Injection intra-lymphatique de particules de polymère biodégradables

L’objectif global de cette procédure est de déposer des particules de vaccin en biomatériau dans les ganglions lymphatiques en utilisant une technique d’injection directe. Tout d’abord, synthétisez les particules de polymère stabilisées aux lipides à l’aide d’une méthode à double émulsion. Ensuite, lavez les particules et mesurez les propriétés du matériau telles que la taille, la cargaison, le chargement ou la stabilité.

Ensuite, administrez un colorant traceur à la base de la queue de la souris pour permettre la visualisation après le drainage du colorant vers le ganglion lymphatique. La dernière étape consiste à identifier le ganglion lymphatique marqué D et à injecter un petit volume de particules de polymère à cet endroit. L’histologie, l’immunofluorescence et la microscopie confocale peuvent être utilisées pour confirmer la présence et la distribution des particules dans les ganglions lymphatiques inguinaux.

La combinaison de l’injection directe de ganglions lymphatiques avec des biomatériaux pour la vaccination permet un contrôle strict des combinaisons et des doses de composants du vaccin dans le microenvironnement des ganglions lymphatiques, et permet une libération contrôlée de la cargaison dans ces tissus. Tous les vaccins doivent atteindre les ganglions lymphatiques pour être efficaces. Il est donc important de définir l’impact des biomatériaux et des signaux immunitaires incorporés sur la signalisation des ganglions lymphatiques locaux pour relier ces événements à la réponse immunitaire systémique.

Ces connaissances nous aideront à mieux comprendre le fonctionnement des biomatériaux administrés par les vaccins selon les voies traditionnelles. Bien que l’administration de biomatériaux intraganglionnaires serve d’outil pour étudier les effets des biomatériaux sur l’organisation des ganglions lymphatiques, cette plateforme offre également une opportunité appliquée pour développer de nouveaux vaccins thérapeutiques et immunothérapies ciblant le cancer et les maladies auto-immunes. Pour les microparticules sonicées, la phase organique contenant le lipide polymère et d’autres cargaisons insolubles dans l’eau sur la glace à 12 watts.

Pour créer l’émulsion d’eau et d’huile, ajoutez 500 microlitres de H2O ou H2O distillé contenant un milligramme de protéine peptidique ou d’une autre cargaison soluble dans l’eau. Continuez à forniquer pendant 30 secondes. Balancez doucement le flacon de haut en bas d’un côté à l’autre autour de l’embout de l’ator pour assurer une émulsification complète.

Préparez maintenant l’émulsion d’eau et d’huile dans l’eau en versant l’émulsion d’eau et d’huile dans 40 millilitres de H2O homogénéisé pendant trois minutes à 16 000 tr/min. Ensuite, ajoutez une barre d’agitation magnétique et mélangez l’eau et l’huile dans l’émulsion d’eau pendant la nuit pour éliminer l’excès de solvant après l’élimination du solvant pendant la nuit. Versez l’émulsion à travers une passoire à mailles de nylon de 40 microns dans une centrifugeuse à tube conique de 50 millilitres pendant cinq minutes, décantez le surnageant, remettez en suspension la pastille de particules dans un millilitre d’eau et transférez les particules en suspension dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Recueillir les particules par une centrifugation de cinq minutes. Mesurez la taille des particules par diffraction laser ou diffusion de la lumière. Lorsque le volume d’eau ajouté à la cellule de fraction est à un niveau suffisant pour l’alignement et le découpage de la pipette de 10 microlitres de suspension de particules dans la cellule de fraction.

Fermez la porte du compartiment de l’analyseur de taille de particules. Mesurez ensuite la taille des particules pour le PLGA. Utilisez un indice de réfraction de 1,60.

Utilisez l’interface du logiciel pour calculer le diamètre des particules à l’aide d’un nombre un jour avant l’injection. Anesthésie la souris selon un protocole animal approuvé par l’iaucic. Évaluez la profondeur de l’anesthésie avec un orteil.

Tests de réflexe de pincement et surveillance de la respiration pour assurer une fréquence respiratoire de 100 à 120 respirations par minute. Rasez les poils à la base de la queue et à l’arrière-train. Retirez les poils de la face ventrale de l’animal et latéralement autour de la face dorsale juste au-dessus de l’articulation de la patte arrière.

