Name: Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Apprenez à visualiser les sous-domaines du réticulum endoplasmique dans les cellules cultivées par imagerie confocale et microscopie électronique. Cette méthode révèle la mobilité des protéines fluorescentes et leur impact sur l'architecture cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs sont reconnaissants à Fondazione Filarète pour son aide et son appui à la publication de cet article. Nous tenons également à remercier Centro Europeo di Nanomedicina pour l&#39;utilisation du microscope électronique à transmission TECNAI G2.

Une. Plasmide, culture cellulaire, et transfection avec ER protéines fluorescentes <ol><li> Le plasmide utilisé dans cette étude est constitué d&#39;une version améliorée de la GFP fusionnée à son extrémité C-terminale de la région de la queue de l&#39;isoforme d&#39;ER de rat cytochrome b (5) (abrégé ici en tant que b (5)) par l&#39;intermédiaire d&#39;une séquence de liaison. La région de queue contient la séquence entière (Pro94-Asp134) qui reste associée à la membrane après le clivage par la trypsine de b natif (5), y compris la DMT de 17 résidus (domaine transmembranaire), flanqué par des séquences polaires amont et aval (UPS et DPS) . Le lieur est constitué de l&#39;épitope myc suivi de [(Gly) 4 Ser] 3, et l&#39;ensemble de l&#39;ADNc est inséré dans les sites Hind3-Xba1 du vecteur d&#39;expression de mammifère pcDNA3. Les détails de la construction de ce plasmide ont été décrites dans une publication antérieure dans laquelle elle est désignée comme la GFP-ER 16. </li><li> Cultivez cellules COS-7 en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% fetal de sérum bovin, 2 mM de L-glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine dans un incubateur à 37 ° C et 10% de CO 2. </li><li> Transfection. La plaque 3 x 10 5 cellules sur une lamelle de verre ronde dans une plaque à 6 puits et, le jour suivant, transfecter avec le système JetPEI comme décrit par le fabricant. A noter que le rapport optimal JetPEI / ADN a été testé afin de déterminer l&#39;efficacité de transfection maximale en fonction du plasmide et la lignée cellulaire utilisée: dans notre cas, une JetPEI: rapport d&#39;ADN de 2:1 conduit à 70-80% de l&#39;efficacité de transfection. </li></ol> 2. Direct fluorescence microscopie confocale à balayage <ol><li> Imagerie des cellules vivantes. Placer la lamelle sur laquelle les cellules transfectées ont été ensemencées dans une chambre de cellule de la culture de l&#39;acier pour 24 mm lamelles remplis avec du DMEM w / o rouge de phénol, complété avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine, 25 mM d&#39;HEPES , 50 ug / ml de cycloheximide et 1:100 OxyFluor pour empêcher les échantillons de photoblanchiment. Un microscop SP5 confocalee équipé d&#39;un incubateur à CO2 à température contrôlée (37 ° C et 5% CO 2) est utilisé pour des expériences d&#39;imagerie des cellules vivantes, avec d GFP-ER étant visualisé en utilisant un laser à 488 nm et d&#39;un filtre 525/50 passe de la bande d&#39;émission. </li><li> récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Dessiner une région d&#39;intérêt (ROI), correspondant à une structure OSER, et blanchir à l&#39;aide de 20 itérations et une combinaison de 488 nm (100% d&#39;un laser Argon 30 mW, ce qui correspond à 5,5-6 mW à l&#39;échantillon) et 405 nm (60% de 30 mW Diode laser 405, correspondant à 11,6 mW à l&#39;échantillon) lasers qui, dans notre expérience, conduit à photoblanchiment efficace et rapide. </li><li> Enregistrer la reprise de la fluorescence dans les régions d&#39;intérêt blanchis en prenant une seule image toutes les 10 secondes pendant 10 minutes (temps de pixel = 1,61 ps / px). </li><li> perte de fluorescence dans photoblanchiment (FLIP). Dessinez un retour sur investissement correspondant à une structure OSER, et l&#39;eau de Javel comme décrit ci-dessus. Le blanchiment est répété toutes les 30 secondes,et les images post-blanchiment sont enregistrées toutes les 