Name: Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Découvrez l'isolation des gouttelettes lipidiques par centrifugation en gradient de densité à partir de cellules de levure et de placentas humains. Cette méthode permet d'étudier le métabolisme lipidique cellulaire avec une pureté vérifiée par Western Blot.

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Ce travail a été soutenu par la récompense American Heart Association 13SDG14500046 à PD, une éducation à l&#39;énergie durable et Centre de recherche Prix (Univ. du Tennessee) à PD, et par la formation médicale des médecins et la Fondation de recherche (Université de Tennessee) prix à JM Le auteurs remercient Caroline Leplante (Yale Univ.) pour le protocole pour convertir la levure à fission à sphéroplastes; Eric T. Boder (Univ. du Tennessee) pour l&#39;usage de ses incubateurs, serrant la table centrifugeuse, et Western Blot équipement d&#39;analyse et le Centre pour Biotechnologie de l&#39;Environnement (Univ. Tennessee) pour l&#39;utilisation de leur ultra-centrifugeuse; Günther Daum pour les anticorps de levure (Graz University of Technology, en Autriche.); le personnel du Département d&#39;obstétrique et de gynécologie (Univ. Tennessee Medical Center) pour l&#39;assistance technique .

Une. Isoler gouttelettes lipidiques (de fission) cellules de levure Isolation des gouttelettes de l&#39;organisme modèle populaire en herbe levure Saccharomyces cerevisiae est presque identique au protocole 6 suivant. Différences dans les préparatifs sont notées. Une. Des cellules de levure de croissance <ol><li> Préparer les médias. Combiner 36 g de poudre par litre YE5S de dH 2 O dans des bouteilles en verre ou des fioles de culture. Environ 2 L de médias sera nécessaire. Autoclave les médias à 121 ° C pendant 20 min. Autoriser les médias à refroidir à température ambiante. Pour S. cerevisiae remplacer YE5S avec YPD. </li><li> Placez 10-20 ml de médias YE5S refroidis dans un flacon de 250 ml de culture en utilisant des techniques stériles. Ensemencer le support avec une petite quantité de cellules de levure à partir d&#39;une plaque de gélose à l&#39;aide d&#39;un bâton en bois ou équivalent stérile. Laissez les cellules se développent à la densité optique désirée à 30 ° C. Mesurer la densité optique à unelongueur d&#39;onde de 595 nm en utilisant un spectrophotomètre. </li><li> Placez le support restant dans les 2,8 L flacons. Ne pas utiliser plus de 1 L de support par 2,8 L fiole pour assurer un mélange approprié pendant la croissance des cellules dans l&#39;incubateur sous agitation. Le rendement final de cellules humides devrait être d&#39;environ 10 g de pouvoir acquérir suffisamment de gouttelettes lipidiques pour l&#39;analyse protéomique et lipidomiques. </li><li> Présentez les cellules de l&#39;étape 1.2 dans les 2,8 L flacons ayant chacun 1 L de médias qui ont été préparés à l&#39;étape 1.1. </li><li> Cultiver les cellules à la densité souhaitée à 30 ° C. </li><li> Assurez-vous que les cellules ont des gouttelettes lipidiques. Réserve 1 ml de cellules. Mesurer la densité optique (OD) de l&#39;échantillon. Ajouter 0,1 ml d&#39;une 100 mM de BODIPY 493/503 dans de l&#39;éthanol par DO de cellules de l&#39;échantillon. Placez 3 pi de l&#39;échantillon entre une lame de verre et une lamelle de verre. Visualiser au microscope à fluorescence avec un filtre de GFP (Figure 1A). </li><li> Pellet les cellules de l&#39;étape 1.5 à 4 &amp; #176, C à 3800 g pendant 10 min. Travailler par lots en fonction de la capacité des tubes à centrifuger. </li><li> Verser les médias YE5S et laver les cellules avec un tampon de EMM + 600 mM de sorbitol. Sorbitol fournit un soutien osmotique. </li><li> Transférer les cellules dans un tube de 50 ml à centrifuger stérile et sédimenter les cellules à 4 ° C à 2000 xg pendant 10 min. Retirer le surnageant. Peser les cellules humides. Remettre en suspension les cellules dans 2 ml de (EMM + 600 mM de sorbitol) tampon par gramme de cellules. </li></ol> 2. La conversion des cellules de levure de fission en sphéroplastes et la lyse ultérieure <ol><li> Ajouter 5 mg chacune 1) levure enzyme lytique et 2) de levure de lyse enzymes de Trichoderma harzianum par gramme de cellules humides qui ont été pesés à l&#39;étape 1.9. Pour S. cerevisiae augmenter ces enzymes avec la même quantité de Zymolyase. </li><li> Incuber les cellules à 30 ° C sous agitation à 100 rpm pendant 60 min douce. </li><li> Assurez-vous que les sphéroplastes ont dr lipidesoplets. Par étape