Nucléofection de rongeurs Neuroblastes à étudier neuroblaste migrations In vitro

la migration des neuroblastes est une étape cruciale dans la neurogenèse postnatale. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour étudier le rôle des régulateurs candidats de la migration des neuroblastes en utilisant / petit ARN en épingle à cheveux d'ADN (shRNA) nucléofection et un test de migration 3D avec neuroblastes isolés du rongeur postnatale courant de migration rostrale.

L’objectif global de cette procédure est de transfecter le neuroblaste postnatal primaire d’un rongeur afin d’examiner l’effet des protéines cibles sur leur migration. Ceci est accompli en disséquant d’abord le neuroblaste du flux migratoire rostral des rongeurs. La deuxième étape consiste à les dissocier et à les transfecter par affection nuculaire soit avec de l’ADN, soit avec S-H-R-N-A.

Ensuite, les neuroblastes sont réagrégés dans des gouttes suspendues, puis cultivés en suspension pendant un temps approprié. La dernière étape consiste à intégrer les grappes de neuroblastes réagrégées dans une matrice tridimensionnelle et à les laisser migrer. Enfin, la microscopie d’imagerie par immunofluorescence ou time-lapse est utilisée pour analyser la migration des neuroblastes.

Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la neurogenèse, telle que le contrôle de la migration des neuroblastes dérivés des cellules souches dans le cerveau postnatal. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement facile et rapide par rapport à l’utilisation de vecteurs viraux, qui peut être difficile et prendre du temps. Après avoir sacrifié une portée de rat P six à P sept, faites une incision postérieure dans la peau le long de la suture sagittale moyenne du nez au cervelet avec une lame de scalpel sur chaque rat.

Ensuite, décollez la peau. Répétez la même incision le long du crâne. Ensuite, retirez délicatement les volets crâniens à l’aide d’une pince et retirez soigneusement le cerveau ainsi que les bulbes olfactifs à l’aide d’une spatule.

Après cela, coupez le tiers le plus choyé du cerveau et jetez-le. Par la suite, coupez le tissu cérébral en tranches coronales de 1,4 millimètre d’épaisseur à l’aide d’un hachoir à tissus. Transférez les tranches dans un plat contenant un milieu de dissection froid.

Ensuite, observez les coupes au microscope de dissection. Séparez-les soigneusement à l’aide d’une aiguille. Le flux migratoire rostral apparaît comme une zone translucide triangulaire au centre des sections OB et comme une petite zone circulaire.

Dans d’autres tranches de cerveau de caroline, coupez le RMS de chaque tranche avec un couteau microchirurgical en prenant soin d’éviter d’inclure les tissus environnants. Ensuite, collectez les fragments RMS à l’aide d’une pipette en plastique et placez-les dans un petit plat contenant un milieu de dissection froid sur de la glace. Ensuite, tournez doucement le plat pour rassembler les fragments RMS au centre du plat.

Prélevez les fragments à l’aide d’une pipette en plastique et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Laissez les fragments se déposer au fond du tube. Remplacez le milieu de dissection par deux millilitres de milieu de dissociation T tri.

Évaluez les fragments RMS en pipetant doucement la suspension de fragments de haut en bas environ 10 fois à l’aide d’une pipette P 1000. Laissez le tube avec les fragments de tissu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Ensuite, pipetez à nouveau la solution 10 fois et assurez-vous que les fragments se sont dissociés.

Ensuite, inactivez la trypsine en ajoutant cinq millilitres de DMEM pré-vermifugé plus 10 % FCS et centrifugez la suspension cellulaire à 433 fois G pendant cinq minutes. Retirez l’excès de milieu et réusez-le. Mettez en suspension la pastille cellulaire en la pipetant doucement dans un millilitre de DMEM préchauffé plus 10 % de FCS, puis ajoutez quatre autres millilitres du même milieu.

Effectuez ensuite un comptage cellulaire. Un minimum de 2,5 fois 10 à la sixième cellule est nécessaire pour chaque affection nucléotique jusqu’à ce que des résultats optimaux soient obtenus. En utilisant trois à quatre fois 10 à six cellules par affection du nucule.

Centrifugez la suspension cellulaire à 433 fois G pendant cinq minutes. Après cela, retirez autant de milieu que possible dans cette procédure. Immédiatement Resus, suspendez la pastille cellulaire dans la solution d’affection du noyau de neurone de rat préalablement incubée.

À température ambiante, transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque tube EOR contenant SI R-N-A-D-N-A. Mélangez ensuite délicatement en pipetant deux à trois fois avec une pipette P 200. Ensuite, ajoutez l’échantillon au fond de l’affection du nucule en prenant soin d’éviter de générer des bulles.