10 secondes pendant 30 minutes (temps de pixel = 1,61 ps / px). </li><li> FRAP et FLIP analyse. Toutes les images sont analysées en utilisant le logiciel ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). Dans les expériences de FRAP, la récupération de la fluorescence de la ROI blanchie est mesurée au cours du temps et normalisées par rapport à la fluorescence totale des cellules blanchie, qui est toujours contrôlée pour être constante dans le temps. </li><li> Pour les expériences de FLIP, tirer un retour sur investissement en dehors de l&#39;OSER blanchi et couvrant l&#39;ensemble de la cellule. Mesurer l&#39;intensité de la fluorescence au cours du temps et à normaliser les niveaux de fluorescence d&#39;un retour sur investissement tirés sur une cellule non blanchie afin de corriger toute diminution de la fluorescence provoquée par la formation d&#39;image lui-même. </li><li> Dans toutes les expériences, soustrait le signal de fond (déterminé dans une zone à l&#39;extérieur des cellules) à partir des intensités de fluorescence des régions d&#39;intérêt. Enfin, tracer les résultats en utilisant Gr.aphPad logiciel Prism. </li></ol> 3. Ultrastructurale Analyse par microscopie électronique à transmission Compte tenu de la toxicité de la plupart des réactifs, toutes les procédures devraient être effectuées portant un laboratoire approprié. manteau et des gants sous une hotte. <ol><li> Après élimination de la lamelle de la boîte de Pétri, fixer les cellules cultivées restantes sur le fond de la cuvette en monocouche en utilisant filtré 2% de glutaraldéhyde dans 0,1 M de tampon cacodylate, pH 7,4, pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Grattez les cellules en utilisant un grattoir en téflon et les transférer dans 1,5 ml tubes Eppendorf. Sédimenter les cellules par centrifugation à 9000 g pendant 10 min. Retirer le surnageant, ajouter du fixateur frais, et laisser une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les pastilles avec le tampon, puis post-fixation avec une solution de tétroxyde d&#39;osmium à 1% dans du tampon cacodylate pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincer à l&#39;eau MilliQ, et en bloc tache avec1% d&#39;acétate d&#39;uranyle dans de l&#39;eau distillée pendant entre 20 à 60 min. </li><li> Déshydrater les échantillons en série croissante d&#39;éthanol (70%, 80%, 90%, 100% et 100% pendant 10 min chacun), et le laver deux fois brièvement dans de l&#39;oxyde de propylène (15 min chacun). </li><li> Infiltrer les échantillons dans un mélange d&#39;oxyde de propylene + Epon (1:1) (à partir de 2 h à une nuit). </li><li> Incorporer dans une résine époxy Epon durci à 60 ° C pendant au moins 24 h. </li><li> Section des blocs de résine taillés manuellement à l&#39;aide d&#39;un ultramicrotome LEICA UC6 équipé d&#39;un couteau de diamant de 45 ° pour obtenir sections d&#39;une épaisseur de 60-70 nm. Recueillir les sections sur les 300 mailles des grilles de cuivre. </li><li> Colorer les sections sur la grille avec une solution saturée d&#39;acétate d&#39;uranyle (20 min) et du citrate de plomb (7 min), bien se laver les grilles en les plongeant dans de l&#39;eau filtrée bi-distillée, et laissez-les sécher à température ambiante. </li><li> Les grilles colorées sont observées en utilisant un microscope électronique à transmission TECNAI G2, et les images sont capturées en utilisant un Bottcaméra CCD om-monté à différents grossissements finales (allant généralement de 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les protocoles et les méthodes d&#39;imagerie décrites dans le présent document ont été utilisées pour étudier la distribution et la mobilité des transfectées TA protéines fluorescentes résidents dans le RE de cellules vivantes. Nous avons également analysé l&#39;effet de l&#39;expression excessive de ces protéines sur l&#39;architecture de ce compartiment sous-cellulaire à l&#39;aide d&#39;analyses ultrastructurales. La combinaison de cellules vivantes imagerie confocale et la microscopie é...