de 1,6 (figure 1B) répéter. </li></ol> 3. Centrifugation en gradient de densité <ol><li> Pellet les sphéroplastes par centrifugation à 4 ° C à 2000 x g pendant 5 min. </li><li> Retirez délicatement le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique. </li><li> Resuspendre doucement les sphéroplastes granulés avec de la glace froid 10 mM Tris-HCl, 600 mM de sorbitol, et 200 pM EDTA. Gardez à l&#39;esprit que les sphéroplastes sont très fragiles. </li><li> Pellet les sphéroplastes à nouveau en utilisant les mêmes paramètres que dans l&#39;étape 3.1. Retirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension les sphéroplastes à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique dans 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et 200 uM d&#39;EDTA à une concentration de 2 ml / g de cellules. </li><li> Transférer les sphéroplastes remises en suspension dans un homogénéisateur en verre et homogénéiser doucement sur la glace, 20-30 coups, avec le pilon lâche de l&#39;homogénéisateur en verre. </li><li> Transférer les sphéroplastes lysées à tubes de centrifugation et superposer avec la même volume de 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et 200 uM de tampon EDTA. Choisissez le nombre de tubes de centrifugation à utiliser de sorte que chaque tube est d&#39;environ deux tiers plein. </li><li> Centrifuger à 4 ° C à 100 000 xg pendant 1,5 h dans un rotor SW28 ou équivalent. Autoriser rotor à l&#39;autre à un arrêt (rotor décélération = 0). </li><li> Transférer doucement la couche supérieure flottant blanc (figure 2A), qui contient des gouttelettes, dans un nouveau tube (s) de la centrifugeuse en utilisant soit une pipette ou une pipette Pasteur plié. Ajouter suffisamment de volume de 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et un tampon de 200 uM d&#39;EDTA à l&#39;échantillon de façon à ce qu&#39;il remplisse environ le tiers du tube de centrifugation. </li><li> Ajouter le volume équivalent de 8% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et un tampon de 200 uM d&#39;EDTA à la partie supérieure de l&#39;échantillon (s) dans le nouveau tube (s) de centrifugation. Après addition de ce tampon les tubes doivent être d&#39;environ deux-tiers. </li><li> Centrifuger à 4 ° C à 100 000 xg pendant 1 h dans un rotor SW28 ou équivalent. Autoriser rotor à l&#39;autre à un arrêt (rOtor décélération = 0). </li><li> Transférer doucement la couche supérieure flottant blanc (figure 2B), qui contiendra les gouttelettes, dans un nouveau tube (s) de la centrifugeuse en utilisant soit une pipette ou une pipette Pasteur plié. Ajouter 600 mM de sorbitol, 8% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, et un tampon de 200 uM d&#39;EDTA à l&#39;échantillon de façon à ce qu&#39;il remplisse environ le tiers du tube de centrifugation. </li><li> Ajouter le volume équivalent de 250 mM de sorbitol, 10 mM Tris-HCl, et un tampon 200 uM d&#39;EDTA à la partie supérieure de l&#39;échantillon (s) dans le nouveau tube (s) de centrifugation. Après addition de ce tampon les tubes doivent être d&#39;environ deux-tiers. </li><li> Centrifuger à 4 ° C à 100 000 xg pendant 1 h dans un rotor SW28 ou équivalent. Autoriser rotor à l&#39;autre à un arrêt (rotor décélération = 0). </li><li> Transférer la couche supérieure blanche (figure 2C), qui doit contenir que les gouttelettes de lipides et les protéines liées, à un tube de dialyse, et on dialyse O / N dans 10 mM de Tris-HCl et 200 uM de tampon EDTA pour éliminer le Ficoll. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Isoler gouttelettes lipidiques à partir de cellules des villosités placentaire humain Placentas ont été recueillies auprès des femmes en bonne santé avec les grossesses uniques qui subissent une section césarienne avant le début du travail spontané à terme. Sujets ont écrit, le consentement éclairé pour la collecte de leur placenta. La collection et l&#39;utilisation ultérieure, de placentas a été réalisée avec l&#39;approbation de l&#39;Université du Tennessee et de l&#39;Université du Tennessee Graduate School of Medicine à l&#39;Institutional Review Board Knoxville (# 8757B et # 3338, respectivement). Une. Isoler les cellules des villosités placentaires humains Partie 1 du protocole est une modification d&#39;un protocole publié plus tôt par Petroff et al. 26 Préparer les solutions suivantes: <ul><li> De NaCl (1 L): dissoudre 9 g de NaCl (M 58,4 g / mol) dans dH 2 O pour obtenir une solution à 1 L. Stériliser par filtration (0,2; Um