipient stérile autoclavable et rincez soigneusement le sang du placenta et des membranes à l'aide de sérum physiologique stérile. Jetez le sérum physiologique ensanglanté dans un bécher d'un litre en tant que déchet biologique liquide.

Placez le placenta sur un champ stérile, la surface lisse portant le cordon ombilical orientée vers le haut, à l’aide de ciseaux fins à pointe acérée et de forceps. Retirez le cordon ombilical et les membranes fœtales. Ensuite, retournez le placenta afin que la surface maternelle soit orientée vers le haut.

Ensuite, retirez le tissu de la plaque basale située au-dessus à environ trois millimètres de la surface. Disséquez un COTA à la fois, en évitant la plaque choriale, et recueillez le tissu villositaire dans un bécher de 250 millilitres contenant du sérum physiologique. Utilisez ensuite du sérum physiologique stérile à 0,9 % et une pince pour rincer le tissu plusieurs fois dans un bécher séparé en agitant, en utilisant le bécher d'un litre pour les déchets liquides.

Transférez un fragment de codéine à la fois dans une boîte de Pétri de 150 millimètres. Tenez-le avec des pinces et utilisez une lame de rasoir pour gratter le tissu des vaisseaux sur une boîte de Pétri. Placez le tissu prélevé dans un bécher séparé contenant du sérum physiologique stérile à 0,9 %.

Répétez pour tous les morceaux de tissu. Après avoir rincé le tissu prélevé dans le cve de dissociation cellulaire, éliminez le liquide excédentaire et pesez-le pour digérer le tissu placentaire. Après avoir préparé le mélange de digestion du tissu, divisez le tissu en transférant 60 grammes du tissu total collecté dans un flacon stérile de Helen Meyer de 500 millilitres.

Ajouter le mélange de digestion des tissus au flacon contenant le tissu et incuber à 37 degrés Celsius dans un agitateur pendant 45 minutes. À 150 tr/min, récupérer les cellules dissociées après l'incubation en inclinant le flacon pour permettre au tissu de se déposer. Récupérer le surnageant.

Veiller à ne pas prélever de tissu UND dissocié. Ajouter une quantité égale d'HBSS au surnageant avant de le transférer dans des tubes de centrifugation stériles de 15 millilitres. Répéter la dissociation et la collecte du surnageant avec les portions restantes de tissu associé à UND pour chaque lot, après centrifugation à 1000 fois.

Centrifuger pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis aspirer le surnageant sans perturber le culot. Les cellules des villosités placentaires se trouvent principalement dans la partie blanche du culot, située au-dessus des globules rouges. Transférer les cellules des villosités présentes dans la partie blanche du culot dans un tube conique stérile de 50 millilitres et maintenir sur glace.

Après avoir récupéré les cellules issues des trois stades de digestion, utilisez un filtre cellulaire en nylon de 100 microns inséré dans l'embouchure d'un tube conique stérile de 50 millilitres pour filtrer la suspension. Si la filtration de la suspension cellulaire ralentit, soulevez légèrement le filtre vers le haut afin de créer un vide dans le tube, puis centrifugez à quatre degrés Celsius et à 1000 fois la gravité pendant 10 minutes. Retirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot, puis homogénéisez les cellules des villosités placentaires dans un flux laminaire en utilisant un milieu de lyse hypotonique fraîchement préparé, ou HLM ; ajoutez un volume de HLM quatre fois supérieur au volume du culot cellulaire, préalablement refroidi sur glace.

Utilisez une pipette de 10 millilitres pour resuspendre doucement et complètement. Suspendez les cellules en aspirant et en expulsant plusieurs fois à l’aide de la pipette. Après avoir incubé les cellules sur de la glace pendant 10 minutes, transférez-les dans un homogénéisateur glacé et homogénéisez lentement les cellules à l’aide du piston ajusté lâche en effectuant 20 à 25 mouvements doux.

