Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les gouttelettes lipidiques des tissus. Ceci est accompli en disséquant et en séparant d’abord le tissu placentaire. Ensuite, les cellules de l’oléine sont homogénéisées.

Ensuite, les organites sont séparés par plusieurs étapes de centrifugation. Enfin, la couche flottante contenant les gouttelettes lipidiques est collectée et les gouttes lipidiques sont caractérisées. En fin de compte, la microscopie à fluorescence et l’analyse sanguine occidentale sont utilisées pour montrer la pureté de la fraction des gouttelettes lipidiques.

Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’isoler les gouttelettes lipidiques de la plupart des cellules de l’aorte. Notez que dans certains tissus, le nombre de gouttelettes peut être inférieur à ceux réduisant la couche G flottante et le nombre de gouttelettes. Des placentas ont été prélevés chez des femmes en bonne santé ayant une grossesse unique, subissant une césarienne élective avant le début du travail spontané à terme

Le prélèvement et l’utilisation ultérieure des placentas ont été effectués avec l’approbation de l’Université du Tennessee et de la Graduate School of Medicine de l’Université du Tennessee à Knoxville. Dans la hotte de sécurité biologique, transférez le placenta dans un récipient autoclavable stérile et lavez soigneusement le sang du placenta et des membranes à l’aide d’une solution saline stérile. Jetez la solution saline sanglante dans un bécher d’un litre comme déchet biologique liquide.

Placez le placenta sur un champ stérile avec cette surface lisse portant le cordon ombilical vers le haut avec des ciseaux et des pinces pointus et fins. Retirez le cordon ombilical et les membranes fœtales. Ensuite, retournez le placenta de manière à ce que la surface maternelle soit tournée vers le haut.

Retirez ensuite le tissu de la plaque basale sus-jacente à environ trois millimètres de la surface. Disséquez une plombine COTA à la fois, en évitant la plaque choriale, et recueillez le tissu villeux dans un bécher de 250 millilitres avec une solution saline. Ensuite, utilisez une solution saline stérile à 0,9 % et une pince pour rincer le tissu plusieurs fois dans un bécher séparé en tournant à l’aide du bécher d’un litre pour les déchets liquides.

Transférez un codi plombin à la fois dans une boîte de Pétri de 150 millimètres. Tenez avec une pince et utilisez une lame de rasoir pour gratter le tissu des vaisseaux sur une boîte de Pétri. Placez le tissu gratté dans un bécher séparé contenant 0,9 % de solution saline stérile.

Répétez l’opération pour tous les morceaux de tissu. Après avoir rincé le tissu gratté dans la dissociation cellulaire cve, égouttez-le de l’excès de liquide et de poids pour digérer le tissu placentaire. Après avoir préparé le mélange de digestion des tissus, divisez le tissu en transférant 60 grammes de l’ensemble des tissus collectés dans une fiole Helen Meyer stérile de 500 millilitres.

Ajouter le mélange de digestion des tissus dans le flacon contenant le tissu et incuber à 37 degrés Celsius dans un agitateur pendant 45 minutes. À 150 tr/min pour recueillir les cellules dissociées après l’incubation et en inclinant le ballon pour permettre au tissu de se déposer. Récupérez le super natin.

Veiller à ne pas prélever de tissus dissociés de l’UND. Ajouter une quantité égale de HBSS au surnageant avant de transférer dans des tubes à centrifuger stériles de 15 millilitres. Répéter la dissociation et la collecte du surnageant avec les parties restantes de tissu associé à l’UND pour chaque lot après la centrifugation à 1000 fois.

La gravité pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius aspire le surnageant sans perturber la pastille. Les cellules des villosités placentaires se trouvent principalement dans la partie blanche de la pastille recouvrant les globules rouges. Transférez les cellules villaires de la partie blanche de la pastille dans un tube à centrifuger conique stérile de 50 millilitres et conservez-les sur de la glace.

Après avoir collecté les cellules des trois étapes de digestion, utilisez une passoire à cellules en nylon de 100 microns insérée dans le haut d’un tube de centrifugation conique stérile de 50 millilitres pour filtrer la suspension. Si la filtration de la suspension de la cellule ralentit, soulevez le filtre vers le haut pour aspirer un vide à l’intérieur du tube, centrifugez-le à quatre degrés Celsius et 1000 fois la gravité pendant 10 minutes. Retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille pour homogénéiser les cellules des villosités placentaires à l’aide d’un milieu de lyse hypotonique ou HLM fraîchement préparé dans une hotte de sécurité biologique, ajoutez quatre fois le volume de la pastille de cellules de HLM glacée aux cellules.

