Injection intra-lymphatique de particules de polymère biodégradables

L'objectif général de cette procédure est d'injecter directement des particules vaccinales à base de biomatériaux dans les ganglions lymphatiques à l'aide d'une technique d'injection directe. Tout d'abord, synthétisez les particules polymériques stabilisées par des lipides en utilisant une méthode d'émulsion double. Ensuite, lavez les particules et mesurez leurs propriétés physiques telles que la taille, la charge, le taux de chargement ou la stabilité.

Ensuite, administrer un colorant traceur à la base de la queue de la souris afin de permettre sa visualisation après drainage vers le ganglion lymphatique. La dernière étape consiste à identifier le ganglion lymphatique marqué par le colorant D et à injecter un petit volume de particules polymériques à cet endroit. L'histologie, l'immunofluorescence et la microscopie confocale peuvent être utilisées pour confirmer la présence et la distribution des particules dans les ganglions lymphatiques inguinaux.

La combinaison de l'injection directe dans les ganglions lymphatiques avec des biomatériaux pour la vaccination permet un contrôle précis des combinaisons et des doses des composants du vaccin dans le microenvironnement ganglionnaire, et autorise une libération contrôlée des charges utiles dans ces tissus. Tous les vaccins doivent atteindre les ganglions lymphatiques pour être efficaces. Ainsi, définir comment les biomatériaux et les signaux immunitaires intégrés influencent la signalisation locale dans les ganglions lymphatiques est essentiel pour relier ces événements à la réponse immunitaire systémique.

Ces connaissances nous aideront à mieux comprendre le fonctionnement des vaccins à base de biomatériaux administrés selon les voies traditionnelles. Bien que l'administration intra-ganglionnaire de biomatériaux constitue un outil pour étudier les effets de ces derniers sur l'organisation des ganglions lymphatiques, cette plateforme offre également une opportunité appliquée de développer de nouveaux vaccins thérapeutiques et immunothérapies ciblant le cancer et les troubles auto-immuns. Pour les microparticules, effectuer une sonication de la phase organique contenant le polymère, les lipides et les autres composants insolubles dans l'eau, sur glace à 12 watts.

Pour créer l'émulsion eau et huile, ajoutez 500 microlitres d'eau distillée H2O ou d'H2O contenant un milligramme de peptide protéique ou d'un autre composé hydrosoluble. Poursuivez l'agitation pendant 30 secondes. Secouez doucement le flacon de haut en bas et de côté à côté autour de la pointe du vortex afin d'assurer une émulsification complète.

Préparez maintenant l’eau et l’émulsion d’huile dans l’eau en versant l’émulsion huile dans eau dans 40 millilitres d’H2O homogénéisés pendant trois minutes à 16 000 tr/min. Ajoutez ensuite une barre magnétique et agitez l’émulsion d’eau et d’huile dans l’eau toute la nuit pour éliminer le solvant en excès après une évaporation nocturne du solvant. Versez l’émulsion à travers un tamis filtrant en nylon de 40 microns dans un tube conique de 50 millilitres, centrifugez pendant cinq minutes, décantez le surnageant, resuspendez le culot de particules dans un millilitre d’eau et transférez les particules en suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Recueillir les particules par une centrifugation de cinq minutes. Mesurer la taille des particules par diffraction laser ou diffusion de la lumière. Vérifier que le volume d'eau ajouté à la cellule de fractionnement est suffisant pour l'alignement et le zéro. Prélever 10 microlitres de suspension de particules à l'aide d'une pipette et les introduire dans la cellule de fractionnement.

Fermer la porte du compartiment de l'analyseur de taille de particules. Ensuite, mesurer la taille des particules pour le PLGA. Utiliser un indice de réfraction de 1,60.

Utilisez l'interface logicielle pour calculer le diamètre des particules selon une base numérique un jour avant l'injection. Anesthésiez la souris conformément à un protocole animal approuvé par l'IACUC. Évaluez la profondeur de l'anesthésie à l'aide d'un pincement de l'orteil.

Effectuez des tests du réflexe de pincement et surveillez la respiration afin d'assurer une fréquence respiratoire de 100 à 120 mouvements par minute. Rasez les poils à la base de la queue et au niveau de la partie postérieure. Retirez les poils du côté ventral de l'animal et latéralement jusqu'au côté dorsal juste au-dessus de l'articulation de la patte arrière.