membrane). </li><li> Solution saline équilibrée de 10x Hank (10x HBSS) (1 litre): 4 g de KCl (M 74,5 g / mol); 0,6 g KH 2 PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g de NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g de D-glucose (M 180,16 g / mol). Dissoudre chacun des constituants dans dH 2 O pour donner une solution de 1 litre. Stériliser par filtration (membrane de 0,2 um). </li><li> Un tampon de digestion enzymatique (0,6 ml): combiner 70 ml de HBSS 10x avec 3,3 ml de 7,5% de Na biscarbonate, 17,5 ml 1 M HEPES, et 266,1 ml dH 2 O; stériliser par filtration (membrane de 0,2 um). Stocker à 4 ° C. </li><li> DNase I: juste avant utilisation, ajouter 5 ml de NaCl 0,9% stérile dans un flacon de DNase. Garder sur la glace jusqu&#39;à utilisation ou conserver à -20 ° C. </li></ul><ol><li> Placenta préparation pour la dissection <ol><li> Obtenir un placenta et processus au plus près du moment de la livraison que possible humaine. Utiliser un récipient fermé tel qu&#39;un refroidisseur pour transporter le placenta. Soyez toujours prudent lorsque la mainling matériels biologiques humains. </li><li> Dans la hotte de sécurité biologique, transférer le placenta dans un récipient autoclavable stérile, et laver soigneusement sang de placenta et les membranes à l&#39;aide de NaCl 0,9% stérile (solution saline) solution. Jeter saline sanglante dans le bécher de 1 L de déchets biologiques liquides. </li><li> Placer le placenta sur un champ stérile, avec la surface portant le cordon ombilical vers le haut. Avec tranchants, ciseaux pointes fines et pince retirer les membranes foetales et cordon ombilical. </li><li> Retournez le placenta de sorte que la surface maternelle (surface rugueuse) est orientée vers le haut. Enlever le tissu de la plaque de base sus-jacente, d&#39;environ 3 mm de la surface. </li></ol></li><li> Disséquer le placenta <ol><li> Disséquer un cotylédon à la fois d&#39;éviter la plaque chorionique. Recueillir des villosités dans un bécher de 250 ml avec une solution saline. </li><li> Rincer tissu plusieurs fois dans un bêcher séparé avec 0,9% de NaCl par tourbillonnement avec une pince, à l&#39;aide du bêcher de 1 litre pour les déchets liquides. </li><li> Transférer un cotylédon à la fois pour un plat de 150 mm de Pétri. Tenir avec une pince et gratter le tissu avec une lame de rasoir de navires sur boîte de Pétri. Placez le tissu gratté dans le bécher séparé contenant 0,9% de NaCl. Répétez l&#39;opération pour tous les morceaux de tissu. </li><li> Transfert petite partie du tissu au tamis de dissociation cellulaire et rincer à 0,9% de NaCl largement jusqu&#39;à l&#39;éluat devient clair. Répétez l&#39;opération pour tous les tissus. </li><li> Après rinçage du tissu gratté dans le tamis de dissociation cellulaire, la vider de liquide et l&#39;excès de poids. A ce stade, le tissu peut être conservé O / N dans un ballon d&#39;Erlenmeyer stérile à 4 ° C dans du DMEM. </li></ol></li><li> Digestion enzymatique du tissu placentaire <ol><li> Préparer le mélange de digestion du tissu: 100 ml de tampon de dilution de l&#39;enzyme préchauffé, 1 ml de DNase I et de 20 ml de trypsine à 2,5% 10x. </li><li> Diviser le tissu, le transfert de 60 g de tissu recueilli au total (habituellement d&#39;environ 250 à 300 g) à un ballon de 500 ml d&#39;Erlenmeyer stérile. </li><li&gt; Ajouter le mélange de digestion du tissu à l&#39;erlenmeyer contenant le tissu et incuber à 37 ° C dans un agitateur pendant 45 min à 150 rpm. </li></ol></li><li> La collecte des cellules dissociées <ol><li> Après le premier 45 min dissociation, mettre le ballon de digestion à une inclinaison jusqu&#39;à ce que le tissu s&#39;installe. </li><li> Recueillir le surnageant, en prenant soin de ne pas percevoir les tissus non dissocié. Ajouter une quantité égale de HBSS au surnageant recueilli et les transférer dans des tubes de 15 ml à centrifuger stériles. Pour des portions supplémentaires de tissu non dissocié, répéter la procédure à partir de l&#39;étape 3.2 avec le tissu non dissocié. </li><li> Centrifuger l&#39;homogénat à 4 ° C à 1000 xg pendant 15 min. </li><li> Pour chaque lot, après centrifugation, aspirer le surnageant sans perturber le culot. Les cellules des villosités placentaires sont en majorité dans la partie blanche de la pastille, recouvrant les globules rouges. </li><li> Transférer les cellules des villosités (partie blanche de la pastille) à une sterile 50 ml tube à centrifuger conique et garder sur la glace. </li><li> Après avoir