Utilisez une pipette de 10 millilitres pour réhydrater doucement et soigneusement. Suspendez les cellules en les pipetant de haut en bas. Après avoir incubé les cellules sur de la glace pendant 10 minutes, transférez-les dans un homogénéisateur glacé et homogénéisez lentement les cellules avec le pilon amovible en appliquant 20 à 25 mouvements doux.

Faites tourner le lysat à 3000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour retirer les cellules non brisées. Ensuite, collectez le surnageant dans un nouveau tube avant de tourner à nouveau à 25 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour éliminer les mitochondries afin d’isoler les gouttelettes lipidiques par ultracentrifugation, collectez la super natine dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.

Ajuster à 20 % de saccharose et transférer dans le fond d’un tube d’ultracentrifugeuse pour un rotor S SW 28 ou une superposition équivalente du super natin ajusté à la densité avec environ 10 millilitres de glace froide, 100 millimolaires de tampon de carbonate de sodium et 0,5 à un millilitre de HLM glacé pour remplir le tube à l’aide d’une centrifugeuse à rotor à godet oscillant S SW 28 à 130, 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Ensuite, récupérez la couche flottante, ajustez-la à 10 % de saccharose et transférez-la au fond d’un tube d’ultracentrifugation de 13,2 millilitres pour un rotor SW 41 TI ou une superposition équivalente du surnageant ajusté en densité avec environ cinq millilitres de froid glacé, 100 millimolaires de tampon de carbonate de sodium et 0,5 millilitre de HLM glacé après centrifugation à 274, 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. Dans un rotor SW 41 TI, utilisez une pipette d’un millilitre pour prélever soigneusement la couche flottante supérieure contenant des gouttelettes de lipides.

Ajustez le volume à 10 % de saccharose et transférez à nouveau dans un tube ultracentrifuge de 13,2 millilitres avant de superposer avec cinq millilitres de glace froide, 100 millimolaires de carbonate de sodium tampon et 0,5 millilitre de HLM glacé. Après une centrifugation de 30 minutes, à l’aide d’une pipette en PE courbée, prélevez soigneusement la couche flottante supérieure de couleur blanche contenant les gouttelettes de lipides dans trois tubes de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de HLM. Caractériser les gouttelettes lipidiques selon le protocole de texte comme le montre cette figure, la présence de gouttelettes lipidiques isolées à partir de cellules de villosités placentaires humaines a été vérifiée par coloration avec un colorant de fluorescence spécifique lipidique neutre boda P 4 93 5 0 3 et visualisée à l’aide de la microscopie à fluorescence.

La pureté des fractions de gouttelettes lipidiques isolées a été évaluée par western blot avec des protéines marqueurs pour les gouttelettes lipidiques qui comprenaient la para lippine deux calnexine pour le re, le marqueur goi, GM un 30 CO X quatre pour les mitochondries et la membrane plasmique, MEK un. Après délabrement, les gouttelettes lipidiques sont recouvertes d’acétone froide et les protéines extraites. Les fractions ont été soumises à un western blot para lipin.

Deuxièmement, la protéine des gouttelettes lipidiques a été détectée dans le surnageant postnucléaire et dans la couche flottante blanche isolée contenant des gouttelettes lipidiques. Les protéines spécifiques des membranes plasmiques telles que MK one et GM one 30 n’ont pas été détectées dans les fractions de gouttelettes lipidiques dans l’une ou l’autre des couches sous la couche flottante pour le spin quatre et le spin cinq. Comme indiqué précédemment, la protéine calnexine et une faible coloration de la protéine de membrane mitochondriale CO X quatre ont été détectées ailleurs dans la fraction des gouttelettes lipidiques.

Ces résultats sont cohérents avec des rapports antérieurs montrant que les gouttelettes lipidiques interagissent avec les mitochondries dans les cellules de mammifères et avec le RE r. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que les méthodes protéomiques et lipidomiques peuvent être effectuées pour étudier des questions supplémentaires telles que les facteurs liés aux gouttelettes.