La découverte de la protéine verte fluorescente (GFP) et ses variantes spectrales, et le développement parallèle de la microscopie à fluorescence, ont ouvert complètement nouvelles avenues pour la recherche sur le comportement des protéines dans les cellules. Des techniques telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence dans photoblanchiment (FLIP), qui sont possibles en raison de la capacité intrinsèque de fluorophores à éteindre leur fluorescence sous éclairage intense, sont basées sur l&#39;imagerie des cellules vivantes confocale et l&#39;utilisation de transfectées des protéines de fusion fluorescente 3.1. Ils sont largement utilisés pour évaluer non seulement la localisation des protéines, mais aussi leur mobilité et le transport vésiculaire, qui peut révéler des indices importants concernant leur fonction 4. La caractéristique unique des cellules eucaryotes est la présence de compartiments intracellulaires qui ont des compositions lipidiques et protéiques spécifiques. Bien que les organites sont physiquement isolated, ils doivent communiquer entre eux et partager des composants moléculaires, afin de maintenir l&#39;homéostasie cellulaire. La voie de sécrétion garantit que les protéines et les lipides synthétisés dans le RE atteindre la destination finale correcte dans laquelle ils exercent leur fonction. Organites intracellulaires peuvent également être reliés par des sites de contact dynamiques qui permettent aux molécules (lipides) pour être directement échangés entre les compartiments. En outre, de nombreuses protéines ont de grands complexes assemblés dans hétéromériques ou associé avec des espèces lipidiques spécifiques (radeaux lipidiques / microdomaines) afin de devenir fonctionnellement active ou être transportés vers leur destination finale. Tous ces aspects biologiques influencent fortement les propriétés cinétiques des protéines, et peuvent donc être étudiés de façon appropriée au moyen des techniques décrites ci-dessous. Notre groupe a largement utilisé FRAP et FLIP combinée avec la microscopie électronique pour étudier l&#39;architecture de l&#39;urgence et de ses différents sousdomaines. L&#39;ER est la première station de la voie de sécrétion et joue un rôle clé dans les protéines et les lipides de tri 5. Il est un organite très dynamique dont les sous-domaines distincts refléter ses nombreuses fonctions différentes (c&#39;est à dire des protéines et des lipides de biosynthèse et de la traite, le repliement des protéines, Ca 2 + stockage et la libération, et le métabolisme des xénobiotiques). Cependant, même si elles sont morphologiquement, spatialement et fonctionnellement distinctes, ces domaines sont continus les uns avec les autres, et leur abondance relative peuvent être modifiées dans des cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les plus connus et les domaines généralement spatialement distincts de l&#39;ER sont l&#39;enveloppe nucléaire, et le RE lisse et rugueux, mais nous et d&#39;autres avons démontré qu&#39;il existe des structures ER avec une architecture plus élaborée et organisation tridimensionnelle dans divers types de cellules et les tissus dans des conditions physiologiques qui peuvent également être induites par les moyens de stimuli stressants tels que l&#39;hypoxie, la drogueadministration, ou la sur-expression de protéines transmembranaires 2,6 ER-résident (et les références qui y sont). Nous avons récemment démontré la présence de telles structures dans des modèles cellulaires de maladies humaines 1,7. Originaire de la citernes empilées de RE lisse, ils ont reçu le nom collectif de réticulum endoplasmique lisse organisé (OSER) en 2003 6, mais ils sont également connus comme karmellae, lamelles, et cristalloïde ER sur la base de leur architecture qui, comme leur taille, peut varier. Après que les cellules sont transfectées avec la GFP fusionnée à la région de la queue cytosolique ancrée (TA) des protéines ER-résident (d EGFP-RE), la tendance à la dimérisation de la GFP dans faiblement trans altère considérablement l&#39;organisation et de la structure de l&#39;ER. FRAP et FLIP expériences ont montré que d EGFP-ER est libre de se diffuser à l&#39;intérieur OSER, et le fait qu&#39;il se déplace de l&#39;ER réticulaire à la OSER et vice versa &lt;/ Em&gt; indique que les agrégats sont en continuité avec l&#39;ER réticulaire environnante. L&#39;analyse ultrastructurale nous a permis de corréler les données de fluorescence avec une description détaillée de l&#39;architecture OSER et l&#39;organisation au niveau de l&#39;échelle nanométrique: OSER sont toujours constitués d&#39;empilements de citernes paires de RE lisse mais peuvent avoir différentes formes d&#39;organisation