Pour chaque injection de colorant, utilisez une micropipette pour transférer 10 microlitres de solution de colorant dans un tube microcentrifuge et aspirez la totalité des 10 microlitres à l’aide d’une aiguille de calibre 31 dans une seringue à insuline d’un millilitre. Injectez ensuite 10 microlitres de solution de colorant par voie sous-cutanée de chaque côté de la base de la queue pour le chargement entre les injections. Appliquez une crème dépilatoire douce pour éliminer les poils résiduels.

Veillez à enduire la zone située entre la patte arrière et l'abdomen. Après trois minutes, utilisez une main gantée humide avec de l’eau chaude H₂O et frottez délicatement la crème dépilatoire sur la peau. Répétez immédiatement pour éliminer l’excès de crème dépilatoire.

Ensuite, humidifiez un chiffon doux ou une serviette en papier avec de l’eau tiède et essuyez d’un seul mouvement la partie inférieure de la souris. Placez la souris sous une lampe chauffante pour qu’elle se rétablisse, puis remettez-la en observation pendant au moins 12 heures. Examinez la souris anesthésiée afin de confirmer le drainage du traceur ou du colorant vers chaque ganglion lymphatique inguinal.

Le ganglion lymphatique doit être visible comme une tache sombre près de la cuisse postérieure et de l'abdomen. Resuspendre maintenant les particules dans de l'eau distillée à la concentration d'injection souhaitée pour chaque injection. Utiliser une micropipette pour transférer 10 microlitres de solution de particules dans un tube de microcentrifugation.

Aspirez entièrement les 10 microlitres dans une aiguille à insuline de calibre 31 fixée à une seringue d'un millilitre. Tendez la peau autour du ganglion lymphatique coloré avec l'aiguille à un angle de 90 degrés par rapport à la peau. Pénétrez la peau sur une profondeur d'un millimètre.

Injecter lentement tout le volume en surveillant un éventuel agrandissement visible des ganglions lymphatiques. Laisser la souris se remettre sous une lampe chauffante, puis la ramener en condition d'élevage ou effectuer des tests supplémentaires. Tout d'abord, confirmer la synthèse des particules et leur distribution en taille.

Le protocole de synthèse par évaporation du solvant dans une émulsion peut être évalué qualitativement par inspection visuelle des émulsions générées. Les émulsions doivent former une suspension homogène, sans agrégats visibles. La distribution de la taille des particules peut être confirmée par diffraction laser ou par diffusion dynamique de la lumière ; les échantillons de particules doivent présenter une distribution unimodale.

Une évaluation qualitative supplémentaire de la synthèse des particules peut être réalisée en modifiant le protocole afin d'incorporer un ou plusieurs cargaisons fluorescentes, telles qu'un peptide fluorescent ou un colorant lipophile. Le colorant peut être utilisé pour localiser et cibler le ganglion lymphatique en vue d'une injection de particules. Pendant l'entraînement, les souris peuvent être euthanasiées et une nécropsie peut être effectuée après l'injection du colorant afin de se familiariser avec l'emplacement des ganglions lymphatiques. La distribution des particules au sein des zones T et B du ganglion lymphatique infecté est confirmée par microscopie confocale de ganglions lymphatiques sectionnés et colorés.

Des différences dans les propriétés des particules, comme la taille, peuvent être observées dans les ganglions lymphatiques après injection et imagerie par microscopie de fluorescence. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours. La synthèse des particules et la préparation des animaux ont lieu le premier jour. Le lavage des particules, leur caractérisation et l'injection intra-ganglionnaire sont effectués le deuxième jour.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment une trace ou un colorant peut être utilisé pour visualiser et injecter les ganglions lymphatiques inguinaux de souris. Cette technique permet une administration non chirurgicale de vecteurs vaccinaux à base de biomatériaux directement dans le ganglion lymphatique, avec un niveau de contrôle qui n'était pas possible auparavant. L'administration directe de biomatériaux dans les ganglions lymphatiques permettra aux scientifiques et ingénieurs en immunologie et en développement vaccinal d'explorer les interactions fondamentales entre les vaccins à base de biomatériaux, les signaux immunitaires et le ganglion lymphatique, éclairant ainsi d'un jour nouveau les mécanismes par lesquels ces matériaux stimulent et modulent l'immunité.