recueilli les cellules à partir de chacune des trois étapes de digestion, un filtrage de la suspension en utilisant un tamis cellulaire en nylon de 100 um inséré dans la partie supérieure de 50 ml d&#39;un tube de centrifugation conique stérile. Si la filtration de la suspension cellulaire ralentit, soulevez sur le filtre pour créer un vide dans le tube. </li><li> Centrifuger à 4 ° C à 1000 xg pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant sans déranger le culot. </li></ol></li></ol> 2. Homogénéisation des cellules des villosités placentaires <ol><li> Avant de commencer le processus d&#39;isolement, de préparer 50 ml de lyse hypotonique moyen (HLM) contenant 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 et EDTA 1 mM. Ajouter inhibiteurs de la protéase à HLM juste avant utilisation et conserver le milieu de la glace. </li><li> Dans le capot de protection biologique, ajouter 4 fois le volume du culot cellulaire d&#39;glacée HLM aux cellules. Doucement et entièrement remettre les cellules par pipetage des cellules jusqu&#39;à-und-bas à l&#39;aide d&#39;une pipette de 10 ml. </li><li> Incuber les cellules en suspension sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Transférer les cellules à l&#39;homogénéisateur Dounce, qui devrait se retrouver sur la glace. Homogénéiser lentement les cellules en appliquant 20-25 caresses avec le pilon ample de l&#39;homogénéisateur. </li><li> Centrifuger le lysat de cellules à 4 ° C à 3000 xg pendant 10 min pour éliminer les cellules non rompues, des débris cellulaires et les noyaux. </li><li> Recueillir le surnageant et transférer dans un tube SW28 (ou alternative qui peut être centrifugé à 25 000 xg). Centrifuger à 4 ° C à 25000 g pendant 20 min pour éliminer les mitochondries. </li></ol> 3. Isolement de gouttelettes lipidiques par ultracentrifugation <ol><li> Préparer 50 ml de carbonate de sodium 100 mM (M 106 g / mol) tampon (pH 11,5) et 50 ml de saccharose à 60% (m / m) solution. Ajouter des inhibiteurs de la protéase dans le tampon de carbonate de sodium, juste avant l&#39;utilisation et la maintenir sur de la glace. </li><li> Recueillir le surnageant de l&#39;étape 2.6 dans un tube de centrifugeuse de 50 ml, ajusterà 20% de saccharose et de transfert dans la partie inférieure d&#39;un tube d&#39;ultracentrifugation pour un rotor SW28, ou l&#39;équivalent. Surnageant densité Overlay ajusté avec ~ 10 ml de tampon de carbonate de sodium 100 mM glacé (pH 11,5) et 0,5-1 ml de glace-froid HLM pour remplir le tube. </li><li> Centrifugeuse à 4 ° C à 130 000 g pendant 45 min à l&#39;aide SW28 oscillant seau rotor. Autoriser rotor à l&#39;autre à un arrêt (rotor décélération = 0). </li><li> Recueillir la couche flottante, ajuster à 10% de saccharose et le transférer dans le fond d&#39;un tube d&#39;ultracentrifugation 13,2 ml pour un rotor SW41Ti, ou l&#39;équivalent. Superposition densité ajustée surnageant avec environ 5 ml de tampon carbonate de sodium 100 mM glacé (pH 11,5) et 0,5 ml de HLM glacée. </li><li> Centrifugeuse à 4 ° C à 274 000 g pendant 60 min à l&#39;aide SW41Ti oscillant seau rotor. Autoriser rotor à l&#39;autre à un arrêt (rotor décélération = 0) pour minimiser la perturbation de la couche lipidique de gouttelettes. </li><li> Recueillir soigneusement la couche flottante supérieure (figure 2D) contenantgouttelettes lipidiques avec une pipette de 1 ml et répéter l&#39;étape 3.4. </li><li> Centrifugeuse à 4 ° C à 274 000 g pendant 30 min à l&#39;aide SW41Ti oscillant seau rotor. Autoriser rotor à l&#39;autre à un arrêt (rotor décélération = 0). </li><li> Recueillir soigneusement la couche flottante de couleur blanche supérieure contenant des gouttelettes lipidiques avec une pipette Pasteur plié en trois tubes de 1,5 ml contenant 100 ul HLM. </li></ol> Gouttelettes lipidiques caractérisant fraction (protocoles n ° 1 et 2) La récupération et la pureté de la fraction lipidique de la gouttelette peut être vérifiée par Western Blot combinée avec de la lumière ou par microscopie électronique. En outre, des parties aliquotes après différentes étapes de centrifugation peuvent être recueillis et conservés pour la détermination de l&#39;efficacité de la purification. En Western blot, il est plus approprié pour comparer un volume de la fraction des gouttelettes de lipides qui représente un équivalent de l&#39;ensemble du lysat de cellules que l&#39;on compare les gouttelettes lipidiques à d&#39;autres fractions membranaires de tIl base de la teneur totale en protéines 24.