spatiale, tels que disposés régulièrement sinusoïdale tableaux ou des spirales, ou des tableaux tubulaires &quot;cristalloïdes&quot; hexagonaux. Ces réarrangements conduisent à des morphologies cubes 8 qui, comme ils l&#39;ont été trouvés dans les cellules dans des conditions physiologiques 9 et contraintes suivants tels que l&#39;hypoxie 10, traitement de la toxicomanie 11, et le cancer 9, peuvent avoir un potentiel important en tant que marqueurs ultrastructuraux. Après cette première démonstration en utilisant des protéines de fusion GFP, nous avons utilisé des expériences d&#39;imagerie pour analyser la prolifération des domaines de l&#39;urgence en réponse aux traitements pharmacologiques 12, assess la tendance des protéines fluorescentes pour oligomériser dans des cellules 13, et d&#39;enquêter sur le rôle d&#39;un mutant, protéines TA SLA liés à la formation d&#39;agrégats intracellulaires d&#39;origine ER qui peuvent être pertinents à son 1,8 de pathogénicité. Il a été suggéré que la formation d&#39;agrégats intracellulaires (ce qui se produit dans de nombreuses maladies neurodégénératives 14) peut être un mécanisme de protection destinée à empêcher les interactions entre les protéines mutantes toxiques et les composants de la cellule autour de 15. Ce qui suit est une description d&#39;une combinaison de méthodes de microscopie optique et électronique pour enquêter sur des constructions dont les C-terminal domaines hydrophobes sont insérés dans la membrane du RE, et une analyse de leur comportement dynamique et les effets de leur surexpression sur le domaine de l&#39;urgence l&#39;architecture à des cellules en culture (voir la figure 1 pour un organigramme du protocole expérimental).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM) sans rouge de phénol</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM solution</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde Grade I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate de sodium trihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium 4 % solution</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de propylène</td> légèrement radioactif <td>Sigma-Aldrich</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON embedding medium kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate </td><td>Microscopy Microscopy Science</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal spectral </td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Microscope Cage </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Couteau diamanté </td><td>Diatome</td><td>Ultra 45 &deg ;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre de cellule de culture en acier pour lamelle de 24 mm</td><td>Outils de bioscience</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Grilles de microscopie électronique</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Les lipides et des protéines dans les cellules eucaryotes sont continuellement échangés entre compartiments cellulaires, bien que ceux-ci conservent leur composition et les fonctions distinctif malgré le trafic interorganelle moléculaire intense. Les techniques décrites dans le présent document sont des moyens puissants de l&#39;étude des protéines et de la mobilité des lipides et le trafic in vivo et dans leur environnement physiologique. récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de la fluorescence dans photoblanchiment (FLIP) sont largement utilisés techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes pour étudier le trafic intracellulaire par l&#39;intermédiaire de la voie de l&#39;exo-endocytose, la continuité entre les organelles ou des sous-compartiments, la formation de complexes protéiques, et la localisation des protéines en microdomaines lipidiques, qui peut être observée dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les limites de ces approches sont principalement dues à l&#39;utilisation de protéines de fusion fluorescente, et leurs inconvénients potentiels comprennent un artefact sur-expression dans les cellules et la possibilité de différences dans le repliement et la localisation des protéines marquées et natives. Enfin, comme la limite de résolution de la microscopie optique (environ 200 nm) ne permet pas d&#39;enquête de la structure fine de l&#39;ER ou les sous-compartiments spécifiques qui peuvent provenir de cellules en situation de stress (c&#39;est à dire l&#39;hypoxie, l&#39;administration du médicament, l&#39;expression trop de transmembranaire protéines ER résidents) ou dans des conditions pathologiques, nous combinons l&#39;imagerie des cellules vivantes des cellules transfectées cultivées avec ultrastructurale analyse basée sur la microscopie électronique à transmission.

