Nucléofection de rongeurs Neuroblastes à étudier neuroblaste migrations

L'objectif général de cette procédure est de transfecter des neuroblastes primaires postnataux de rongeur afin d'examiner l'effet de protéines cibles sur leur migration. Cela est réalisé en dissociant d'abord les neuroblastes du flux migratoire rostral du cerveau du rongeur. La deuxième étape consiste à les dissocier puis à les transfecter par nucléofection avec de l'ADN ou de l'ARNh.

Ensuite, les neuroblastes sont regroupés à nouveau en gouttes suspendues, puis cultivés en suspension pendant une durée appropriée. La dernière étape consiste à inclure les agrégats de neuroblastes dans une matrice tridimensionnelle et à les laisser migrer. Enfin, une microscopie par immunofluorescence ou par acquisition d'images en temps réel est utilisée pour analyser la migration des neuroblastes.

Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la neurogenèse, comme le contrôle de la migration des neuroblastes dérivés de cellules souches dans le cerveau postnatal. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est relativement simple et rapide par rapport à l'utilisation de vecteurs viraux, qui peut s'avérer difficile et longue. Après avoir sacrifié une portée de rats P6 à P7, effectuez une incision postérieure dans la peau le long de la suture sagittale médiane, du nez jusqu'au cervelet, à l'aide d'une lame de scalpel sur chaque rat.

Ensuite, retirez la peau. Répétez la même incision le long du crâne. Puis retirez délicatement les lamelles crâniennes à l’aide d’une pince et extrayez soigneusement le cerveau avec les bulbes olfactifs à l’aide d’une spatule.

Ensuite, découpez le tiers le plus caudal du cerveau et jetez-le. Puis, hachez le tissu cérébral en tranches coronales de 1,4 millimètre d'épaisseur à l'aide d'un hachoir à tissus. Transférez les tranches dans une boîte contenant un milieu de dissection froid.

Ensuite, observer les tranches au microscope stéréoscopique. Les séparer soigneusement à l’aide d’une aiguille. Le courant de migration rostral apparaît comme une zone translucide triangulaire au centre des sections du bulbe olfactif et comme une petite zone circulaire.

Dans les tranches de cerveau plus fragiles, découper la SRM à partir de chaque tranche à l’aide d’un couteau microchirurgical en prenant soin d’éviter d’inclure les tissus environnants. Ensuite, recueillir les fragments de SRM à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et les placer dans une petite boîte contenant du milieu de dissection froid sur de la glace. Puis faire tourner doucement la boîte afin de regrouper les fragments de SRM au centre du récipient.

Recueillir les fragments à l’aide d’une pipette en plastique et les transférer dans un tube de 15 millilitres. Laisser les fragments se déposer au fond du tube. Remplacer le milieu de dissection par deux millilitres de milieu de dissociation T tri.

Évaluez les fragments de RMS en pipetant doucement la suspension de fragments de haut en bas environ 10 fois à l’aide d’une pipette P1000 par la suite. Laissez le tube contenant les fragments de tissu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Ensuite, pipetez à nouveau la solution 10 fois et assurez-vous que les fragments se sont dissociés.

Ensuite, inactiver la trypsine en ajoutant cinq millilitres de DMEM préchauffé contenant 10 % de FCS et centrifuger la suspension cellulaire à 433 × g pendant cinq minutes. Éliminer le milieu excédentaire et resuspendre. Suspendre le culot cellulaire en pipetant doucement dans un millilitre de DMEM préchauffé contenant 10 % de FCS, puis ajouter quatre millilitres supplémentaires du même milieu.

Effectuez ensuite un décompte cellulaire. Un minimum de 2,5 × 10⁶ cellules est requis pour chaque nucléofection, tandis que des résultats optimaux sont obtenus en utilisant de 3 à 4 × 10⁶ cellules par nucléofection.

Centrifuger la suspension cellulaire à 433 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, éliminer autant de milieu que possible lors de cette procédure. Resuspendre immédiatement le culot cellulaire dans la solution de nucléofection pour neurones de rat préalablement incubée.

À température ambiante, transférez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque tube EOR contenant SI R-N-A-D-N-A. Mélangez ensuite délicatement deux à trois fois à l’aide d’une pipette P 200. Ajoutez ensuite l’échantillon au fond du filtre d’affection nucléique en prenant soin d’éviter la formation de bulles.

Pour la nucléofection, utilisez le programme G tiret 0 1 3 pour les cellules de rat ou O tiret 0 0 5 pour les cellules de souris. Ensuite, ajoutez rapidement un millilitre de DMEM préchauffé contenant 10 % de FCS à l'échantillon nucléofecté. Transférez l'échantillon dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de DMEM préchauffé avec 10 % de FCS à l’aide de la pipette en plastique fournie avec le kit de nucléofection.