Pour chaque injection de colorant, utilisez une micro-pipette pour transférer 10 microlitres de solution de colorant dans un tube de fuge microcentral et aspirez les 10 microlitres entiers à travers une aiguille de calibre 31 dans une seringue à insuline d’un millilitre. Injectez maintenant 10 microlitres de solution de colorant par voie sous-cutanée de chaque côté de la base de la queue pour le chargement entre les injections. Appliquez une crème dépilatoire douce pour enlever les poils restants.

Assurez-vous d’enduire la zone entre la patte arrière et l’abdomen. Après trois minutes, utilisez une main gantée humide avec un H chaud deux oh et frottez doucement la crème dépilatoire sur la peau. Répétez immédiatement l’opération pour éliminer l’excédent d’épilatoire.

Ensuite, mouillez un chiffon doux ou une serviette en papier avec de l’eau tiède et essuyez d’un seul mouvement la partie inférieure de la souris. Placez la souris sous une lampe chauffante pour récupérer, puis remettez-la en place pendant au moins 12 heures. Examinez la souris anesthésiée pour confirmer le drainage de traces ou de colorants dans chaque ganglion lymphatique inguinal.

Le ganglion lymphatique doit être visible sous la forme d’une tache sombre près de l’arrière de la cuisse et de l’abdomen. Maintenant, remettez les particules en suspension dans de l’eau distillée à la concentration d’injection souhaitée pour chaque injection. À l’aide d’une micro-pipette, transférez 10 microlitres de solution de particules dans un micro-tube de centrifugation.

Aspirez les 10 microlitres entiers dans une aiguille à insuline de calibre 31 attachée à une seringue d’un millilitre. Tirez la peau tendue autour du ganglion lymphatique teint avec l’aiguille à un angle de 90 degrés par rapport à la peau. Pénètre dans la peau jusqu’à une profondeur d’un millimètre.

Injectez lentement tout le volume en surveillant l’élargissement visible des ganglions lymphatiques. Laissez la souris récupérer sous une lampe chauffante, puis remettez-la en position ou effectuez des tests supplémentaires. Tout d’abord, confirmez la synthèse des particules et la distribution granulométrique.

Le protocole de synthèse par évaporation par évaporation du solvant d’émulsion peut être évalué qualitativement par inspection visuelle des émulsions finales. Generated. Les émulsions doivent être une suspension homogène exempte d’agrégats visibles. La distribution granulométrique des pièces peut être confirmée par diffraction laser ou diffusion dynamique de la lumière, les échantillons de particules doivent présenter une distribution monomodale.

Une évaluation qualitative plus poussée de la synthèse des particules peut être réalisée en modifiant le protocole pour incorporer une ou plusieurs cargaisons fluorescentes, telles qu’un peptide fluorescent ou un colorant lipophile. Le colorant peut être utilisé pour localiser et cibler le ganglion lymphatique pour l’injection de particules Pendant l’entraînement, les souris peuvent être euthanasiées et nécropsies après l’injection du colorant pour se familiariser avec l’emplacement des ganglions lymphatiques. La distribution des particules dans les zones de cellules T et B du ganglion lymphatique infecté est confirmée par la microscopie confocale des ganglions lymphatiques sectionnés et colorés.

Des différences dans les propriétés des particules, telles que la taille, peuvent être observées dans les ganglions lymphatiques après l’injection et l’imagerie par microscopie à fluorescence Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en l’espace de deux jours. La synthèse des particules et la préparation des animaux ont lieu le premier jour. La caractérisation du lavage des particules et l’injection intraganglionnaire sont effectuées le deuxième jour.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont une trace ou un colorant peut être utilisé pour visualiser et injecter les ganglions lymphatiques inguinaux de souris. Cette technique permet l’administration non chirurgicale de porteurs de vaccins en biomatériaux directement dans le ganglion lymphatique avec un niveau de contrôle qui n’était pas possible auparavant. L’administration directe de biomatériaux par les ganglions lymphatiques permettra aux scientifiques et aux ingénieurs, ainsi qu’à l’immunologie et au développement de vaccins, d’explorer les interactions fondamentales des biomatériaux, des vaccins et des signaux immunitaires avec les ganglions lymphatiques, jetant ainsi un nouvel éclairage sur les mécanismes par lesquels ces matériaux stimulent et façonnent l’immunité.