La figure 2 montre une étude d&#39;FRAP d&#39;exemple de la mobilité de la protéine. La mobilité de la protéine EGFP d-ER est démontrée par la récupération rapide de la fluorescence après photoblanchiment dans OSER blanchies. Pour l&#39;analyse quantitative, la mi-temps et fraction mobile ont été calculées à partir des données mesurées expérimentalement par ajustement de l&#39;équation monoexponentielle suivante: F (t) = F + poste (poste F rec-F)...

Nous décrivons des méthodes d&#39;imagerie nous utilisons pour étudier la distribution et la mobilité des protéines fluorescentes transfectées résidant dans le réticulum endoplasmique (RE) par l&#39;intermédiaire de l&#39;imagerie confocale de cellules vivantes. Nous analysons également ultrastructuralement l&#39;effet de leur expression sur l&#39;architecture de ce compartiment subcellulaire.

Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier la distribution et le déplacement des protéines fluorescentes transfectées dans le réticulum endoplasmique, ainsi que d'évaluer l'effet de leur expression sur l'architecture ultrastructurale. Pour ce faire, des cellules en culture sont transfectées de façon transitoire avec des protéines ancrées par leur extrémité C (tail-anchored) résidentes du RE, marquées par la GFP. Après la transfection, une imagerie confocale en cellules vivantes est réalisée afin d'évaluer la récupération de fluorescence après photobléachage (FRAP) et la perte de fluorescence.Dans la photodécoloration ou la technique « flip », l'analyse ultrastructurale est réalisée à l'aide de la microscopie électronique en transmission. Les données obtenues montrent que l'expression du construit B cinq marqué par la GFP modifie considérablement l'organisation et la structure du réticulum endoplasmique, induisant la formation d'agrégats. La méthode que nous démontrons ici peut fournir des informations sur les processus fondamentaux de la biologie cellulaire, tels que la mobilité et le trafic des protéines et des lipides.Il peut également être utilisé pour étudier les réponses aux traitements pharmacologiques afin d'évaluer la protéine fluorescente, la modernisation des oligos ou pour examiner le rôle des protéines mutantes pathogènes dans la formation d'agrégats intracellulaires d'origine, qui pourraient être liés à leur pathogénicité, comme dans la sclérose latérale amyotrophique. Le plasmide utilisé dans cette étude consiste en une version améliorée de la GFP fusionnée à son extrémité C à la région terminale de l'isoforme er du cytochrome B cinq de rat, par l'intermédiaire d'une séquence intermédiaire. La région terminale du B cinq contient la séquence complète qui reste associée à la membrane après clivage par la trypsine.Cela inclut le domaine transmembranaire de 17 résidus, encadré par des séquences polaires en amont et en aval. Le linker est composé de l'épitope M suivi de GLY quatre S3. L'ADNc entier est inséré dans les sites Hindi trois XO un du vecteur d'expression mammalien PC DNA trois. En préparation de la transfection, cultiver les cellules cost sept dans du DMEM supplémenté à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 la veille de la transfection ; le lendemain, semer trois fois 10 à la puissance cinq cellules sur des lamelles rondes de 24 millimètres dans une plaque à six puits.Transfectez les cellules avec le système jet PEI selon les instructions du fabricant, en utilisant un rapport jet PEI : ADN de deux contre un. Cela conduit généralement à une efficacité de transfection de 70 à 80 %. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant 24 heures avant l'imagerie. Ensuite, utilisez une pince pour transférer un lamelle recouvert de cellules transfectées dans la chambre d'imagerie.Replacer la boîte de culture tissulaire dans l'incubateur pour conserver les cellules restantes. Pour l'analyse ultrastructurale par microscopie électronique. Pour l'imagerie de cellules vivantes, ajouter deux millilitres de milieu d'imagerie dans une chambre de culture cellulaire en acier.Xi Fluor est inclus dans le milieu d'imagerie afin d'empêcher la décoloration photo-induite des échantillons. Les expériences doivent être réalisées en présence de smide, un inhibiteur de la traduction, afin d'éviter toute augmentation du signal de fluorescence A et, par conséquent, de la fluorescence totale due à la biosynthèse des protéines. Placez la chambre d'imagerie sur la platine d'un microscope confocal équipé d'un incubateur de CO2 à température contrôlée et de lasers adaptés, ainsi que de photomultiplicateurs réglés de manière appropriée pour effectuer la récupération de fluorescence.Après le photoblanchiment ou la frappe, mettez les cellules au point, puis réglez les paramètres d'acquisition afin d'éviter la saturation des pixels. Assurez-vous également que la puissance du laser est réglée au niveau le plus bas possible pour éviter un photoblanchiment