Ensuite, centrifuger l'échantillon à 433 ×g pendant cinq minutes. Retirer soigneusement tout milieu excédentaire et resuspendre le culot dans 25 à 30 microlitres de DMEM préchauffé contenant 10 % de FCS à l’aide d’une pipette P20. N’utiliser pas plus de 30 microlitres de milieu.

Ensuite, prélevez la suspension à l’aide d’une pipette et déposez-la sous forme de goutte sur la face interne du couvercle d’une boîte P 35. Puis, retournez le couvercle au-dessus de la boîte P 35 contenant deux millilitres de milieu complet. Laissez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins cinq heures.

Après cinq heures, transférez les gouttes suspendues du couvercle dans le milieu complet contenu dans la boîte. Utilisez une pipette P 1000 munie d'une pointe coupée. Incubez ensuite les échantillons à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour les infections nucléaires d'ADN NU, ou 48 heures pour les affections nucléaires de SI A HRA.

Préparez maintenant 25 millilitres de milieu complet et pré-équilibrez-le à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant plusieurs heures. Entre-temps, sortez les aliquotes congelées de la matrice de la membrane basale du congélateur à moins 80 degrés Celsius et faites-les décongeler sur de la glace dans la chambre froide. Pour chaque nucléofection, préparez une boîte de six centimètres contenant jusqu'à huit lamelles stériles de 13 millimètres.

Placer les boîtes sur une glacière recouverte de film alimentaire. Pour maintenir l'humidité, placer une bande de papier absorbant humide à l'intérieur d'une boîte de 15 centimètres qui servira à contenir jusqu'à trois boîtes de six centimètres contenant des blastocystes intégrés au genou. Ensuite, ajouter le milieu complet à la matrice de haw dans un rapport de un à trois, transférer les agrégats cellulaires reconstitués dans un tube de 15 millilitres et centrifuger à 433 ×g pendant cinq minutes.

Ensuite, retirez le milieu excédentaire et resuspendez le culot dans 10 microlitres de milieu complet. Placez alors deux microlitres de suspension d'agrégats cellulaires sur chaque lame stérile. Ajoutez 18 microlitres de mélange de milieu complet avec matrice et utilisez la pointe de pipette pour étaler la matrice sur toute la surface de la lame.

Faire glisser immédiatement après avoir placé la boîte de six centimètres contenant les lamelles dans la boîte de 15 centimètres. Transférer la boîte dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 15 à 20 minutes. Une fois la matrice solidifiée, ajouter délicatement cinq millilitres de milieu complet dans chaque boîte de six centimètres et enfoncer avec la pointe de la pipette les lamelles flottantes, puis incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de carbogène pour permettre aux neuroblastes de migrer hors des agrégats cellulaires.

Dans cette figure, les cellules de la SRM isolées du rat apparaissent immunopositives pour les marqueurs de neuroblastes migrateurs DCX et bêta-tubuline III. Cette figure montre également que les marqueurs de neuroblastes migrateurs DCX et PSA-NCAM sont exprimés dans les cellules migrent hors de la SRM de souris. Pour étudier l'affection nucléaire des neuroblastes murins, des neuroblastes dissociés de la SRM de souris ont été nucléofectés avec un gène codant pour la GFP, réagrégés, inclus dans une matrice tridimensionnelle et laissés migrer pendant six heures.

Le neuroblaste migrant sortant d'un agrégat cellulaire réagrégé présente une forte efficacité de transfection. Ici, des neuroblastes de rat ont été nucléofectés avec deux plasmides différents codant pour la GFP, réagrégés en matrice et laissés migrer pendant 24 heures. Les cellules ont ensuite été fixées et immunomarquées pour la GFP et la tubuline bêta trois afin de mesurer la distance de migration.

L'amas cellulaire agrégé est divisé en six secteurs égaux, et la distance entre le bord de l'amas et la cellule ayant migré le plus loin est mesurée pour chaque secteur. Cette figure montre la quantification de la distance relative parcourue par les cellules affectées NUCLE positives pour la GFP et par les cellules contrôles non affectées NUCLE négatives pour la GFP afin de suivre la migration des neuroblastes. Après affection des neuroblastes de rat NUCLE par ARNsh ciblant NUCLE, les cellules ont été affectées avec un vecteur ARNsh contrôle ou le même vecteur contenant un ARNsh ciblant une protéine de fixation et d'assemblage de l'actine, puis re-réagrégées pendant 48 heures, incluses dans une matrice et laissées migrer pendant 24 heures.

Les agrégats ont ensuite été fixés et soumis à une coloration immunohistochimique pour la GFP et la tubuline bêta trois. Une déplétion efficace de fasten peut être détectée 50 heures après la transfection des noyaux par ARNh-S à l’aide d’une analyse par immunobuvardage Western, et l’actine est présentée ici comme témoin de chargement. Voici l’analyse quantitative de la distance de migration relative, montrant que la déplétion de fasten altère significativement la migration des neuroblastes.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'électroporation postnatale peuvent être réalisées afin de valider in vivo les résultats obtenus avec le test de migration NU Nuclear Affection.