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<li>Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+size+of+lipid+droplets%3A+lipid+and+protein+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).</li>
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<li>Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactomic+study+on+interaction+between+lipid+droplets+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria.</a> Protein Cell. 2, 487-496 (2011).</li>
<li>Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+distribution+of+mitochondria+and+lipid+droplets+in+human+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres.</a> Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).</li>
<li>Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gregarious+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The gregarious lipid droplet.</a> J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).</li>
<li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+of+fat%3A+an+evolving+model+of+lipid+droplet+assembly+and+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion.</a> J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

<html> Les étapes critiques de ce protocole Assurez-vous d&#39;être cohérent avec les médias et les densités cellulaires au cours de la croissance des cellules en culture. Gouttelettes lipidiques cellulaires sont uniques que leurs protéines associées dépendent fortement de l&#39;environnement dans lequel les cellules sont cultivées 17. Par conséquent, les médias, dans lequel les cellules sont cultivées et la densité des cellules doivent être étroit...

Gouttelettes lipidiques sont des organites cellulaires dynamiques qui servent plusieurs fonctions dans les cellules. Ce sont des concentrateurs de stockage pour les lipides neutres, qui peuvent être converties en énergie ou utilisés pour la synthèse des phospholipides. Les gouttelettes jouent un rôle central dans des conditions physiologiques et pathologiques, y compris l&#39;athérosclérose, l&#39;obésité et les maladies métaboliques, ainsi que les maladies infectieuses 1,2. En outre, ils sont des sources intéressantes pour le biodiesel. Beaucoup d&#39;informations sur les rôles cellulaires de gouttelettes lipidiques a été obtenu à partir de l&#39;analyse protéomique et lipidomiques de gouttelettes purifiés à partir d&#39;organismes de grande envergure 3. Ces organismes ont inclus des bactéries, des levures 4,5 6-11, plantes 12,13, 14 nématodes et les mouches 15,16. Compte tenu de l&#39;intérêt dans le rôle de gouttelettes lipidiques dans les maladies métaboliques de l&#39;homme, les gouttelettes ont également été isolés à partir de cellules animales cultivées et untissus Nimal. Les lignées cellulaires cultivées ont inclus les adipocytes 3T3-L1, 17 ovariennes de hamster chinois (CHO) ou des cellules de K2 18, 19,20 hepatocyes humains et des lignées de cellules epitheliales 21. Les tissus animaux dont les gouttelettes ont été isolées ont inclus la souris muscle squelettique 22, 23 foie et les glandes mammaires 23. Comme mentionné ci-dessus, le but de la plupart des études d&#39;isolement de gouttelettes est d&#39;effectuer l&#39;analyse protéomique sur les facteurs liés lipidomiques et analyse sur le neutre et les phospholipides. Etant donné que les lipides neutres - les plus nombreux composants de gouttelettes lipidiques - sont moins denses que la plupart des autres matériaux cellulaires, l&#39;isolement des gouttelettes a été traditionnellement effectuées en utilisant la centrifugation en gradient de densité. Cette technique est la pièce maîtresse des deux préparations présentées ici. Les techniques précédentes sont réunies et 6,24 modifiés dans une présentation visuelle de la séparation de gouttelettes à partir de cellules de levure de fission cultivéeset les cellules humaines noncultured obtenues à partir de tissu placentaire. L&#39;objectif est de montrer la large applicabilité de cette technique en choisissant deux types de cellules très différentes comme points de départ pour l&#39;isolement des gouttelettes. Cette technique devrait être utile pour ceux qui souhaitent isoler des gouttelettes de la plupart des organismes. Protocole 1 décrit l&#39;isolement de gouttelettes de lipides à partir de la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, qui a été utilisé comme modèle pour l&#39;observation de la formation de gouttelettes au cours de la division cellulaire eucaryote 25. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae a été largement utilisée comme un organisme modèle pour l&#39;étude de la biologie des gouttelettes de lipide. Protocole 1 est applicable à la fois aux organismes et les différences dans les préparatifs sont mis en évidence. Protocole n ° 2 décrit l&#39;isolation de gouttelettes de lipides à partir de cellules villeuses placentaires, qui sont à leur tour obtenu à partir de placentas humains à terme. Lacollection de placentas à terme offre une occasion unique d&#39;obtenir en toute sécurité et éthique 200-250 g de tissu humain facilement disponibles 26, qui contient un nombre important de gouttelettes lipidiques. Ceci est en contraste avec la plupart des travaux d&#39;isolation de gouttelettes de lipides chez les eucaryotes supérieurs, où les gouttelettes provenant de cellules cultivées. Dans ces études, les acides gras sont souvent ajoutés à la culture pour favoriser la synthèse des lipides neutres et donc la croissance de gouttelettes. Ceci est en contraste avec le travail ici où des gouttelettes lipidiques sont formées dans des conditions natives dans le tissu placentaire. Les puretés des fractions lipidiques de gouttelettes sont déterminées par analyse par transfert de Western en utilisant des anticorps marqueurs organelles. Ces deux protocoles donneront lipidiques fractions de gouttelettes qui sont appropriés pour l&#39;analyse protéomique et lipidomiques ultérieure.