dû à l'acquisition d'images. Une fois les paramètres d'imagerie définis, passez à un nouveau champ de vision contenant deux cellules ou plus.Une cellule dans chaque champ d'acquisition doit rester non photodégradée, afin de pouvoir normaliser le signal fluorescent de la ou des cellules photodégradées. Pour la photodégradation, dessinez une région d'intérêt ou ROI correspondant à un réticulum endoplasmique lisse organisé ou OSER.Configurer le programme d'acquisition pour effectuer un éclaircissement en utilisant un nombre suffisant d'itérations permettant un photoblanchiment efficace et rapide. Si nécessaire, une combinaison de lasers à 488 nanomètres et à 405 nanomètres peut être utilisée. Indiquer au logiciel d'acquérir une image unique toutes les 10 secondes pendant 10 minutes sur l'ensemble de l'expérience, incluant les périodes de pré-éclaircissement, d'éclaircissement et de récupération.Une fois que tout est prêt, initier la photodégradation et la capture. Lorsque la capture est terminée, passer à un nouveau champ de vision et répéter ce processus. Capturer quatre à cinq champs de vision pour chaque lamelle.Glissez à côté pour mesurer la perte de fluorescence lors du blanchiment photométrique ou du basculement. Indiquez au programme d'effectuer une séquence de blanchiment et d'acquisition d'images post-blanchiment pendant 10 secondes toutes les 30 secondes pendant 10 minutes, puis de passer à un nouveau champ de vision. Dessinez une région d'intérêt (ROI) correspondant à une structure OSER et lancez le blanchiment et l'acquisition comme précédemment pour l'analyse.Importez les images de frap et de flip dans le logiciel Image J. Évaluez d'abord la récupération de la fluorescence dans la ROI (région d'intérêt) photoblanchie en fonction du temps pour les expériences de frap, puis déterminez la fluorescence du fond en sélectionnant une zone située à l'extérieur des cellules et en mesurant son intensité moyenne au cours du temps. Ensuite, soustrayez le signal du fond des intensités fluorescentes des ROI.Normalisez les données par rapport à la fluorescence totale de la cellule photodétruite, qui doit rester constante au cours du temps. Ensuite, ajustez l'équation exponentielle mono-exponentielle indiquée ici, où F post est le signal fluorescent après la photodestruction, F rec est la valeur maximale de récupération de la fluorescence atteinte après la photodestruction, T est le temps final d'enregistrement et tau est le temps médian d'enregistrement.Pour l'analyse des expériences de flip, dessinez une région d'intérêt (ROI) à l'extérieur de l'OSER photoblanchi, couvrant l'ensemble de la cellule, et mesurez son intensité de fluorescence au cours du temps. Comme pour les expériences de frack, soustrayez le fond en utilisant une zone située à l'extérieur des cellules. Normalisez les données par rapport aux niveaux de fluorescence d'une ROI tracée sur une cellule non photoblanchie afin de corriger toute diminution de fluorescence provoquée par l'observation elle-même.Enfin, tracer les résultats à l'aide de GraphPad Prism ou d'un logiciel similaire. Plusieurs des réactifs utilisés pour préparer les échantillons en microscopie électronique sont toxiques. Par conséquent, les étapes suivantes doivent être réalisées en portant une blouse de laboratoire et des gants, et en travaillant sous une hotte aspirante.Après avoir retiré la lame de verre de la boîte de Pétri pour la microscopie optique, fixer les cellules restantes cultivées en monocouche au fond de la boîte pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’un racloir en téflon, détacher les cellules et les transférer dans des tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre ; faire précipiter les cellules par centrifugation à 9 000 ×g pendant 10 minutes. Après la centrifugation, éliminer le surnageant, ajouter du fixatif frais et laisser toute la nuit à quatre degrés Celsius.Lavez les culots en aspirant délicatement le fixateur à l’aide d’une pipette Pasteur et en ajoutant du tampon Cate. Pour éviter de perturber le culot, laissez le tampon s’écouler le long de la paroi du tube lors de son ajout. Aspirez la solution de lavage et effectuez la post-fixation en ajoutant les cellules dans une solution d’osmium tétraoxyde à 1 % dans du tampon Cate pendant une heure à température ambiante.Ensuite, rincer avec de l'eau Milli Q et ajouter directement dans le tube de microcentrifugation de l'acétate d'urane à 1 % dans de l'eau distillée. Débloquer la coloration pendant 20 minutes à une heure, déshydrater les échantillons dans une série croissante d'éthanol composée de 70 %, 80 %, 90 %, 100 % et à nouveau 100 % pendant 10 minutes chacun. Puis laver les pastilles deux fois dans de l'oxyde de propylène pendant 15 minutes à chaque fois.Imprégnez les échantillons en remplaçant l'oxyde de propylène par le mélange un-à-un d'oxyde de propylène et d'Epon, puis incubez pendant au moins deux heures, voire toute la nuit. Ensuite, pour inclure les échantillons, placez les fragments de culot cellulaire dans des moules d'inclusion préremplis de résine époxyde Epon, et polymérisez à 60 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Le lendemain, montez le bloc de résine sur un ultramicrotome équipé d'un couteau en diamant à 45 degrés.