Pour l’affection des nucles, utilisez le programme G dash 0 1 3 pour les cellules de rat ou O dash 0 0 5 pour les cellules de souris. Après cela, ajoutez rapidement un millilitre de DMEM d’avant-guerre plus 10 % FCS à l’échantillon affecté par le nucle. Transférez l’échantillon dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de DMEM d’avant-guerre plus 10 % de FCS à l’aide de la pipette en plastique fournie par le kit d’affection des nucles.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 433 fois G pendant cinq minutes. Retirez soigneusement tout excès de fluide et remettez la pastille en suspension dans 25 à 30 microlitres de DMEM d’avant-guerre plus 10 % FCS à l’aide d’une pipette P 20. N’utilisez pas plus de 30 microlitres de fluide.

Ensuite, pipetez la suspension sous forme de goutte sur la face intérieure d’un couvercle de plat P 35. Retournez ensuite le couvercle sur le plat P 35 contenant deux millilitres de fluide complet. Laissez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins cinq heures.

Après cinq heures, transférez les gouttes suspendues du couvercle dans le milieu complet du plat. À l’aide d’une pipette P 1000 avec une pointe coupée. Ensuite, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour les infections nucléaires à ADN NU, ou 48 heures pour les affections du nucle SI A HRA.

Préparez maintenant 25 millilitres de milieu complet et pré-équilibrez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant quelques heures. Pendant ce temps, sortez les aliquotes congelées de la matrice de la membrane basale du congélateur à moins 80 degrés Celsius et décongelez-les sur de la glace dans la chambre froide. Pour chaque affection du nucule, préparez une boîte de six centimètres contenant jusqu’à huit lamelles stériles de 13 millimètres.

Placez la vaisselle sur une glacière recouverte d’un film alimentaire. Pour maintenir l’humidité, placez une bande de tissu humide à l’intérieur d’une parabole de 15 centimètres qui sera utilisée pour contenir jusqu’à trois paraboles de six centimètres contenant des oblasts incrustés dans le genou. Ensuite, ajoutez le milieu complet à la matrice de haw dans un rapport de un à trois, transférez les grappes de cellules réagrégées dans un tube de 15 millilitres et centrifugez-le 433 fois G pendant cinq minutes.

Après cela, retirez l’excès de fluide et remettez la palette en suspension dans 10 microlitres de milieu complet. Placez ensuite deux microlitres de suspension d’agrégats cellulaires sur chaque lamelle stérile. Ajoutez 18 microlitres de mélange complet de matrice et utilisez la pointe de la pipette pour étaler la matrice sur tout le couvercle.

Glissez immédiatement après avoir placé le plat de six centimètres contenant les lamelles dans le plat de 15 centimètres. Transférez le plat dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 15 à 20 minutes. Une fois la matrice solidifiée, ajoutez doucement cinq millilitres de milieu complet dans chaque boîte de six centimètres et enfoncez toutes les lamelles flottantes avec la pointe de la pipette, puis incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de carbogène pour permettre au neuroblaste de migrer hors des agrégats cellulaires.

Dans cette figure, les cellules RMS isolées du rat se sont révélées immunopositives pour les marqueurs neuroblastiques migrateurs DCX et la tubuline bêta-trois. Et cette figure montre que les marqueurs neuroblastiques migrateurs DCX et PSA NCA sont exprimés dans les cellules qui migrent hors de la souris. RMS Explan pour souris Neuroblast Nu affection nucléaire, souris dissociée RMS Neuroblast ont été affectés par le nucle avec GFP réagrégé intégré dans une matrice tridimensionnelle et laissé migrer pendant six heures.

Les neuroblastes migrant hors d’un groupe de cellules réagrégées présentent une efficacité de transfection élevée. Ici, les neuroblastes de rat ont été affectés par deux plasmides différents codant pour la GFP réagrégée incorporée dans la matrice et laissée migrer pendant 24 heures. Les cellules ont ensuite été fixées et immunomarquées pour la GFP et la tubuline bêta-trois pour mesurer la distance de migration.

Le cluster de cellules agrégé est divisé en six secteurs égaux et la distance entre le bord du cluster et la cellule migrée la plus éloignée est mesurée pour chaque secteur. Cette figure montre la quantification de la distance relative migrée par les cellules NUCLE positives à la GFP et le contrôle des cellules non nucléiles négatives à la GFP pour surveiller la migration des neuroblastes. Après S-H-R-N-A, les neuroblastes de rat ont été affectés par un vecteur témoin S-H-R-N-A ou le même vecteur contenant une cible HRNA et les cellules protéiques de regroupement d’actine ont été réagrégées pendant 48 heures intégrées dans la matrice et laissées migrer pendant 24 heures.

Des agrégats ont ensuite été fixés et immuno-colorés pour la GFP et la tubuline bêta-trois. La déplétion efficace de l’attache peut être détectée 50 heures après l’affection des noyaux S-H-R-N-A par Western Blood Analysis et Acton est montré ici comme un contrôle de charge. Voici l’analyse quantitative de la distance de migration relative montrant que la déplétion accélérée altère significativement la migration des neuroblastes.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’électroporation postnatale peuvent être réalisées pour valider in vivo les résultats obtenus avec le test de migration NU Nuclear Affection.