Faire centrifuger le lysat à 3000 ×g et à 4 °C pendant 10 minutes afin d'éliminer les cellules non rompues. Ensuite, récupérer le surnageant dans un nouveau tube avant de le centrifuger à nouveau à 25 000 ×g et à 4 °C pendant 20 minutes. Pour éliminer les mitochondries et isoler les gouttelettes lipidiques par ultracentrifugation, récupérer le surnageant dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres.

Régler à 20 % de saccharose et transférer au fond d'un tube d'ultracentrifugation pour rotor S SW 28 ou équivalent. Recouvrir le surnageant ajusté en densité d'environ 10 millilitres de tampon de carbonate de sodium 100 millimolaire glacé et de 0,5 à 1 millilitre de HLM glacé pour remplir le tube. Centrifuger à l'aide d'un rotor à godets oscillants S SW 28 à 130 000 × g et à 4 °C pendant 45 minutes. Puis récupérer la couche flottante, régler à 10 % de saccharose et la transférer au fond d'un tube d'ultracentrifugation de 13,2 millilitres pour rotor SW 41 TI ou équivalent. Recouvrir le surnageant ajusté en densité d'environ 5 millilitres de tampon de carbonate de sodium 100 millimolaire glacé et de 0,5 millilitre de HLM glacé. Procéder à une centrifugation à 274 000 × g et à 4 °C pendant 60 minutes. Dans un rotor SW 41 TI, utiliser une pipette de 1 millilitre pour prélever soigneusement la couche supérieure flottante contenant les gouttelettes lipidiques.

Régler le volume à 10 % de saccharose, puis transférer à nouveau dans un tube d'ultracentrifugation de 13,2 millilitres avant de recouvrir de cinq millilitres de tampon de carbonate de sodium à 100 millimolaire, glacé, et de 0,5 millilitre de HLM glacé. Après centrifugation pendant 30 minutes, utiliser une pipette en PE courbée pour prélever soigneusement la couche supérieure flottante de couleur blanche contenant les gouttelettes lipidiques, et la répartir dans trois tubes de 1,5 millilitre contenant chacun 100 microlitres de HLM. Caractériser les gouttelettes lipidiques selon le protocole décrit dans le texte, comme illustré sur cette figure ; la présence de gouttelettes lipidiques isolées à partir de cellules de villosités placentaires humaines au terme a été confirmée par coloration avec un colorant fluorescent spécifique des lipides neutres, Bodipy 493/503, et visualisée par microscopie en fluorescence.

La pureté des fractions de gouttelettes lipidiques isolées a été évaluée ici par immunotransfert à l'aide de protéines marqueurs spécifiques : para lippin pour les gouttelettes lipidiques, la calnexine pour le réticulum endoplasmique, le marqueur Golgi GM130, COX IV pour les mitochondries et la membrane plasmique, ainsi que MEK1. Après précipitation des gouttelettes lipidiques à l'acétone froide et extraction des protéines, les fractions ont été soumises à un immunotransfert pour para lipin.

Deuxièmement, la protéine des gouttelettes lipidiques a été détectée dans le surnageant post-nucléaire et dans la couche blanche isolée flottante contenant les gouttelettes lipidiques. Les protéines spécifiques des membranes plasmiques, telles que MK1 et GM1 30, n'ont pas été détectées dans les fractions de gouttelettes lipidiques, ni dans la couche située sous la couche flottante pour les centrifugations quatre et cinq. Comme indiqué précédemment, la calnexine et une faible coloration de la protéine membranaire mitochondriale COX4 ont été détectées ailleurs dans la fraction de gouttelettes lipidiques.

Ces résultats sont conformes aux rapports antérieurs montrant que les gouttelettes lipidiques interagissent avec les mitochondries dans les cellules de mammifères et avec le REG. Après cette procédure, d'autres méthodes comme les approches protéomiques et lipidomiques peuvent être réalisées pour étudier des questions supplémentaires, telles que les facteurs associés aux gouttelettes.