À l’aide d’un couteau de découpe, découper manuellement les blocs de résine afin d’éliminer les parties du bloc dans lesquelles l’échantillon inclus n’est pas présent. Ensuite, à l’aide du microtome ultraplatin, obtenir des sections de 60 à 70 nanomètres. Ramasser les sections sur des grilles en cuivre de 300 mesh afin de procéder à la coloration des sections.Placer les grilles sur des gouttes de 30 microlitres d'une solution saturée d'uréate d'acétate et incuber pendant 20 minutes. Rincer ensuite trois fois dans de l'eau Milli-Q et réincuber les grilles sur de petites gouttes de citrate de plomb pendant sept minutes. Après l'incubation, laver soigneusement les grilles en les immergeant dans de l'eau Milli-Q et les laisser sécher à température ambiante.Observer les grilles colorées à l'aide d'un microscope électronique en transmission et capturer les images à l'aide d'une caméra CCD montée en bas, avec un grossissement final compris entre 6 000 et 39 000 ×, afin d'étudier la diffusion latérale de la D-E-G-F-P ER dans le réticulum endoplasmique lisse organisé. Sept cellules transfectées de manière transitoire provenant de trois lamelles ont été analysées par FRAP, comme décrit dans cette vidéo ; comme le montre cette séquence en accéléré, deux structures OSER ont été soumises à un blanchiment et la récupération de fluorescence a été enregistrée au fil du temps. Une récupération claire de la fluorescence a été détectée une minute après le blanchiment, suivie d'une augmentation supplémentaire du signal quatre minutes plus tard, afin de déterminer le temps de demi-récupération et de quantifier la fraction mobile de la D-E-G-F-P-E-R.Les images capturées ont été analysées comme décrit dans cette vidéo, comme on peut le voir ici. L'intensité fluorescente de la zone photodétruite a augmenté au fil du temps, démontrant que la protéine fluorescente est très mobile au sein des agrégats. Pour étudier la continuité entre différents sous-domaines du réticulum endoplasmique, des expériences de basculement (flip) ont été réalisées, telles qu'illustrées dans cette séquence en accéléré.Le photoblanchiment continu d’un OSER indiqué ici par la flèche jaune entraîne une diminution progressive de la fluorescence dans le reste du RE et dans d’autres structures OSER au sein de la même cellule. La flèche rouge indique une portion d’une cellule non photoblanchie dans laquelle le signal fluorescent reste constant au cours du temps. L’analyse quantitative de ces données a révélé un vidage progressif et rapide du réticulum endoplasmique réticulé, démontrant ainsi que les agrégats sont physiquement connectés au reste du RE. Afin d’examiner l’architecture fine de ces agrégats, des cellules exprimant des niveaux élevés de D-E-G-F-P RE ont été observées à l’aide d’un microscope électronique en transmission.Ce micrographie montre une vue à faible grossissement du cytoplasme cellulaire contenant un agrégat de membranes. Cet agrégat est constitué d'une pile de cyi et de membranes sinusoïdales ondulées. Comme on peut le voir ici.Les mitochondries peuvent être observées regroupées autour des structures OSER, tandis que les ribosomes, indiqués par les flèches, se trouvent uniquement sur les membranes du cyi le plus externe. Notez que l'espace épais de 11 nanomètres, dense aux électrons, situé entre les membranes, est continu avec le cytoplasme. Un OS ER peut être formé par un réticulum endoplasmique lamellaire, constitué d'empilements de cyi du réticulum endoplasmique aplatis, qui peuvent apparaître continus ou fragmentés sur des coupes minces ; des vésicules, issues du cyi le plus externe de l'empilement, peuvent parfois être observées, comme illustré ici.Pris ensemble, ces données démontrent que les agrégats fluorescents observés dans les cellules en culture transfectées avec le D-E-G-F-P du RE représentent des régions lisses et aplaties du réticulum endoplasmique qui s'organisent spatialement en géométries tridimensionnelles bien définies. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'acquérir toutes les images sans pixels saturés, car cela pourrait modifier la récupération de la fluorescence et, par conséquent, l'analyse de la mobilité des protéines. Veillez toujours à normaliser le signal fluorescent dans la zone de photoblanchiment par rapport à la fluorescence totale de la même cellule afin de prendre en compte les variations d'intensité dues au photoblanchiment pendant l'acquisition des images ou à de légers changements du plan de mise au point.