<table><tbody><tr><td>Protocole 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1. Croissance de cellules de levure et conversion en sphéroplastes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh Minimal Media (EMM)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2005</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure avec 5 suppléments (YE5S)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2011</td><td>YE5S media avec 225 mg/ml de chaque supplément : adeninie, histidine, leucine, lysine, uracile. L’équivalent pour la levure bourgeonnante serait YPD.</td></tr><tr><td>Poudre YPD</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1875</td><td>Pour S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td></td></tr><tr><td>Levure Enzyme lytique</td><td>MP Biomedicals</td><td>215352610</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Enzymes de Trichoderma harzianum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Zymolayse-20T</td><td>Sunrise Science Products</td><td>N0766391</td><td>Pour S. cerevisiae</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de microscope en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Flacon</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>en verre de 1 LFiole</td><td></td><td></td><td></td>de 250 ml</tr><tr><td>Flacons</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< 2 L >2. Isolement des gouttelettes lipidiques de levure</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por Dialyse Membrane</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase sans EDTA Comprimés</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Dounce Homogénéisateur&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Tubes 25 mm x 89 mm (pour SW28)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à température contrôlée</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Thermo Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de centrifugeuse à godet oscillant</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite* F15-6x100Y Rotor à angle fixe</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 Rotor d’ultracentrifugeuse</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>Protocol 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>1. Isolation des cellules villeuses placentaires </fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Coussinets jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>23666062</td><td></td></tr><tr><td>Casserole autoclavable (récipient), 3 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>1336110</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins, tranchants-tranchants, droits</td><td>Outils de science fine</td><td>1406011</td><td></td></tr><tr><td>London Forceps</td><td>Outils de science fine</td><td>1108002</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>1127020</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>S65921</td><td></td></tr><tr><td>Coupelle d’écran pour CD-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>40 mesh screen&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Colorants cellulaires Fisherbrand 100 &mu ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9054771</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P386</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO<> 4</td>Fisher <td>Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>2,5 % Trypsine 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNase I grade II, à partir du pancréas bovin</td><td>Roche Applied Science</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td> <td>de bicarbonate de sodiumSigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Erlenmeyer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Béchers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubes</td><td></td><td></td><td></td>à centrifuger</tr><tr><td>10 ml Pipettes</td><td></td><td></td><td></td>sérologiques</tr><tr><td>50 ml Tubes</td><td></td><td></td><td></td>à centrifuger</tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td><fort>2. Isolement de gouttelettes lipidiques à partir de cellules placentaires villeuses </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>D-Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de sodium&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP357</td><td></td></tr> comprimés <tr><td>cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Dounce homogénéisateur&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger 25 mm x 89 mm (pour SW28)</td>Tubes à centrifuger <td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 14 mm x 89 mm (pour SW41)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Verre borosilicaté jetable Pipettes Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Capot de sécurité biologique&nbsp ;</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à température contrôlée</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend XTR Centrifugeuse</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>à godet oscillant Rotor</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse LB-M</td><td>Rotor d’ultracentrifugeuse Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28</td><td>Rotor d’ultracentrifugeuse Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor d’ultracentrifugeuse</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 Goat Anti-Rabbit</td><td>Li-COR</td><td>926-68071</td><td>dilution 1:15,000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Chèvre Anti-souris IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>dilution 1:5 000</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12 % Bis-Tris gels</td><td>Invitrogen</td><td>NP0341</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaires pour le protocole 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erg6p</td><td>don du Dr G. Daum</td><td>Université de technologie de Graz, Autriche</td><td>dilution 1:5 000</td></tr><tr><td>Dpm1p</td><td>Abcam</td><td>ab113686</td><td>4 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Por1p</td><td>don du Dr G. Daum Université</td><td>de technologie de Graz, Autriche</td><td>dilution 1:5 000</td></tr><tr><td>Pma1p</td><td>don du Dr G. Daum Université</td><td>de technologie de Graz, Autriche</td><td>dilution 1:10 000</td></tr><tr><td>Vma1p (anti-ATP6V1A)</td><td>Abcam</td><td>ab113745</td><td>0,5 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Anticorps primaires pour le protocole 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perilipin 2 (anti-ADFP)</td><td>Abcam</td><td>ab52355</td><td>2 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>Calnexin</td><td>2679</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>GM130</td><td>Biorbyt</td><td>orb40533</td><td>dilution 1:25</td></tr><tr><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>COX IV</td><td>4850</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>MEK1</td><td>Biorbyt</td><td>orb38775</td><td>dilution 1:50</td></tr></tbody></table>

isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Les gouttelettes lipidiques sont des organites dynamiques qui peuvent être trouvés dans la plupart des cellules procaryotes eucaryotes et certaines. Structurellement, les gouttelettes sont constitués d&#39;un noyau de lipides neutres entouré par une monocouche de phospholipides. Une des techniques les plus utiles pour déterminer les rôles cellulaires de gouttelettes a été identification protéomique des protéines liées, qui peuvent être isolées avec les gouttelettes. Ici, deux méthodes sont décrites pour isoler des gouttelettes lipidiques et leurs protéines liées de deux vastes eucaryotes: fission levure et les cellules des villosités placentaires humains. Bien que les deux techniques présentent des différences, la principale méthode - centrifugation en gradient de densité - est partagée par les deux préparations. Ceci démontre la grande applicabilité des techniques d&#39;isolement de gouttelettes présentés. Dans le premier protocole, des cellules de levure sont transformées en sphéroplastes par digestion enzymatique de leurs parois cellulaires. Les sphéroplastes résultants sont ensuite Gentment lysées dans un homogénéisateur ample. Ficoll est ajouté au lysat de fournir un gradient de densité, et le mélange est centrifugé trois fois. Après la première rotation, les gouttelettes lipidiques sont localisées sur la couche flottante de couleur blanche des tubes de centrifugeuse en même temps que le réticulum endoplasmique (RE), de la membrane plasmique, et vacuoles. Deux tours suivants sont utilisés pour enlever ces trois autres organites. Le résultat est une couche qui ne comporte que des gouttelettes et des protéines liées. Dans le second protocole, les cellules des villosités placentaires sont isolés à partir de placentas à terme humain par digestion enzymatique à la trypsine et la DNase I. Les cellules sont homogénéisées dans un homogénéisateur ample. Étapes à basse vitesse et de centrifugation à vitesse moyenne sont utilisés pour éliminer les cellules intactes, des débris cellulaires, noyaux et des mitochondries. Le saccharose est ajouté à l&#39;homogénat de fournir un gradient de densité et le mélange est centrifugé pour séparer les gouttelettes de lipides à partir de l&#39;autre cellulafractions de r. La pureté des gouttelettes lipidiques dans les deux protocoles est confirmée par analyse Western Blot. Les fractions de gouttelettes de deux préparations sont adaptés à l&#39;analyse protéomique et lipidomiques ultérieure.

Si la centrifugation en gradient de densité a fonctionné comme prévu, la couche flottante doit contenir des gouttelettes lipidiques et être épuisé d&#39;autres organites tout au long de la progression des tours à grande vitesse. Pour le protocole 1, les Western blots ont été réalisées avec des anticorps de marqueurs à des gouttelettes lipidiques (Erg6p), et des organites qui ont été trouvés pour interagir avec les gouttelettes lipidiques dans la levure, ER (Dpm1p), les mitochondries (Por1p),...

Deux techniques pour isoler des gouttelettes lipidiques cellulaires à partir de 1) cellules de levure et 2) placentas humains sont présentés. L&#39;élément central de ces deux procédés est centrifugation en gradient de densité, où la couche flottante résultant contenant les gouttelettes peuvent être facilement visualisés à l&#39;oeil nu, on extrait et quantifié par analyse par transfert de Western pour la pureté.

Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les gouttelettes lipidiques à partir de tissu. Cela est réalisé en premier lieu par la dissection et la séparation du tissu placentaire. Ensuite, les cellules de l'oléine sont homogénéisées.Ensuite, les organites sont séparés par plusieurs étapes de centrifugation. Enfin, la couche flottante contenant les gouttelettes lipidiques est recueillie et les gouttes lipidiques sont caractérisées. En dernier lieu, la microscopie de fluorescence et l'analyse western blot sont utilisées pour démontrer la pureté de la fraction de gouttelettes lipidiques.Le principal avantage de cette technique est qu'il est possible d'isoler des gouttelettes lipidiques à partir de la plupart des cellules aortiques. Notez que dans certains tissus, le nombre de gouttelettes peut être inférieur à celui réduisant la couche flottante G et le nombre de gouttelettes. Les placentas ont été recueillis auprès de femmes en bonne santé ayant des grossesses uniques et subissant une césarienne programmée avant le début du travail spontané à terme ; les sujets ont donné leur consentement éclairé par écrit pour la collecte de leur placenta.La collecte et l'utilisation ultérie

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Nous décrivons une nouvelle méthode quantitative lipidomique pour identifier les espèces de lipides dans la levure à l'aide de nombreuses enquêtes-scan spectrométrie de masse electrospray ionisation (ESI / MS). Cette méthode dépasse actuellement les méthodes disponibles pour l'identification et la quantification des lipides dans la capacité à résoudre les diverses formes moléculaires de lipides, la sensibilité et la vitesse.

Une évaluation quantitative du lipidome levure en utilisant la spectrométrie de masse électrospray ionisation

Cette vidéo démontre l’isolement lipidique des neutrophiles humains par un système de solvant biphasique utilisant du méthanol et du chloroforme.

Isolement de lipides à partir de neutrophiles dérivés du sang humain par séparation biphasique

Les microARN jouent un rôle régulateur important et sont en train de devenir de nouvelles cibles thérapeutiques pour diverses maladies humaines. Il a été montré que les miARN sont transportés dans des lipoprotéines à haute densité. Nous avons mis au point une méthode simplifiée pour isoler rapidement les HDL purifiée convenant pour l'analyse des miARN du plasma humain.

Méthode rapide et simplifié Haut Isolation Grâce-put de miARN de hautement purifiées High Density Lipoprotein

Ce protocole décrit l’isolement et la quantification des petits ARN des lipoprotéines de haute densité.

Isolement de lipoprotéines de haute densité pour les non-codant petit ARN Quantification

des gouttelettes lipidiques sont des organelles importantes pour la replication de plusieurs agents pathogènes, y compris le virus de l'hépatite C (VHC). Nous décrivons un procédé pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées; il peut être utilisé dans une variété de conditions, telles que l'infection par le virus, le stress environnemental ou un traitement médicamenteux.

Isolation Lipid Droplet pour l&#39;analyse quantitative de spectrométrie de masse

Ce protocole établit une nouvelle méthode d’isolement de gouttelettes lipidiques et la purification du foie de souris, à l’aide d’un kit d’isolation bien établie du réticulum endoplasmique.

Protocole d’isolement de gouttelettes lipidiques rapide à l’aide d’un Kit d’Isolation des organites bien établie

Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem pour identifier et quantifier les lipides cellulaires principaux dans saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite pour une évaluation quantitative des classes lipidiques majeures dans une cellule de levure est polyvalente, robuste et sensible.

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Ici, un protocole est présenté pour le profilage métabolique de la levure avec de l’acide 14C-acétique, qui est couplé à la chromatographie sur couche mince pour la séparation des lipides neutres.

Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

Un protocole rapide et efficace est présenté pour l’isolement des gouttelettes lipidiques plastoglobules associées à divers organismes photosynthétiques. La préparation réussie de plastoglobules isolés est une première étape cruciale qui précède les investigations moléculaires détaillées telles que les analyses protéomiques et lipidomiques.

Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobule à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries

Traditionnel, en deux dimensions techniques de culture cellulaire entraînent souvent des caractéristiques modifiées par rapport aux marqueurs de différenciation, de cytokines et de facteurs de croissance. Culture cellulaire en trois dimensions dans le système de culture cellulaire en rotation (CRCT) rétablit l'expression de plusieurs de ces facteurs comme montré ici avec une lignée de cellules trophoblastiques extravilleux.

Rotation systèmes de culture cellulaire de la culture de cellules humaines: les cellules du trophoblaste humain comme modèle

Découvrez l'isolation des gouttelettes lipidiques par centrifugation en gradient de densité à partir de cellules de levure et de placentas humains. Cette méthode permet d'étudier le métabolisme lipidique cellulaire avec une pureté vérifiée par Western Blot.

Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains (Vidéo) | JoVE Journal

Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

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