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser réticulum endoplasmique associés ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères. Cette technique implique l'perméabilisation sélective de la membrane plasmique avec de la digitonine à supprimer les contenus cytoplasmiques suivie par...

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

endocytose médiée par la clathrine, un processus rapide et hautement dynamique internalise de nombreuses protéines, y compris les récepteurs de signalisation. Le protocole décrit ici visualise directement la cinétique des événements endocytaires individuels. Ceci est essentiel pour comprendre comment les membres centraux de la machinerie endocytaire se coordonnent les uns avec les autres, et comment la cargaison de protéines influence ce processus.

Visualisation endocytose clathrine de G récepteurs couplés aux protéines à un seul événement résolution par microscopie TIRF

Ici, nous décrivons une procédure pour visualiser et de quantifier avec une grande sensibilité les interactions endogènes entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans les cellules fixes. Le protocole optimisé comprend un essai de ligature de proximité in situ dans le ciblage de l'inositol 1,4,5-triphosphate récepteur / protéine régulée par le glucose 75 / D complexe canal anionique / cyclophiline dépendant de la tension à l'interface de la membrane associée à la mitochondrie.

Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par<em&gt; In Situ</em&gt; Proximité Ligation Assay dans des cellules fixes

Etiquetage du domaine extracellulaire d'une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l'expression et le trafic à déterminer. les protéines d'imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

Nous présentons un protocole pour étudier la distribution des mitochondries et du réticulum endoplasmique dans les cellules entières après modification génétique utilisant la lumière corrélative et la microscopie électronique de volume comprenant la peroxidase d'ascorbate 2 et la coloration de peroxidase de raifort, sectionnement en série des cellules avec et sans le gène cible dans la même section, et imagerie en série par microscopie électronique.

Imagerie des mitochondries et du réticulum endoplasmique par microscopie corrélative de lumière et d'électron de volume

Ce protocole décrit la méthode cryoAPEX, dans laquelle une protéine de membrane APEX2-étiquetée peut être localisée par microscopie électronique de transmission dans l’ultrastructure optimale-préservée de cellules.

Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

Un protocole simple et complet pour acquérir des détails tridimensionnels des sites de contact membranaire entre les organites dans les hépatocytes du foie ou les cellules d’autres tissus.

Caractérisation tridimensionnelle des sites de contact interorganelles dans les hépatocytes à l’aide de la microscopie électronique à section série

Le besoin de nouvelles approches pour étudier les sites de contact membranaire (MCS) s’est accru en raison de l’intérêt croissant pour l’étude de ces structures cellulaires et de leurs composants. Nous présentons ici un protocole qui intègre les technologies de microscopie précédemment disponibles pour identifier et quantifier les complexes protéiques intra-organites et inter-organites qui résident dans les MCS.

Visualisation et quantification des interactions endogènes intra-organites protéiques au niveau des sites de contact ER-mitochondries par des tests de ligature de proximité

La tomographie cryo-STEM permet de visualiser les organites de cellules intactes sans enrobage, sectionnement ou autres préparations invasives. La résolution 3D obtenue est actuellement de l’ordre de quelques nanomètres, avec un champ de vision de plusieurs micromètres et une épaisseur accessible de l’ordre de 1 μm.

Visualisation d’organites in situ par tomographie cryo-STEM

Déterminer le nombre de cellules en culture est importante dans la normalisation des conditions de culture et de réaliser des expériences de quantification précise. Dans cette vidéo, nous démontrons comment les cellules sont comptées en utilisant un hématimètre.

Comptage et détermination de la viabilité des cellules cultivées

Apprenez à visualiser les sous-domaines du réticulum endoplasmique dans les cellules cultivées par imagerie confocale et microscopie électronique. Cette méthode révèle la mobilité des protéines fluorescentes et leur impact sur l'architecture cellulaire.

Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

Explorer plus de vidéos